Y.Y.Ü. Vet. FliIc. Derg. 1999. IO( 1-2): 19-22
Köpek Spermasının Kısa Süreli Saklanabilirliği Üzerine Düşük Gliserol
Oranlarının
Etkileri
Cengiz Yll..DIZ t Mehmet ATAMAN 2 Abduııah KA YA 2 Necdet LEHİMCIOCLU 3 Fetih GÜLYÜZ' IYüzüncü Yıl Üniversitesi, Veteriner Fakültesi Dölerme ve Sun'j Tohumlama Anabilim Dalı -VAN 2Selçuk Üniversitesi, Veteriner Fakültesi Dölerme ve Sun'j Tohumlama Anabilim Dalı-KONYA 3Kafkas Üniversitesi, Veteriner Fakültesi Dölenne ve Sun'j Tohumlama Anabilim Dalı-KARS
(jZET
Sunu/an araştmnoda, Iris sulandırıclSlna ilave edilen düşük gliserol oranlannın kOpek spermasının kısa süreli soldanabilirliği
üzerine etld/erinin araştırılması amaç/andı. Bu amaçla 4 köpekıen penis masojı yöntemiyle sperma örnekleri alındı. Elde edilen sperma dört eşit kısma bölündü ve kontrol (gliserolsüz). %1 -2 ve 4 oranlarında gliserol içeren Iris sulandırıclfan ile 32 oC 'de 1/5
oranında ayrı ayn sulandırıldı. Sulandırılan sperma örnekleri 96 saat süreyle J OC 'de bekletiidi ve günlük olarak spermarolojik muayene/eri yapı/dı. Bu süre sonunda en yiiksek motiliıe, en düşük ölü. spemuııozoon ve bozuk akrozomlara ait orıalamalar sırasıyla
%20.6t9.03, %19.1:t5.27 ve %34.5:1:2.20 'lik oranla gliserol içermeyen kontrol grubu sulandırıcıda bulundu. Spemuııolojik
özelliJder yönünden yapılan istatistiki laırşılaştırma/arda. kontrol grubu ile diğer gruplar arasında önemli farklılıklar belirlendi (P<O.OJ-P<O.OOI).Sunulan çalışmada ICÖpek spermasının spermatolojik özellik/en· üzerine sulandırıcıya ilave edilen tum gliserol oranlanmn 48. soallen başlayarak moıiliıeyi baskıladığı. 91'04 oranında ilave edilen gliseroWn ise spermalozoon canlılığı Uzerine
ıoksik etkili olduğu ve akrozom hasarlannda artış meydana getirdiği tespit edildi.
Anahtar Kelimeler: Sperma, Gliserol. Kısa Süreli Sak/ama
Studies on the Effeeı of Low Glyeera' RoJes on the Storage of Dog Semenfor a Shorl Time SUMMARY
In ıhe presenı sıudy • the elfeeı of low glyeerol rates in addion /0 ıris atender on short time sıoroge of dog semen was
invesıigaıetLFor this purpose, semen samples were colleeıed by digital monipu/oıion fro'll a ıotalaf 4 dogs. The eollecıed !emen
WQS divided inro four equ.af porsions. Glycerol WQS added ıo ıris atenıkr in 1. 2 and 4% in ıhree different lubes. and fourth IUM eonıained no glyeerol as o control. Then, all four semen sampfes were di/wed at 32 OC in a waterbath with ıris aıenders prepared above in respecrive order as one part semen and four part ıris atender. The diluıed semen samp/es were kupt in 5 oC for 96 hours and spermalhologic e.xamination were made daily. After 96 hours storage. the highesı progressive moıility rote, lawesı dead spenn rares and lawesI domaged acrosoma were 20.6t9.03. 19./:t5.27 and 34.5:tı,20 % respectively in can/rol suplemented group. These results were significonıly (P<O.05-P<O.OOJ) differenı compared lo ıhe other suplemenI groups. As o resull, all glyeerol rations added ıo ,he tris aıender were found ıo depress moıility starting from 4glı hours. Furthemwre, addition of 4% gfycerole had a toxic elfeeı on sperms and increased acrosonıal domages.
Key Words : Semen, Glycerol, Short Time Storage GIRIş
Köpeklerde dondurulmuş spermayla yapılan sun'j tohumla- ma uygulamalanna ek olarak 5°e de saklanan sulandınlmış
spenna ile de sun'i tohumlama işlemi başanh bir ş~kilde yapıla
bilmektedir. Alınan sperma çeşitli sulandıncılar ile belirli oran- larda sulandınlarak, spennatozoonlann yaşam sürelerinin uzatılması ve fertilite oranlanrun arttınlması saAