ÖZET Doktora Tezi
ÇELTİK TARLALARINDAN İZOLE EDİLEN SİYANOBAKTERİLERİN NİTROJENAZ AKTİVİTESİNE ÇEVRESEL FAKTÖRLERİN ETKİSİ
Gülten ÖKMEN (Kurucuoğlu) Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı
Danışman: Prof. Dr. Gönül DÖNMEZ
Örnekler, Çorum-Osmancık bölgesindeki çeltik alanlarından toplandı. Azot fikse eden siyanobakterilerin izolasyonunda, azot içermeyen BG-II besiyeri kullanıldı. Toplam 26 izolatın 13 adeti Lyngbya, 10 adeti Anabaena, 1 adeti Oscillatoria, 1 adeti Synechococcus ve 1 adeti Synechocystis cinsine ait bulundu.
Cins düzeyinde tanımlanan siyanobakterilerin nitrojenaz aktiviteleri üzerine değişik fiziksel ve kimyasal ajanların etkisinin tanımlanmasında asetilen redüksiyon tekniğinden yararlanıldı.
Optimum pH değerlerinde nitrojenaz aktivitesi için ideal inkübasyon süresi, tüm cinsler için 45 gün olarak belirlendi.Yine tüm cinslerde 600 lüks ışık şiddeti en yüksek nitrojenaz aktivitesine yol açarken, 900 lüks ışık şiddetinin, söz konusu aktiviteyi 300 lüks ışık şiddetinden daha fazla baskıladığı görüldü. Tuz için ( 100Mm NaCl ) Anabaena ( 0.001 etilen µl / mg.h ) ve Nodularia ( 0.005 etilen µl / mg.h ), şeker için ise ( 60 mM Sakkaroz ) Nostoc ( 0.08 etilen µl / mg.h ) en yüksek tolerans içeren cinsler olarak tespit edildi. Diğer yandan; 20 ppm Fe+2 konsantrasyonunda Anabaena cinsinde nitrojenaz aktivitesi 0.006 etilen µl / mg.h, 20 ppm Mn+2 konsantrasyonunda Nodularia cinsinde nitrojenaz aktivitesi 0.1 etilen µl / mg.h ve 5 ppmZn+2 konsantrasyonunda Nostoc cinsinde nitrojenaz aktivitesi 0.96 etilen µl / mg.h düzeylerinde tanımlandı. Nodularia en yüksek nitrojenaz aktivitesini ( 0.006 etilen µl / mg.h ) 10 mM nitrat konsantrasyonunda gösterdi. 25 mM fosfat konsantrasyonunda ise Nodularia en yüksek nitrojenaz aktivitesini ( 0.006 etilen µl / mg.h ) içerdi.Herbisitlere karşı en yüksek tolerans, bensülfüran için ( 50 µg/ ml ) Nodularia’da ( 0.06 etilen µl / mg.h ) ve molinat için de ( 100 µg/
ml ) Nostoc’ta ( 6 etilen µl / mg.h ) saptandı.
2005, 69 sayfa
ANAHTAR KELİMELER : Siyanobakteri, nitrojenaz aktivitesi, izolasyon, çevresel faktörler
ABSTRACT Ph. D. Thesis
INFLUENCE OF ENVIRONMENTAL FACTORS ON NITROGENASE ACTIVITY OF CYANOBACTERIA ISOLATED FROM RICE FIELDS
Gülten ÖKMEN ( Kurucuoğlu ) Ankara University
Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Biology
Supervisor: Prof. Dr. Gönül DÖNMEZ
Samples were collected from paddy fields in Çorum- Osmancık area. Nitrogen- free BG-II medium was used for the isolation of nitrogen fixating cyanobacteria. Among 26 isolates;
13,10,1,1,and 1 of the isolates were found to belong Lyngbya, Anabaena, Oscillatoria, Synechococcus and Synechocystis genus, respectively
Acetylene reduction technique was used to determine the effects of different physical and chemical agents on the nitrogenase activities of the cyanobacteria, which were identified at the genus level. Ideal incubation time at optimum pH levels was determined as 45 days for all genera.Moreover, in all genera while 600 lux light intensity was resulted in the highest nitrogenase activity, 900 lux light intensity was found to suppress the same activity more than 300 lux. The highest tolerances in the genera were established as Anabaena ( 0.001 ethylene µl / mg.h ) and Nodularia ( 0.005 ethylene µl / mg.h ) for salt ( 100mM NaCl ) and Nostoc for sugar ( 60mM saccharose; 0.08 ethylene µl / mg.h ). On the other hand, nitrogenase activities for the genera were characterized at following levels: at 20 ppm Fe+2 concentration in Anabaena genus as 0.006 ethylene µl / mg.h, at 20 ppm Mn+2 concentration in Nodularia genus as 0.1 ethylene µl / mg.h and at 5 ppm Zn+2 concentration Nostoc genus as 0.96 ethylene µl / mg.h. Nodularia showed the highest nitrogenase activity ( 0.006 ethylene µl / mg.h ) at 10 mM nitrate concentration. At 25 mM phosphate concentration, Nodularia showed the highest nitrogenase activity ( 0.006 ethylene µl / mg.h ). The highest tolerance for the herbicides was detected in Nodularia ( 0.06 ethylene µl / mg.h ) for bensulphurane ( 50 µg/ml) and in Nostoc ( 6 ethylene µl / mg.h ) for molinate ( 100 µg/ml ).
2005, 69 page
Key Words : Cyanobacteria, nitrogenase activity, isolation, environmental factors
TEŞEKKÜR
Bana bu konuda çalışma imkanı veren ve çalışmalarım süresince desteğini esirgemeyen danışman hocam Sayın Prof. Dr. Gönül DÖNMEZ’e, nitrojenaz aktivitesinin belirlenmesi aşamasında her türlü kimyasal gereksinimi sağlayan A.Ü. Gıda Mühendisliği Bölüm Başkanlığına ve bünyesindeki tüm akademik ile teknik personeline, çeltik alanlarının belirlenmesinde ve teknik bilgileri ile yönlendirmelerinden dolayı Sayın Prof. Dr. Süleyman TABAN’a, tez izleme süresince teknik bilgilerinden ve yönlendirmelerinden yararlandığım Sayın Prof. Dr. Olcay OBALI’ ya, nitrojenaz aktivitesi sıraında her türlü desteği gördüğüm Arş.Gör. Safiye KARAAĞAÇ’a, ayrıca örneklerin alınması sırasında her türlü yardımlarını gördüğüm Sayın Dr. Hesna ÖZCAN’a, istatistik analizlerin yapılmasında yardımlarını esirgemeyen Sayın Arş. Gör. İbrahim ERDEMİR’e, herbisitlerin temininde desteğini esirgemeyen çeltik arazileri sahibi Recep GELGEL’e, tez yazımı sırasında yardımlarını ve tez süresi boyuncu manevi desteğini esirgemeyen eşim Sayın Dr. A.Şadan ÖKMEN’e i ve aileme en içten teşekkürlerimi sunarım.
Gülten ÖKMEN Ankara, Şubat 2005
İÇİNDEKİLER
ÖZET………...……..i
ABSTRACT ...ii
TEŞEKKÜR ………...……….…iii
ŞEKİLLER DİZİNİ………...vii
ÇİZELGELER DİZİNİ ………..…………...viii
1.GİRİŞ...1
2. KAYNAK ÖZETLERİ……….………...………...…….2
2.1. Doğada Azot ve Azot Çevrimi………..……….2
2.2. Azot Fikse Eden Mikroorganizmalar………….………....3
2.2.1. Azot fikse eden bakteriler………...…………..………...………....3
2.2.2. Azot fikse eden siyanobakteriler…...………..……...6
2.2.2. Tarımda mikroalglerin kullanımı………...………..7
2.3. Azot Fiksasyonu………..………...8
2.3.1. Nitrojenaz enziminin yapısal özellikleri………...…………...8
2.3.1.1. Dinitrojenaz ( MoFe proteini ) ………...…...……...9
2.3.1.2. Dinitrojenaz redüktaz ( Fe proteini ) ………..……...11
2.3.1.3. Alternatif nitrojenazlar………..…………..…...11
2.3.2. Azot fiksasyonunun mekanizması ………...……….11
2.3.2.1. Azot fiksasyonunun düzenlenmesi ve genetik doğası..………..………11
2.3.2.2. Azot fiksasyonunda elektron akışı ………..…………..14
2.4. Çeltik Bitkisi ve Zararlı Otlar ile Mücadele………..……...17
2.4.1. Çeltik bitkisi………..………17
2.4.2. Çeltik ekim alanlarında zararlı otlar ile mücadele………..………...………18
2.4.3. Çeltik ekim alanının fiziksel ve kimyasal özellikleri………19
3. MATERYAL ve YÖNTEM……….………….21
3.1. Materyal………...……….21
3.1.1. Organizma………..………...21
3.1.2. Araç, gereç ve kimyasal maddeler ………...……….21
3.2. Yöntem………..…………...21
3.2.1. İzolasyon ve identifikasyon ………..…………...……….21
3.2.2. Kültürlerin optimum pH isteklerinin belirlenmesi ………...…...22
3.2.3. Tuz stresinin nitrojenaz aktivitisine etkisi………...……..23
3.2.4. Sakkaroz stresinin nitrojenaz aktivitisine etkisi ………...………23
3.2.5. Ağır metal stresinin nitrojenaz aktivitisine etkisi ………...……..24
3.2.6. Nitratın nitrojenaz aktivitisine etkisi………...……….…...24
3.2.7. Fosfatın nitrojenaz aktivitisine etkisi………..………..…....24
3.2.8. Herbisit stresinin nitrojenaz aktivitisine etkisi ………...………..25
3.2.9. Işık şiddetinin nitrojenaz aktivitisine etkisi ………...…...25
3.2.10. Analiz Yöntemleri………..………...………..25
4. ARAŞTIRMA BULGULARI ………..………27
4.1. Azot Fikse Eden Siyanobakterilerin İzolasyonu ve İdentifikasyonu………...…...27
4.2. Siyanobakterilerin Gelişimine pH’nın Etkisi………...………...29
4.3. Tuz Stresi Ortamında Geliştirilen Cinslerin Nitrojenaz Aktivitesi …..…………...34
4.4. Sakkaroz Stresi Ortamında Geliştirilen Cinslerin Nitrojenaz Aktivitesi ...…… …35
4.5. Metal Stresi Ortamında Geliştirilen Cinslerin Nitrojenaz Aktivitesi ……..………36
4.5.1. Demir konsantrasyonlarının nitrojenaz aktivitesine etkisi ……….…..36
4.5.2. Mangan konsantrasyonlarının nitrojenaz aktivitesine etkisi ………....37
4.5.3. Çinko konsantrasyonlarının nitrojenaz aktivitesine etkisi ………...….38
4.6. Nitrat konsantrasyonlarının nitrojenaz aktivitesine etkisi ………...39
4.7. Fosfat konsantrasyonlarının nitrojenaz aktivitesine etkisi ………...40
4.8. Herbisitlerin Nitrojenaz Aktivitesine Etkisi ………..………..…....41
4.8.1. Bensülfüron-metil konsantrasyonlarının nitrojenaz aktivitesine etkisi………...41
4.8.2. Molinate konsantrasyonlarının nitrojenaz aktivitesine etkisi …………...42
4.9. Işık Şiddetlerinin Nitrojenaz Aktivitesine Etkisi ………...…………..43
5. TARTIŞMA ve SONUÇ………...……….………45
KAYNAKLAR………...……….55
EKLER ………..……….65
EK 1.………...……….65
EK 2………...………..67
ÖZGEÇMİŞ ………...……….69
ŞEKİLLER DİZİNİ
Şekil 2.1. Azot çevrimi ………...………...………...3
Şekil 2.2. Dinitrojenaz proteinin tetramer yapısı ………...……...……9
Şekil 2.3. FeMo-kofaktörünün yapısı ………...………...…...10
Şekil 2.4. Dinitrojenaz redüktaz proteinin dimer yapısı ………...……...…...…10
Şekil 2.5. Nif regülonunun genetik yapısı …………...…………...………13
Şekil 2.6. Siyanobakterilerde nitrogenaz için ATP ve redüktant kaynakları …….…...15
Şekil 2.7. Heterosist ve vejetatif hücre arasındaki fotosentez ile azot fiksasyonu ilişkisi...17
Şekil 4.1. Anabaena sp. nin gelişimine pH’nın etkisi ………..………...30
Şekil 4.2. Nostoc sp. nin gelişimine pH’nın etkisi….……...………...…31
Şekil 4.3. Nodularia sp. nin gelişimine pH’nın etkisi....……….……..…………...…...33
ÇİZELGELER DİZİNİ
Çizelge 2.1. Azot fikse eden mikroorganizmalar………...…………...5 Çizelge 2.2. Azot fikse eden siyanobakteriler …………...………..…….6 Çizelge 2.3. Nitrojenazın katalizlediği reaksiyonlar …………..………...12 Çizelge 2.4. İç Anadolu Bölgesinde kullanılan herbisit grupları ve etken…
maddeleri………...……….………...……...18 Çizelge 2.5. Uygulama alanının fiziksel ve kimyasal özellikleri………19 Çizelge 2.6. İç Anadolu Bölgesinde kullanılan bazı herbisitlerin etki ettiği yabancı otlar, etki mekanizmaları ve uygulama basamakları………....……20 Çizelge 4.1. Azot fikse eden siyanobakterilerin yoğunlukları ve cinsleri ……..………28 Çizelge 4.2. İzole edilen siyanobakterilerin morfolojik özellikleri...………....29 Çizelge 4.3. Anabaena sp. nin farklı pH’lardaki kuru ağırlık ve
klorofil-a miktarları..………30 Çizelge 4.4. Nostoc sp. nin farklı pH’lardaki kuru ağırlık ve
klorofil-a miktarları ………32 Çizelge 4.5. Nodularia sp. nin farklı pH’lardaki kuru ağırlık ve
klorofil-a miktarları...………...33 Çizelge 4.6. İnkübasyon süresinin gelişime ve nitrojenaz
aktivitisine etkisi……….……...34 Çizelge 4.7. Tuz konsantrasyonlarının siyanobakterilerin gelişim ve nitrojenaz
aktivitisine etkisi ...……….35 Çizelge 4.8. Sakkaroz konsantrasyonlarının siyanobakterilerin gelişim ve
nitrojenaz aktivitisine etkisi...36 Çizelge 4.9. Demir konsantrasyonlarının siyanobakterilerin gelişim ve
nitrojenaz aktivitisine etkisi……….37 Çizelge 4.10. Mangan konsantrasyonlarının siyanobakterilerin gelişim ve
nitrojenaz aktivitisine etkisi………...38 Çizelge 4.11. Çinko konsantrasyonlarının siyanobakterilerin gelişim ve
nitrojenaz aktivitisine etkisi………...……..39 Çizelge 4.12. Nitrat konsantrasyonlarının siyanobakterilerin gelişim ve
nitrojenaz aktivitisine etkisi………...41
Çizelge 4.13. Fosfat konsantrasyonlarının siyanobakterilerin gelişim ve
nitrojenaaktivitisineetkisi …...41 Çizelge 4.14. Bensulfuron-metil konsantrasyonlarının siyanobakterilerin gelişim ve nitrojenaz aktivitesine etkisi .……….………..42 Çizelge 4.15. Molinate konsantrasyonlarının siyanobakterilerin gelişim ve
nitrojenaz aktivitesine etkisi ….………..……….43 Çizelge 4.16. Işık şiddetlerinin siyanobakterilerin gelişim ve
nitrojenaz aktivitisine etkisi ..………...…….44
ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
DOKTORA TEZİ
ÇELTİK TARLALARINDAN İZOLE EDİLEN SİYANOBAKTERİLERİN NİTROJENAZ AKTİVİTESİNE ÇEVRESEL FAKTÖRLERİN ETKİSİ
Gülten ÖKMEN ( KURUCUOĞLU )
BİYOLOJİ ANABİLİM DALI
ANKARA 2005
Her hakkı saklıdır
Prof. Dr. Gönül DÖNMEZ danışmanlığında, Gülten ÖKMEN( Kurucuoğlu ) tarafından hazırlanan bu çalışma 21 / 02 / 2005 tarihinde aşağıdaki jüri tarafından Biyoloji
Anabilim Dalı ‘nda Doktora tezi olarak kabul edilmiştir.
Başkan: Prof. Dr. Gönül DÖNMEZ
Üye : Prof .Dr. Süleyman TABAN
Üye : Prof. Dr. Olcay OBALI
Üye : Prof. Dr. Mustafa AKÇELİK
Üye : Prof. Dr. Belma ASLIM
Yukarıdaki sonucu onaylarım.
Prof. Dr. Metin OLGUN Enstitü Müdürü
1. GİRİŞ
Atmosferdeki serbest azotun, mikroorganizmalar vasıtasıyla amonyağa dönüşmesi
“azot fiksasyonu” olarak tanımlanmaktadır. Bu işlem, simbiyotik ve serbest yaşayan mikroorganizmalar vasıtasıyla gerçekleştirilmektedir.
Azot fiksasyonunun ışık, sıcaklık, nemlilik gibi çevresel faktörlerden etkilendiği bilin- mektedir. Bu nedenle çevresel faktörlere dirençli, azot fiksasyonu yeteneği fazla olan suşların izole edilmesi kaliteli gübre eldesinde önemli bir aşamadır. Biyogübre maliye- tinin, inorganik gübre maliyetinin dörtte biri kadar olması biyogübre kullanımını cazip hale getirmektedir.
Toprak ve sularda serbest yaşayan mikroorganizmalar tarafından fikse edilen azotun yılda yaklaşık 45-100 kg /hektar arasında değiştiği, sadece siyanobakterilerin fikse ettik- leri azot miktarının ise yılda 28 kg /hektar olduğu bilinmektedir. Bu da dikkat çekici bir unsurdur.
İklim şartları ülkemize benzeyen Asya ve Güney Avrupa ülkelerinde, siyanobakteriler biyogübre olarak kullanılmaktadır. Günümüzde Hindistan’da yaklaşık 2 milyon, Burma’da 40 bin, Çin ‘de 20 bin ve Amerika’da yaklaşık bin hektar tarım arazisinde siyanobakteriler biyogübre olarak kullanılmaktadır.Ülkemizde bu durum baklagil ekim alanlarında Rhizobium türlerinin kullanımı ile sınırlıdır.
Bu çalışma; çeltik tarımı yapılan bölgelerden izole edilen ve azot tespit eden siyanobakterilerin saflaştırılması, optimum gelişme koşulları belirlenmesi ve çevresel faktörlerin nitrojenaz aktivitesiüzerine etkisinin araştırılması amacı ile yapılmıştır.
2. KAYNAK ÖZETLERİ
2.1. Doğada Azot ve Azot Çevrimi
Atmosferin % 78 ‘inin elementel azot olduğu bilinmektedir. Azot, kantitatif olarak önemli bir biyoelementtir ve biyosferde moleküllerdeki bağlı azot, mikroorganizmalar ve bitkiler tarafından taşınmaktadır. Çok sayıda azot içeren bileşik farklı mikroorganizmalar tarafından azot kaynağı olarak kullanılmaktadır. Bunlar arasında nitrat ve amonyum gibi inorganik iyonlar, üre, aminoasitler ve bazı azot içeren bazlar gibi basit organik bileşikler sayılabilir. Buna ilaveten çoğu bakteri azot fikse etme yeteneğindedir
( Herrero et al. 2001, Manahan 1997, Albrecht 1998 ) .
Doğada azot döngüsü, nitrifikasyon, denitrifikasyon, amonifikasyon veya azot fiksasyonu şeklinde gerçekleşmektedir. Nitrifikasyon yapan bakteriler suda ve toprakta yaygın olarak bulunmaktadır. Organizmaların bir grubu (Nitrosomonas sp.) amonyağı nitrite oksitlerken, diğer kısmı ise (Nitrobacter sp.) nitriti nitrata oksitlemektedir (nitrifikasyon). Amonyak, organik azotlu bileşiklerinin parçalanması sırasında üretilmektedir (amonifikasyon). Oksijensiz koşullarda amonyak stabildir ancak toprakta amonyağın çoğu aerobik parçalanma ile uzaklaştırılır, bitkilerdeki aminoasitlere dönüştürülerek hızla döngüye katılmaktadırlar. NO3-, gaz formunda azotlu bileşiklerine dönüşümüne denitrifikasyon adı verilmektedir. En yaygın alternatif ē alıcılarından biri nitrattır ve N2O-, NO- ve N2 gibi azotun daha çok indirgenmiş formlarına dönüşebilmektedir. Gaz formunda olan bu ürünlerin çoğu kolaylıkla çevreden uzaklaşmaktadırlar. Denitrifikasyon yapan organizmaların bir çoğu fakültatif aerobtur ( Şekil 2.1. ) ( Madigan et al. 1997, Manahan 1997, Purves et al.1997 ).
Şekil 2.1.Azot Çevrimi ( Purves et al., 1997 ) 2.2. Azot Fikse Eden Mikroorganizmalar
2.2.1. Azot fikse eden bakteriler
Pek çok bakteri türünün azot fikse ettiği bilinmektedir. Bacillus subtilis ve Corynebacterium glutamicum bunlardan sadece iki tanesidir. Azot fikse eden bakteriler temelde serbest ve simbiyotik yaşayan olmak üzere iki grupta toplanmaktadır.
Serbest yaşayan bakterileri de oksijenin kullanılıp kullanılmayışına göre iki gruba ayırmak olasıdır. Bu tip mikroorganizmalar enerji kaynağı olarak farklı maddeleri kullanabilmektedirler. Enerji kaynağı olarak organik bileşikleri kullananlara kemoorganotroflar (Azotobacter sp.), inorganik bileşikleri kullananlara
kemolitotroflar ( Alcaligenes sp. ) ve ışığı kullananlar ise fototrof ( Anabaena sp. ) olarak adlandırılmaktadır. Serbest yaşayan fakat anaerobik şartlarda azot fikse etme yeteneğine sahip organizmalar da, enerji kaynağı olarak organik maddeleri (Clostridium sp. ), inorganik maddeleri ( Methanococcus sp. ) ve ışığı ( Rhodospirillum sp. ) kullanmaktadırlar ( Madigan et al.1997, Herrero et al. 2001).
İkinci grupta ise, simbiyotik olarak yaşayan ve legümenin bulunup bulunmayışına göre farklılık gösteren organizmalar bulunmaktadır. Legümenli bitki, kendine özgü bakterilerle kapalı bir birliktelik içinde yaşayan ve köklerinde “ nodül ” adı verilen yapıları oluşturan bitkilerdir. Bu bitki kökleri atmosferik azotu fikse ederek azotlu bileşiklere dönüştürmekte ve bunu da bitkinin gelişimi için kullanmaktadırlar.
Legümenli bitkilerle çoğunlukla birlik oluşturan organizmalar Rhizobium, Bradyrhizobium ve Azorhizobium türleridir. Nitrojenaz enzimi oksijene karşı çok hassas olduğundan kolayca inaktif olmaktadır. Legümenli bitkilerin nodülündeki oksijen seviyesi, oksijen bağlayan “leghemoglobin” proteini ile kontrol edilmektedir.
Bu protein bitki ve bakterinin etkileşimi sonucu sentezlenmektedir.
Bazı legümensiz angiyospermler ( Alnus sp. : Akçaağaç ), kök nodüllerinde bulunan aktinomisetlerin (Frankia sp.) faaliyeti sonucu azot fikse etmektedirler. Aktinomisetler filamentli, streptomiset-benzeri organizmalardır (Çizelge 2.1.). Frankia türlerinde, nitrojenaz enzimi hücre üzerinde kalın duvarlı terminal kesecikler (vesicle) içinde yerleşmiştir ve bu sayede oksijenin içeri difüzyonuna engel teşkil etmektedir ( Manahan 1997, Madigan et al.1997 ).
Çizelge 2.1.Azot fikse eden mikroorganizmalar
SERBEST YAŞAYAN AEROBLAR Kemoorganotroflar
( enerji kaynağı olarak organik maddeleri kullananlar )
Fototroflar ( enerji kaynağı olarak ışık enerjisini kullananlar)
Kemolitotroflar ( enerji kaynağı olarak inorganikmaddeleri kullananlar )
Azotobacter Klebsiella Beijerinckia Bacillus polymyxa Mycobacterium flavum Azospirillum lipoferum Citrobacter freundii
Acetobacter diazotrophicus Methylomonas
Methylococcus
Anabaena Nostoc
Aphanizomenon Gloeocapsa Synechococcus
Alcaligenes Thiobacillus
SERBEST YAŞAYAN ANAEROBLAR Kemoorganotroflar
( enerji kaynağı olarak organik maddeleri kullananlar )
Fototroflar
( enerji kaynağı olarak ışık enerjisini kullananlar )
Kemolitotroflar ( enerji kaynağı olarak inorganik maddeleri kullananlar )
Clostridium Desulfovibrio Desulfotomaculum Beggiatoa
Thiocapsa Chromatium Chlorobium Rhodospirillum Rhodopseudomonas Rhodomicrobium Rhodopila Heliobacterium Heliobacillus Heliophilum
Methanosarcina Methanococcus
SİMBİYOTİKLER Legümenli bitkiler
( köklerinde nodül oluşturanlar ) Legümensiz bitkiler ( köklerinde nodül oluşturmayanlar ) Soya fasulyesi, baklagiller gibi nodül
oluşturan bitkilerle birlik oluşturan
Rhizobium, Bradyrhizobium, Azorhizobium cinsleri
Alnus, Myrica, Ceanothus ,Comptonia, Casuocrina gibi nodül oluşturmayan bitkileri ile birlik oluşturan Frankia cinsine ait aktinomisetler
2.2.2. Azot fikse eden siyanobakteriler
Siyanobakterilerde ( Cyanophyta ) yaklaşık 70’den fazla türün azot fikse ettiği bilinmektedir. Azot fikse eden siyanobakteriler iki ana grupta toplanmaktadır ( Çizelge 2.2.) ( Burlage et al.1998, Madigan et al. 1997, Bergman et al.1997 ).
Bazı fotosentetik bakteriler anaerobik, heterosist içeren siyanobakteriler aerobik ve mikroaerobik, heterosistsiz filamentli siyanobakteriler mikroaerobik ( Bergman et al.1997 ), tek hücreli formlar ise mikroaerobik ve aerobik koşullarda azot fikse etmektedirler ( Herrero et al.2001, Clemencia et al.1986, Rippka 1971 ).
Çizelge 2.2.Azot fikse eden siyanobakteriler TEK HÜCRELİ FORMLAR
Aerobik olanlar Anaerobik olanlar Gloeocapsa
Cyanothece Synechococcus Synechocystis
Chroococcidiopsis Dermocarpa Myxosarcina Pleurocapsa Xenococcus FİLAMENTLİ FORMLAR
Heterosistliler Heterosistsizler Nostoc
Anabaena Aphanizomenon Nodularia Gleotrichia Calothrix Fischerella Nodularia Tolypothrix Cylindrospermum
Lyngbya Phormidium Plectonema Oscillatoria Trichodesmium Raphidiopsis Microcoleus
Cyanophyta, Yunanca da kyanos koyu mavi, phykos ise denizotu anlamına gelmektedir ( Tilden, 1968 ). Siyanobakteriler gram negatif, prokaryotik organizmalardır.
Sitoplazmik ve dış zar olmak üzere iki membran içermektedirler. Peptidoglikan tabaka genelde 1-10nm kalınlığındadır. Ancak, 200 nm kalınlığında olanlarda bulunmaktadır.
Bakteri hücreleri 1-100 µm büyüklüğünde olabilmektedirler. Çoğu siyanobakteriler fotoototrof olmakla birlikte bir kısmı da fotoheterotrof ve kemoheterotrof olabilmektedir. Nadiren anoksijenik fotosentez yapan formlarına rastlanmaktadır.
Siyanobakterilerin bir çoğu çevrelerindeki değişikliklere farklı morfolojik formlar geliştirerek uyum sağlamaktadırlar. Bunlardan en iyi bilineni azot fiksasyonu için özelleşmiş heterosistyapılarıdır ( Albrecht 1988, Adams 1997, Stanier 1988, Van Den Hoek et al.1995, Jensen 1993, Prescott 1968, Prescott 1982 ).
Siyanobakteriler geniş ekolojik dağılıma sahip önemli primer üretici organizmalardır.
Okyanus alanlarından, ılıman topraklara, tatlı su göllerine, hatta olağan dışı habitatlarda dahi ( kurak çöller,soğuk göller,sıcak kaynaklar) bulunabilmektedirler ( Herrero et al.
2001, Stewart 1973, Warr et al.1984, Mackay et al.1983 ).
2.2.3. Tarımda mikroalglerin kullanımı
Algalizasyon teknolojisinin bitkiye etkisi azot içeriği, tohum doluluğu ve organlarının sayısını etkilemektir ( Roger 1985 ). Bitkilerin biyoküyle veriminde ana unsur azot gereksinimidir.
Bitkinin bu ihtiyacı topraktan, yağmurdan, atmosferden ve biyolojik azot fiksasyonundan sağlanmaktadır ( Selwin et al.1992 ). Endüstriyel azot fiksasyonu her yıl yaklaşık 85 milyon ton olarak gerçekleşmektedir. Bu gereksinim çok fazla enerji girişine ihtiyaç duymaktadır. Ziraatte kullanılan azotun % 65’i biyolojik süreçlerde sağlanmaktadır ( Albrecht 1998 ). Irisarri et al. ( 2001 ) biyolojik azot fiksasyonunun her kültür döneminde çeltik ürününe ( 75kg N/ ha ) azot sağladığını bildirmiştir.
Mikroalgler toprak koşullandırıcısı ve biyogübre olarak tarımda uygulama alanı bulmaktadır. Biyogübreler, tropikal ve düz arazi pirinç üretiminde kullanılan azot tespit
eden siyanobakterilerdir ( Kannaiyan et al.1997, Niels et al.1984, Nirianne 1990, Sharma et al.1988 ). Siyanobakteriler ışığı kullanarak CO2 ve N2’yi fikse etmekte ve bu yolla bitki gelişimine katkıda bulunmaktadır (Selwin et al.1991a ). Bu etki, fotosentez yoluyla organik madde miktarının artmasını, toprak kitlelerinin stabilizasyonunu, bitki gelişim düzenleyicilerinin ve azot fikse etme yeteneğini kapsamaktadır ( Metting 1990, Pa and Watanabe1986, Boussiba 1991, Ghosh and Saha 1993 )
Dönmez vd ( 2001 ) Anabaena türlerinin yeşil gübre üretiminde kullanım potansiyeline sahip olduğunu saptamıştır. Selwin et al.( 1991a ) bildirdiğine göre, farklı siyanobakteri türleri gibberellin ( Gupta and Shukla 1969 ) ve oksin ( De Caire et al. 1979, Mikhailova et al. 1984 ) gibi bitkisel hormonları salıverdiği ve kültür filtratlarının tohum çimlenmesi ile çeltik fidelerinin gelişimini artırdığını sürmüştür ( Tambiev et al. 1981, Antarikanonda 1982 ). Vinod et al. ( 1999 ) uzun süreli inorganik gübre kullanımının toprak sağlığında bazı bozukluklar meydana getirdiğine, ayrıca Pillai et al.
( 1990 ) ise besinlerin organik kaynaklarının toprak sağlığı restorasyonunda önemli rol oynadığına işaret etmiştir.
2.3. Azot Fiksasyonu
2.3.1. Nitrojenaz enziminin yapısal özellikleri
Azot fiksasyonunu katalizleyen enzim olan nitrojenaz ilk kez 1966’da Bulen ve Lecomte tarafından aerobik, fotosentetik olmayan Azotobacter vinelandii ‘de izole edilmiştir. Nitrojenaz enzimi, dinitrojenaz ve dinitrojenaz redüktaz olmak üzere iki proteinden oluşmaktadır ( Madigan et al.1997, Vignais et al.1985 ).
2.3.1.1. Dinitrojenaz ( MoFe proteini )
Moleküler ağırlığı 200.000-250.000 Da olan, 2α ve 2β birimlerinden oluşmuş tetramer yapısında bir proteindir (Şekil 2.2.). Dinitrojenaz proteini iki tip metal merkezi ve fosfor (P-cluster) demeti içermektedir. Holm et al. (1990) fosfor demetinin fonksiyonunun, Fe proteini ve FeMo-kofaktörü arasında elektron transferi olduğunu tespit etmiştir
( Jongsun et al. 1994 ). Fosfor demeti , 4Fe-4S ‘den oluşmuştur ve α ve β alt ünitesinin iç yüzeyine yerleşmiştir. FeMo – kofaktörü ise , 4Fe- 3S ve Mo-3Fe-3S kompozisyonundan oluşmuş iki demeti kapsamaktadır (Şekil 2.3.). Enzimin yapısındaki homositratın görevi fosfor demetinden FeMo-kofaktörüne elektron transferinde rol oynaması veya farklı indirgenmiş ortamlara protonların transferi olduğu düşünülmektedir. MoFe proteininin görevi, azotun indirgenmesini kontrol etmektir ( Galon et al. 2000, Johnson et al. 2000, Madigan et al.1997 ).
Şekil 2.2.Dinitrojenaz proteininin tetramer yapısı ( MoFe proteini) (Jongsun and Douglas 1994)
Şekil 2.3. FeMo- kofaktörünün yapısı ( Madigan et al.1997 )
Şekil 2.4. Dinitrojenaz redüktaz proteininin dimer yapısı ( Fe proteini )
( Jongsun and Douglas 1994 )
2.3.1.2. Dinitrojenaz redüktaz ( Fe proteini )
NifH geni tarafından kodlanan, molekül ağırlığı 60.000 Da olan, birbirine özdeş iki alt üniteden oluşmuş dimer yapısında bir proteindir ( Şekil 2.4. ). Dinitrojenaz redüktaz enzimi sadece demir metali içermektedir. Kübik yapıda 4Fe ve 4S atomlarını kapsamaktadır. Fonksiyonunun, azot fiksasyonunun devamını desteklemek amacı ile düşük potansiyelli elektronları sentezi olduğu düşünülmektedir ( Madigan et al. 1997, Jongsun and Douglas 1994, Galon et al. 2000 ).
2.3.1.3. Alternatif nitrojenazlar
Bazı azot fikse eden bakteriler , ortamda molibden bulunmadığı durumlarda “ alternatif nitrojenazlar “ adı verilen nitrojenazları sentezlemektedirler. Molibdenin yerini sadece vanadyum, vanadyum-demir veya sadece demir metali yer alabilmektedir. VFe proteinin kofaktörü, dinitrojenazın kofaktörü ile benzer yapıda olduğu bilinmektedir ( Postgate 1989 , Paerl 1990, Jongsun and Douglas 1994 ).
2.3.2. Azot fiksasyonunun mekanizması
2.3.2.1. Azot fiksasyonunun düzenlenmesi ve genetik doğası
Dinitrojenaz redüktaz enzimi düşük – indirgen vericiden elektronları kabul ederek 2MgATP’ye bağlar. Elektronlar dinitrojenaza transfer edildikten sonra, iki protein arasında bir kompleks oluşur ve MgADP ile Pi hidroliz olur. Dinitrojenaz redüktaz ve dinitrojenaz enzimleri ayrıldıktan sonra proses tekrarlanır. Dinitrojenaz yeterince elektron topladığında azot molekülü buraya bağlanarak indirgenir ve amonyak ortamdan ayrılır. Döngünün devamı için dinitrojenaz redüktazdan gelen elektronları dinitrojenaz tekrar kabul eder ve süreç bu şekilde devam eder ( Zuberer,1998 ). Nitrojenaz enzimi, azotun amonyağa indirgenmesinin yanı sıra başka reaksiyonları da kataliz etmektedir (Çizelge 2.3.) ( Zuberer 1998 ). Azot fiksasyonu, ”nif regülonu” tarafından düzenlenmektedir. Nif regülonu, farklı transkripsiyonel ünitelerden meydana gelmiş 20 geni kapsamakta olup, nitrojenaz yapısal genlerinin yanı sıra, FeMo-kofaktörünün
genleri, elektron taşıma proteinlerini kontrol eden genler ve çok sayıda düzenleyici geni içermektedir (Şekil 2.5.) ( Madigan et al. 1997, Postgate 1989, Vignais et al. 1985, Herrero et al. 2001).
Çizelge 2.3. Nitrojenazın katalizlediği reaksiyonlar
Dinitrojenaz kompleks proteinin α ünitesi nif D, β ünitesi ise nif K genleri tarafından, dinitrojenaz redüktaz proteini nifH geni tarafından, FeMo-kofaktörü ise nif V,Z,N,W,E,B ve Q genleri tarafından kodlanmaktadır ( Madigan et al.1997, Postgate 1989, Vignais et al. 1985, Graham and Vilcox 2000 ).
Adı Formülü Ürünler Dinitrojen N2 NH3 + H2
Asetilen C2 H2 C 2H4
Siyanid CN CH4 + NH3
Allene C3H4 C 3H6
Siyanojen C 2N2 CH4
Azid N3 N2+ NH 3 +N 2H4
Nitrozoksit N 2O N2 + NH3
Hidrojen iyonu H+ H2
Şekil 2.5. Nif regülonunun genetik yapısı ( Postgate 1989 )
B
L
F M Z
W V S U A Q
X N E
Y T K D H J
Mo süreci
FeMo-kofaktörü sentezi Pozitif
Negatif Düzenleyiciler Flavodoksin
Dinitrojenaz redüktaz süreci FeMo-kofaktörü sentezi Homositrat sentezi
Metal merkezi biyosentezi
FeMo-co sentezi
Dinitrojenaz içine FeMo-kofaktörün sokulması
β
α ………Dinitrojenaz Dinitrojenaz redüktaz
nif T
r a n s k r i p s i y o n e l Ü n i t e l e r
Piruvat flavodoksin oksidoredüktaz ( ē taşınması)
Azot fiksasyonunun çevresel faktörler ile baskılandığı bilinmektedir. Bu nedenle düzenlemeler transkripsiyon basamağında yapılmaktadır. Reaksiyon sırasında üretilen amonyak kısa bir süre önce sentezlendiği için doğrudan organik yapılar ile interaksiyon vererek enzim aktivitesini baskılamasının önüne geçilmektedir. Uzun süre ortamda bulunan amonyak ise nitrojenaz enzim aktivitesini hemen baskılamaktadır. Azot fikse eden bazı organizmalar amonyağın ‘switch off ‘ etkisi adı verilen ( amonyağın kapatma etkisi) bir mekanizma geliştirmişlerdir. Ortamda ki aşırı amonyak, dinitrojenaz redüktazın kovalent modifikasyonuna neden olarak enzim aktivitesini durdurmaktadır.
Bu mekanizma hızlı ve geri dönüşümlüdür. Ortamda amonyak sınırlandığında, dinitrojenaz redüktaz tekrar eski aktif formunu kazanarak reaksiyonun devamı sağlanmaktadır ( Madigan et al. 1997, Vignais et al.1985, Postgate 1989).
2.3.2.2. Azot fiksasyonunda elektron akışı
Nitrojenaz enzimi, siyanobakterilerde özelleşmiş bazı yapılar içinde bulunmaktadırlar ( Madigan et al. 1997, Albrecht 1998). Siyanobakteriler, asetilenin indirgenmesinde elektron taşıyıcısı olarak fonksiyon yapacak olan düşük potansiyelli redüktantlar ferrodoksin ve flavodoksini sentezlemektedir. (Bothe et al.1988).
Nitrojenaz’da elektron transferi dinitrojenaz redüktazdan fosfor demetine, buradan da FeMo-kofaktörüne doğru gerçekleşmektedir. Bu sırada diğer bir elektron akışı da moleküler azottan amonyağa doğru olmaktadır ( Jongsun and Douglas 1994 ).
Reaksiyon için gerekli elektronlar, ferrodoksin veya flavodoksin tarafından sağlanmaktadır (Şekil 2.6.)( Stewart 1973 ). Heterosist içindeki azot fiksasyonu için indirgeyici eşitliklerin üretimi ve ferrodoksinin indirgenmesi çok karmaşıktır.
Fotosentetik CO2 fiksasyonu yapamayan heterosistler vejetatif hücrelerden ihtiyacı olan karbon bileşiklerini karşılamaktadırlar (Şekil 2.7) ( Bothe and Never 1988, Thiel and Pratte 2001 ). Bunlar arasında , monosakkaritler hekzos monofosfat yoluyla gliser aldehit-3-fosfata dönüştürülerek bozulurlar. Bu reaksiyon glikolizle ve eksik trikarboksilik asit döngüsü ile hızla metabolize olmaktadır. Hidrojen gibi son redüktantlar ( NADH, NADPH, piruvat ) azot fiksasyonununda ferrodoksinin indirgenmesi için elektron vericileri olarak kullanılmaktadırlar( Bothe and Never 1988).
Oksidatif Azot Hekzos(glukoz) ē taşınması
Glukoz 6 PO4 Glukonolakton-6 PO4
ADP +Pİ
Glukonat-6 PO4 ATP
Fruktoz 6 PO4 ē Ribuloz -5 PO4 NADPH
Riboz-5 PO4
Fruktoz 1,6-di PO4
H2
Gliseraldehit-3 PO4
Piruvat Fd oksidoredüktaz ē Piruvat Ferrodoksin
Piruvat dehidrojenaz
Asetil CoA
Sitrat
ADP+Pİ
Oksaloasetat NADPH ATP
Malat İzositrat
Fumarat Glioksilat Fotosentetik ē taşınması
Suksinat 2oksoglutarat Amonyak Glutamat
piruvat
Glutamin Alanin Şekil 2.6. Siyanobakterilerde nitrojenaz için ATP ve redüktant kaynakları (Stewart 1973)
Diğer bir elektronkaynağı ise, piruvattan Asetil Co-A’ nın oluşumu sırasında meydana gelmektedir. Elektron vericileri ve elektron taşıyıcıları arasındaki reaksiyonlara enzimler aracılık etmektedir. Elektron vericilerinin bazıları (piruvat, NADPH) karanlıkta ferrodoksini indirgeyebilmektedir. H2 ve NADH tarafından ferrodoksinin indirgenmesi ise tamamiyle fotosistem-I’e bağlıdır. Bütün farklı elektronlarla asetilenin indirgenmesi ışıkla teşvik edilmektedir.Çünkü azot fiksasyonu için gereken ATP, siklik fotofosforilasyon ve oksidatif fosforilasyon vasıtasıyla sağlanabilmektedir. Nitrojenaza farklı elektron vericilerden elektronların akışının düzenlenmesine ihtiyaç vardır, ancak bu mekanizma henüz anlaşılamamıştır. Heterosistler vasıtasıyla asetilenin indirgenmesi çeşitli basit organik bileşikler ( glikolat, fruktoz vb.) tarafından teşvik edilebilir.
Nitrojenaz için bu kaynaklardan indirgenlerin üretimi henüz tanımlanamamıştır (Şekil 2.6.)( Stewart 1973, Neuer and Bothe 1985 ).
Fosfor demetinin FeMo-kofaktörü ile ilişkili olduğu ve elektron aktarımında görev yaptığı bilinmektedir. Dinitrojenazın iki redoks merkezi arasındaki bağlantı
“homositrat” tarafından sağlanmaktadır. Dinitrojenazın indirgenmesi sırasında azot ta amonyağa indirgenmektedir. Bu reaksiyon için 6ē’a ihtiyaç olmasına rağmen 8ē harcanmaktadır. Kalan 2ē’ un moleküler hidrojen olarak kaybedildiği ve reaksiyonun bir parçası olduğu düşünülmektedir. Reaksiyon sırasında harcanan ATP miktarı ise 18-24 ATP kadardır ( Madigan et al.1997, Purves et al.1997 ).
Şekil 2.7. Heterosist ve vejetatif hücre arasındaki fotosentez ile azot fiksasyonu ilişkisi ( Bothe and Neuer 1988 )
2.4. Çeltik Bitkisi ve Zararlı Otlar ile Mücadele
2.4.1. Çeltik bitkisi (Oryza sativa)
Çeltik, dünyanın en önemli zirai bitkisi olup, tüm dünyada 143 milyon hektar alanda çeltik tarımı yapılmaktadır. Bunun % 75’i su ile doygun koşullar altında yetiştirilmektedir. Çeltik, Türkiye’nin bütün bölgelerinde yetiştirilmekte olup, Japonica grubuna giren çeltik çeşitleri kültivasyon için kullanılmaktadır. Ekim zamanı bölgelere göre değişmekle birlikte, Nisan sonundan Mayıs sonuna kadar devam etmektedir.
Ülkemizde çeltik alanlarında yapılan sulama bitki sapa kalktıktan sonra 10-20 cm.
derinlikte sürekli su bulundurularak yapılmaktadır ( Ünver vd. 2001 ).
Çeltik bitkisinin gelişimi 3 basamakta incelenmektedir ( Irisarri et al. 2001 ).
• ana sürgün ve üçlü kardeşlenme ( Tillering)
• kolların artması (Booting)
• ürünün dolması ( Grain filling)
Çeltikte yabancı otlarla mücadele son birkaç yıla kadar herbisitlerle yapılmakta idi, ancak günümüzde çevreye daha az zararlı çok düşük dozlarda yeni ilaçlar kullanılmaktadır. En uygun hasat zamanı, salkımın % 80’inin saman rengine ve salkımın dip tarafındaki taneler sert sarı olduğu dönemdir. Hasat edilen ürün vakit geçirilmeden kurutulmalıdır. Tanede rutubet oranı % 14-15’ e düştüğü zamanda depolanmalıdır (Ünver vd 2001).
2.4.2. Çeltik ekim alanlarında zararlı otlar ile mücadele
Çeltik bitkisinin gelişimi sırasında bitki köklerine zarar veren otlarla mücadele ilk olarak 20-30 yıl önce Hindistan’da başlamıştır ( Narwal, 2000 ). Herbisitler kendi aralarında farklı gruplara ayrılmaktadır. Ülkemizde özellikle İç Anadolu Bölgesinde ki çeltik alanlarında kullanılan herbisitlerin grupları ve etkili maddeleri Çizelge 2.4.’de verilmiştir ( Anonim, 2002 ).
Çizelge 2.4. İç Anadolu Bölgesinde kullanılan herbisit grupları ve etken maddeleri
Grubu Etken madde
Fenoksi bileşikler Cyhalofop-buthyl Karbamatlar Molinate ; Thiobencarb
Sülfonil üreler Bensulfuron-methyl ; Azimsulfuron ; Ethoxysulfuron Amid ve anilidler Propanil
Diazinler Bentazone Aminofosfatlar Byspyribac-sodium
Çeltik alanlarında zararlı otlarla mücadele sırasında kullanılan herbisitler, bitkinin gelişimi sırasında farklı basamaklarda uygulanmaktadır.
• Ekim öncesi ( presowing ) ● Bitki öncesi ( preplant )
• Bitki öncesi içine ( into preplant ) ● Büyüme öncesi ( preemergence )
• Büyüme sonrası ( postemergence )
Bunun yanı sıra kullanılan herbisitlerin hedef zararlı otlara, uygun dozda ve zamanda uygulanması ürün verimi açısından çok önemlidir ( Gianessi et al. 2002, Pratley et al.2001, Singh and Tiwari 1988 ). İç Anadolu Bölgesinde kullanılan bazı herbisitlerin etkiledikleri yabancı ot ve etki mekanizmaları Çizelge 2.6. de gösterilmiştir ( Anonim, 2002 ).
2.4.3. Çeltik ekim alanının fiziksel ve kimyasal özellikleri
Uygulama alanı olarak belirlenen Çorum- Osmancık Kurupınar Mevkiindeki çeltik ekim alanlarının fiziksel ve kimyasal yapısı Taban vd.(2003) yaptıkları çalışmada rapor edilmiştir. Bu çalışmada uygulama alanı toprağının tekstür sınıfı tın olup, organik madde miktarı çok az, alkalin reaksiyonlu, orta kireçli, azot miktarı az, çinko miktarı belirlenen kritik sınır değerinden çok az, demir miktarının ise önerilen kritik sınır değerler arasında olduğu saptanmıştır (Çizelge 2.5.) (Taban vd 2003).
Çizelge 2.5. Uygulama alanının fiziksel ve kimyasal özellikleri
Özellikler
Tekstür sınıfı Tın
Kum % 44,91
8,30 Toprak reaksiyonu (pH) 1:2,5 toprak: su
saturasyon çamuru 7,81
Organik madde % 0,93
CaCO3 % 5,20
Tuz % 0,042
Toplam azot % 0,075
K 171,3 Değişebilir katyonlar, mg kg-1
Na 321,0 P 12,5 Zn 0,20 Cu 2,51 Fe 2,77 Bitkiye yarayışlı mineral madde, mg kg-1
Mn 7,70
Çizelge 2.6. İç Anadolu Bölgesinde kullanılan bazı herbisitlerin etki ettiği yabancı otlar, etki mekanizmaları ve uygulama basamakları Herbisit Etki ettiği yabancı ot Etki mekanizması Uygulama basamağı Propanil (3,4 Dikloropropion
anilide)
Çimenler ve geniş yapraklı bitkiler Fotosentetik elektron taşınmasını inhibe eder.
Bitki öncesi (preplant), büyüme sonrası (post emergence)
Molinate (S-etilhekzahidro- 1Hazepine-I carbothiate)
Echinochloa spp , geniş yapraklı otlar,
çimensi bitkiler
Lipit metabolizmasını ve çimlenmeyi inhibe eder.
Ekim öncesi (pre- sowing),
büyüme sonrası (post emergence)
Bentazon (3-1 metiletil –(1H)- 2,1,3 benzotiadiazin-4-(3H) one 2,2 dioksi)t
yıllık sazlar, geniş yapraklılar Fotosentetik elektron taşıma inhibitörü
Etken hale geçen herbisit (contact herbicide)
Cyhalofop- buthyl yıllık çimenler AsetilCoA karboksilazın inhibitörü
Büyüme sonrası (post emergence)
Bensulfuron–methyl (Metil2[(4,6dimetoksi- 2pirimidinil) amino])
Kızotu(Cyperus difformis),
KurbağaKaşığı (Alisma plantago), Sandalye Sazı (Scirpus spp.)
Elzem aminoasitlerin sentezini inhibe ederek, hücre bölünmesini ve bitki büyümesini durdurur.
Bitki öncesi (pre-plant), büyüme sonrası (post emergence)
3. MATERYAL VE YÖNTEM
3.1. Materyal
3.1.1. Organizma
Araştırmada kullanılan azot fikse eden siyanobakterilerin izolasyonu için çeltik bitkisi- nin gelişme süresi boyunca Çorum-Osmancık Kurupınar Mevkiinden üç yıl süresince alınan sulu toprak numuneleri organizma kaynağı olarak kullanılmıştır. Çalışmada ayrıca Prof. Dr. Gönül Dönmez tarafından izole edilen Nostoc ve Nodularia cinsleri de kullanılmıştır.
3.1.2. Araç, gereç ve kimyasal maddeler
Araştırmada Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü ile Ankara Üniversitesi Gıda Mühendisliği Bölümü’ndeki araç, gereç ve kimyasal maddeler kullanılmıştır.
3.2. Yöntem
3.2.1. İzolasyon ve identifikasyon
Çeltik alanlarından alınan örneklerdeki siyanobakteri yoğunluklarının belirlenmesi amacıyla örneklerden seyreltme yapıldıktan sonra azotsuz BG-11 besiyeri içeren petrilere ekimleri yapılmış ve 600 lüks beyaz ışık altında, oda sıcaklığında (20±2oC) 25 gün süreyle inkübasyona bırakılmıştır. Petrilerde gelişen mavi –yeşil renkteki kolonilerin sayımları yapılmıştır.
Petri kutularında gelişen farklı morfolojik yapı ve renkteki koloniler, azotsuz BG 11 besiyerlerine aktarılarak saflaştırılmıştır. Filamentli siyanobakteri kültürlerinden bakterilerin uzaklaştırılması amacıyla steril lamlar ile yüzeyi paralel çizgiler halinde
çizilmiş azotsuz BG11 besiyeri içeren petri kutuları kullanılmıştır. Siyanobakteri kültürleri petri kutularının bir ucuna yerleştirilerek karşı taraftan ışık alacak şekilde 600 lüks beyaz ışık altında 25 gün süresince inkübasyona bırakılmıştır. Işığa doğru hareket eden filamentler, mikroskop altında incelenerek bakteri kontaminasyonu olmayan filament parçaları steril şartla altında yatık BG-11 besiyerlerine aktarılmıştır
( Castenholz 1988, Fogg et al.1973 ).
BG-11 besiyerinin bileşimi : ( Rippka 1988a )
K2HPO4 ………..0,03 g MgSO4 x7H2O ………...0,075 g CaCl2 ………...0,027 g Sitrik asit ……….0,006 g Ferrik amonyum sitrat ……….0,006 g EDTA di Na-Mg tuzu ……….0,001 g Na2CO3 ………...0,023 g Agar ………. % 1 Distile su………...1000 ml A-5 solusyonu ……….1 ml/ l A-5 solusyonu :
H3BO3………...0,286 g MnCl2 x 4H2O………...0,181 g ZnSO4 x 7H2O………...0,022 g Na2MoO4 x 2H2O……..0,039 g CuSO4 x 5H2O………...0,079 g Co(NO3)2 x 6H2O…...0,049 g Distile su……….100 ml
Bu şekilde saflaştırılan kültürler mikroskop altında incelenmiş ve heterosist, akinet, hormogonyum bulunup bulunmayışı gibi morfolojik özellikleri belirlenerek teşhisleri yapılmıştır ( Rippka 1988b ).
3.2.2. Kültürlerin optimum pH isteklerinin belirlenmesi
Seçilen siyanobakteri kültürlerinin optimum pH değerlerinin belirlenmesi amacıyla;
farklı pH düzeylerinde ( pH 7; 8; 9) hazırlanan 25 mililitrelik serum şişelerindeki azot
içermeyen sıvı BG-11 besiyerlerine 100 µl aktif kültürlerden inoküle edilmiştir.
Kültürler 45- 65 gün süre ile 600 lüks beyaz ışık altında, oda sıcaklığında ( 20±2oC ) inkübasyona bırakılmıştır. Algal gelişim kuru ağırlık ve klorofil- a tayini ile belirlenmiştir.
Kültürler, belirlenen optimum pH değerlerinde hazırlanan BG-11 besiyerlerine 100’ er µl olacak şekilde inoküle edilmiştir. Tüm kültürler 25, 35 ve 45 gün süresince 600 lüks beyaz ışık altında, oda sıcaklığında ( 20±2oC ) inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon süresi sonunda asetilen redüksiyon tekniği uygulanarak kültürlerdeki etilen miktarları hesaplanmıştır. Denemeler 3 paralel olarak gerçekleştirilmiştir.
3.2.3. Tuz stresinin nitrojenaz aktivitesine etkisi
Azot fiksasyonunun tuz stresinden etkilendiği bilinmektedir. Fernandes et al. (1993) bildirdikleri stres aralıkları dikkate alınarak tuz stresi çalışmaları yapılmıştır.
Tuz stresinin nitrojenaz aktivitesine etkisini belirlemek amacıyla 25 mililitrelik serum şişelerine farklı tuz konsantrasyonlarında (10, 25, 50, 100, 200 ve 400 mM NaCl) hazırlanmış azot içermeyen 10 ml BG-11 besiyerlerine aktifleştirilmiş kültürler inoküle edilmiştir. Oda sıcaklığında( 20±2oC ) ve 600 lüks beyaz ışık altında, 35 gün boyunca inkübe edilen kültürlerdeki nitrojenaz aktivitesi asetilen redüksiyon tekniği ile belirlenmiştir. Denemeler 3 paralel olarak yapılmıştır.
3.2.4. Sakkaroz stresinin nitrojenaz aktivitesine etkisi
Sakkaroz stresinin nitrojenaz enzim aktivitesine etkisini belirlemek amacıyla, 25 mililitrelik serum şişelerine 10, 20, 40 ve 60 mM sukroz konsantrasyonlarında hazırlanmış azot içermeyen 10 ml BG-11 besiyerlerine, 100 µl aktif siyanobakteri kültürleri inoküle edilmiştir. Denemeler 600 lüks beyaz ışık altında, oda sıcaklığında ( 20±2oC ) ve 35 gün devam etmiştir. İnkübasyon süresi sonunda kültürlerdeki nitrojenaz aktivitesi asetilen redüksiyon tekniği ile saptanmıştır. Denemeler 3 paralel olarak yürütülmüştür.
3.2.5. Ağır metal stresinin nitrojenaz aktivitesine etkisi
Azot fiksasyonunu etkileyen çevresel faktörlerden biri de toprağın fiziksel ve kimyasal yapısıdır. Özellikle toprağın kimyasal yapısında bulunan ve bitkiye yarayışlı mineral maddelerin azot fiksasyonuna katkısının bilinmesi ürün verimi açısından son derece önemli olduğu için Taban vd’nin ( 2003 ) bildirdiğine göre uygulama alanının kimyasal yapısı dikkate alınarak nitrojenaz aktivitesine etkisi araştırılmıştır.
Metal stresi çalışmaları için, 25 mililitrelik serum şişelerindeki farklı demir
( FeCl3x6H2O ) ( 2.5; 5; 10; 20; 40; 80 ppm ), mangan ( MnCl2x4H2O ) ( 2.5; 5; 10; 20;
40; 80 ppm ) ve çinko ( ZnCl2 ) konsantrasyonlarında (2.5; 5; 10; 20; 40 ppm) azot içermeyen 10 ml BG-11 besiyerlerine, 100 µl aktif kültürlerden inoküle edilmiştir.
Kültürler 35 gün süre ile 600 lüks beyaz ışık altında, oda sıcaklığında ( 20±2oC ) inkübasyona bırakıldıktan sonra nitrojenaz aktiviteleri asetilen redüksiyon tekniği ile belirlenmiştir. Denemeler 3 paralel olarak gerçekleştirilmiştir.
3.2.6. Nitratın nitrojenaz aktivitesine etkisi
Nitratın ( KNO3 ) nitrojenaz aktivitesine etkisini belirlemek amacıyla, 25 mililitrelik serum şişelerindeki 0,5 mM; 5 mM; 10 mM; 25 mM; 50 mM nitrat konsantrasyonlarında azot içermeyen 10 ml BG-11 besiyerlerine, 100µl aktif kültürlerden inoküle edilmiştir. Oda sıcaklığında ( 20±2oC ), 600 lüks beyaz ışık altında tüm kültürler 35 gün süre ile inkübasyona bırakıldıktan sonra, asetilen redüksiyon tekniğine tabi tutularak nitrojenaz aktiviteleri saptanmıştır. Denemeler 3 paralel olarak yürütülmüştür.
3.2.7. Fosfatın nitrojenaz aktivitesine etkisi
Fosfatın ( K2HPO4 ) nitrojenaz aktivitesine etkisini belirlemek amacıyla 25 mililitrelik serum şişelerindeki 10 µM; 100µM; 1 mM; 10 mM; 100 mM; 1M fosfat konsantrasyonlarında, azot içermeyen 10 ml BG-11 besiyerlerine 100 µl aktif
kültürlerden inoküle edilmiştir. İnkübasyon koşulları 600 lüks beyaz ışık, oda sıcaklığı ( 20±2oC ) olarak belirlendikten sonra tüm kültürler 35 gün süre ile inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon periyodu sonunda nitrojenaz aktivitesi belirlenmiştir.
Denemeler 3 paralel olarak yapılmıştır.
3.2.8. Herbisit stresinin nitrojenaz aktivitesine etkisi
Herbisitlerin nitrojenaz aktivitesine etkisini belirlemek amacıyla, 25 mililitrelik serum şişeleri içersinde bulunan kültürlere farklı konsantrasyonlarda herbisit uygulanmıştır.
Denemelerde 50; 100; 200; 300; 500 µg/ ml konsantrasyonlarındaki bensülfüran-metil ve 5; 10; 20; 30; 40; 50 µg/ml konsantrasyonlarında molinate bulunan azot içermeyen 10 ml BG-11 besiyerlerine, 100 µl aktif kültürlerden inoküle edilmiştir. Işık şiddeti olarak 600 lüks beyaz ışık, sıcaklık olarak ta oda sıcaklığı ( 20±2oC ) inkübasyon şartları olarak belirlendikten sonra tüm kültürler 35 gün süreyle inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon süresi sonunda kültürlere nitrojenaz aktivitelerini belirlemek amacıyla asetilen redüksiyon tekniği uygulanarak etilen miktarları hesaplanmıştır.
Denemeler 3 paralel olarak sürdürülmüştür.
3.2.9. Işık şiddetinin nitrojenaz aktivitesine etkisi
Farklı ışık şiddetinin nitrojenaz aktivitesine etkisini belirlemek amacıyla, 25 mililitrelik serum şişelerindeki azot içermeyen 10 ml BG-11 besiyerlerine 100 µl aktif kültürlerden inoküle edilmiştir. Denemeler 300, 600 ve 900 lüks beyaz ışık altında, oda sıcaklığında ( 20±2oC ) ve 35 gün süreyle devam etmiştir. Üreme periyodu sonunda kültürlerin nitrojenaz aktivitelerini belirlemek amacıyla asetilen redüksiyon tekniği uygulanmış ve etilen miktarları hesaplanmıştır. Denemeler 3 paralel olarak gerçekleştirilmiştir.
3.2.10. Analiz Yöntemleri
Kuru ağırlığın belirlenmesi : Azot içermeyen BG-11 sıvı besiyerlerinde geliştirilen kültürlerin kuru ağırlıkları 70 oC‘de 12 saat kurutulduktan sonra hassas terazide tartımları yapılarak belirlenmiştir( Cappuccino and Sherman 2001, Prosperi et al.1993 ).
Klorofil – a tayini : Azot içermeyen sıvı BG-11 besiyerinde geliştirilen kültürlerin klorofil-a miktarları Porra et al. (1989)’ne göre yapılmıştır. Kültürler 5000 rpm. de 5 dakika santrifüj edildikten sonra süpernatant ortamdan uzaklaştırılmıştır. Çökelti ise, 6 ml aseton ile ( % 80’lik ve 2.5mM Na2HPO4 X 12H2O ile pH’ ı 7,8’e ayarlanmış ) ekstraksiyonu takiben santrifüj edilmiştir.Üst sıvı alınarak 663.6 ve 646.6 nm dalga boylarında optik yoğunlukları okunmuştur. Elde edilen veriler formülde yerine konularak klorofil-a miktarları hesaplanmıştır. Denemelerde şahit olarak tamponlanmış aseton çözeltisi kullanılmıştır.
* Toplam klo-a+b: 17,76 A646,6+7,34 A663,6 ( Porra et al.1989 ).
Nitrojenaz aktivitesinin belirlenmesi : Tuz, şeker, demir, mangan, çinko, nitrat, fosfat, bensülfüran-metil, molinat, ışık şiddeti gibi çevresel koşulların nitrojenaz aktivitesine etkisini belirlemek amacı ile kültürlere asetilen redüksiyon tekniği uygulanarak etilen miktarları hesaplanmıştır ( Burlage et al.1998 ). Farklı çevresel koşullar altında geliştirilen kültürler inkübasyon süresi sonunda, plastik tıkaçlarla iyice kapatılıp parafilmlendikten sonra, ortama 1 ml asetilen gazı injekte edilmiştir. Deney koşulları altında kültürler 12 saat boyunca tekrar inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon süresi sonunda, ortamdan uzaklaştırılan 1 ml gaz örnekleri gaz kromatografisine injekte edilerek verileri okunmuştur. Sonuçlar µl etilen / kuru ağırlık x saat ( µl etilen /mg.h ) olarak hesaplanmıştır.
Analizler sırasında kullanılan gaz kromatografisinin ( Schimadzu GC-14B, aliminyum kolon ve ( FID ) alev iyonize dedektör) kolon sıcaklığı 100oC ‘ye , injeksiyon odasının sıcaklığı 100oC‘ye ve dedektör sıcaklığı 120oC ‘ye ayarlanmıştır. Standart olarak % 99,9 saflıkta etilen gazı kullanılmıştır. Ortamdan geçen azot gazının akış hızı ise 5 ml/
dk olarak ayarlanmıştır.
* Siyanobakteriler klorofil-b pigmenti içermedikleri için formülden elde edilen veriler klorofil-a’ ya işaret etmektedir.
4. ARAŞTIRMA BULGULARI
4.1. Azot Fikse Eden Siyanobakterilerin İzolasyonu ve İdentifikasyonu
Çeltik alanlarından üç yıl süresince alınan sulu toprak örneklerinden yapılan izolasyon çalışmaları sonucunda azot içermeyen BG-11 besiyerlerinde toplam 26 adet izolat elde edilmiştir. Filamentleri kübik veya silindirik hücrelerden oluşan kılıflı terminal konumda heterosistli izolatlar Anabaena sp. olarak, hücreleri çoğunlukla yumurtamsı, küresel veya fıçı şeklinde ve kılıflı, terminal veya enine konumlu heterosistlere sahip olan izolatlar Nostoc sp. olarak, hücreleri disk şeklinde kılıflı ve heterosistli olanlar Nodularia sp., hücreleri disk şeklinde kılıflı ve heterosist içermeyen izolatlar Lyngbya sp. olarak, heterosist ile akinet içermeyen ve trikomu kırılmayan disk şeklindeki hücrelere sahip izolatlar Oscillatoria sp. olarak tanımlanmıştır. Trikom kırılması, ana filamente benzer fakat daha kısa olan trikomların varlığı ile belirlenmiştir. Tek hücreli izolatlar incelendiğinde çubuk şeklinde olanların Synechococcus cinsine, kok şeklinde olanların ise Synechocystis cinsine ait olduğu belirlenmiştir ( Çizelge 4.2. ).
Denemelerde kullanılan siyanobakterilerin izole edildiği örnekler ve bu örneklerin pH’sı ve içerdiği mikroalg sayısı Çizelge 4.1. de özetlenmiştir. Çizelgeden de görüldüğü gibi denemeler sonucunda 13 adet Lyngbya, 10 adet Anabaena, 1 adet Oscillatoria, 1 adet Synechococcus ve 1 adet Synechocystis cinsi izole edilmiştir.
İzolasyon çalışmaları sonucunda, Çorum-Osmancık bölgesindeki çeltik ekim alanlarında yaygın olarak Anabaena ve Lyngbya cinslerinin bulunduğu belirlenmiştir.
Biyogübre çalışmalarında en fazla tercih edilen cinsler arasında Anabaena bulunmaktadır. Bu nedenle çalışmalarımız sırasında da en iyi gelişme gösteren cinslerden biri olan Anabaena (Osmancık-4) daha sonraki denemelerde kullanılmak üzere seçilmiştir. Ayrıca aynı bölgeden daha önce izole edilmiş olan Nostoc ve Nodularia cinsleri de çeşitli çevresel faktörlerin etkilerinin belirlenmesi çalışmalarında kullanılmıştır.
Çizelge 4.1. Azot fikse eden siyanobakterilerin yoğunlukları ve cinsleri Örnek kodu Alındığı
dönem Örnek pH’sı Koloni sayısı
( adet / ml ) İzolatlar
Osmancık-1 7,96 6,0 x 103 Synechococcus sp.
Osmancık-3 8,05 5,0 x 103 Lyngbya sp.
Osmancık-4 7,78 6,5 x 103 Anabaena sp.
Osmancık-5 6,64 5,4 x 103 Lyngbya sp.
Osmancık-6 7,87 5,1 x 103 Anabaena sp.
Osmancık-7 7,77 2,8 x 103 Lyngbya sp.
Osmancık-8 7,26 5,0 x 103 Anabaena sp.
Osmancık-9 7,32 3,9 x 103 Lyngbya sp.
Osmancık-10 7,73 4,5 x 103 Anabaena sp.
Osmancık-11 6,63 8,6 x 103 Lyngbya sp.
Osmancık-12 8,10 3,4 x 103 Oscillatoria sp.
Osmancık-13 7,75 2,2 x 103 Lyngbya sp.
Osmancık-14 7,57 2,1 x 103 Synechocystis sp.
Osmancık-15 7,91 3,0 x 103 Anabaena sp.
Osmancık-K 7,53 5,5 x 103 Anabaena sp.
Osmancık-Ç 6,60 1,6 x 104 Anabaena sp.
Osmancık-16 6,90 0,4 x 103 Anabaena sp.
Osmancık-17 7,52 0,1 x 103 Lyngbya sp.
Osmancık-19
2001
6,78 3,5 x 103 Lyngbya sp.
Osmancık-20 7,01 4,5 x 103 Lyngbya sp.
Osmancık-21 6,71 0,9 x 103 Lyngbya sp.
Osmancık-22 6,60 1,8 x 103 Anabaena sp.
Osmancık-23 7,09 0,2 x 102 Lyngbya sp.
Osmancık-26
2002
6,72 0,5 x 102 Anabaena sp.
Osmancık-28 6,80 0,9 x 104 Lyngbya sp.
Osmancık-30
2003
6,60 2,6 x 103 Lyngbya sp.
Çizelge 4.2. İzole edilen siyanobakterilerin morfolojik özellikleri
4.2. Siyanobakterilerin gelişimine pH’ın etkisi
Tüm pH denemelerinde zamana bağlı olarak bakteriyel gelişimin arttığı saptanmıştır.
pH 6 ‘da gelişim az iken, pH yükseldikçe biyomas artmış ve en iyi gelişim pH 8’de belirlenmiştir. Denemelerde 45 günlük inkübasyon peryodu boyunca en yavaş biyomas artışının pH 9’da olduğu görülmüştür. Bu pH’ da ancak 45. günde elde edilen kuru ağırlık ve klorofil-a miktarlarına, diğer pH değerlerinde yaklaşık 35. günde ulaşılmıştır.
Denemelerde 45 günlük üreme periyodu sonunda gelişim ve klorofil-a miktarları karşılaştırıldığında pH 8 ve 7’de ki değerlerin birbirine yakın olduğu, aynı şekilde pH 6 ve 9’da ki değerlerin ise düşük ve birbirine yakın olduğu saptanmıştır( Şekil 4.1.). Tüm kültürlerde 15 günlük inkübasyon süresi sonunda gelişimin çok yavaş olduğu, bu noktadan sonra kültürlerin eksponansiyal faza geçtiği belirlenmiştir. Başlangıçtaki 15 günlük periyod sonunda bütün pH ‘lar karşılaştırıldığında gelişimin en fazla % 8’lik bir artışla pH 8’e ait olduğu, 45.gün sonunda bu oranın pH 8’de % 40’lara kadar ulaştığı saptanmıştır (Çizelge 4.3.). Anabaena cinsinin gelişimi üzerine pH’nın etkisi incelendiğinde, en iyi gelişimin pH 8’de [0,035 g/l klorofil-a ve 3606 mg/l kuru
Cins Hücre şekli Bölünme özelliği Kılıf Akinet Hormo-
gonyum Heterosist Hareket Anabanea sp. Silindirik,
küresel
trikom kırılması, akinet
çimlenmesi, (+) (+) (-) (+)
terminal (-)
Nostoc sp. yumurtamsı
küresel, fıçı trikom kırılması (+) (+) (+) (+) terminal,
enine
kayma
Nodularia sp. disk trikom kırılması, akinet
çimlenmesi, (+) (+) (-) (+) (-)
Lyngbya sp. disk trikom kırılması (+) (-) (+) (-) Kayma,
dönme Oscillatoria sp. disk Bir yüzeyde
bölünme, trikom kırılması
(+) (-) (+) (-) Kayma, dönme Synechococcus sp. çubuk bir yüzeyde
bölünme (-) (-) (-) (-) yüzme Synechocystis sp. kok iki veya daha
fazla yüzeyde bölünme
(-) (-) (-) (-) (-)
ağırlıkla ( % 40 artış ile )] ve en düşük gelişimin ise pH 9’da [0,026 g/l klorofil-a ve 2710 mg/l kuru ağırlıkla ] gerçekleştiği belirlenmiştir.
0 0,005 0,01 0,015 0,02 0,025 0,03 0,035 0,04
0 5 15 25 35 45
zaman (gün)
klorofil-a (g/l) pH6
pH7 pH8 pH9
Şekil 4.1. Anabaena sp. nin gelişimine pH’nın etkisi
Çizelge 4.3. Anabaena sp.nin farklı pH’lardaki kuru ağırlıkları ve klorofil-a miktarları
** pH ‘nın gelişim üzerine etkili olduğu ( p < 0,01 ) belirlenmiştir.
pH 5. gün 15. gün 25. gün 35. gün 45. gün Klo-a (g/l)x10-3 0,8±0,1 1,4±0,2 4,7±0,5 16,4±1,0 27,9±4,0
Kuru ağ. (mg/l) 83±11,0 143±25,0 483±57,0 1676±136 2856±462 6
% artış 0 1.7 5.8 20 34 Klo-a (g/l)x10-3 1,2 ± 0,0 2,4±0,1 10,5±0,2 25,3±3,0 34,3±1,0
Kuru ağ. (mg/l) 120±10,0 250±20,0 1073±25 2586±258 3510±145 7
% artış 0 2 8.9 21 29 Klo-a (g/l) x10-3 1,1±0,2 7,1±0.7 15,1±0,1 26,8±7,0 35,2±3,0
Kuru ağ. (mg/l) 89±25,0 730±36,0 1540±14 2745±671 3606±315 8
% artış 0 8 17 27 40 Klo-a (g/l) x10-3 1,2±0,0 5,9±0,4 8,3±1,0 17,8±0,4 26±9,0
Kuru ağ. (mg/l) 120±10,0 605±49,0 850±132 1825±49 2710±961 9
% artış 0 5 7 15 23 Süre (S) : **
Uygulama (U) : **
SxU interaksiyonu : **
Nostoc sp.’nin gelişimine pH’nın etkisine bakıldığında 45 günlük gelişim periyodu sonunda zamana bağlı olarak tüm pH değerlerinde biyomas artmıştır. Düşük pH’da (pH 6) gelişim az iken optimum gelişim pH 7’de gözlenmiştir. Bununla birlikte pH yükseldikçe gelişim hızı da azalmıştır ( Çizelge 4.4.).
İnkübasyon süresinin ilk 15 günü gelişim ve klorofil-a miktarı çok düşük iken, 15.
günden itibaren gelişmenin logaritmik faza geçtiği gözlenmiştir. İnkübasyon süresi sonunda pH 7 ve 8’deki gelişimin birbirine yakın değerler gösterdiği, pH 6 ve 9’un ise düşük ve yine aynı şekilde yakın değerlere sahip olduğu saptanmıştır (Şekil 4.2.).
Üreme periyodunun ilk 15. günü sonunda pH 8’de en fazla % 10 ‘luk bir artış gözlenirken, bu oran 45. günün sonunda pH 7’de % 98 ‘lere ulaştığı, en düşük gelişimin ise pH 9 ‘da % 26 düzeyinde kaldığı saptanmıştır.
En yüksek gelişimin pH 7’de 0.045 g/l klorofil-a miktarı ile 985 mg/l kuru ağırlıkla ( % 98 artış ile ) ve en düşük gelişimin ise pH 6 ‘da 0.015 g/l klorofil-a ve 325 mg/l kuru ağırlıkla gerçekleştiği belirlenmiştir. Denemelerde 45 günlük inkübasyon süresi boyunca en yavaş biyomas artışı pH 6’da gözlenirken, bu sürede ulaşılan kuru ağırlık ve klorofil-a miktarlarına diğer pH değerlerinde yaklaşık 35. günde erişilmiştir (Çizelge 4.4.).
0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05
0 5 15 25 35 45
zaman (gün)
klorofil-a (g/l)
pH6 pH7 pH8 pH9
Şekil 4.2. Nostoc sp. nin gelişimine pH’nın etkisi
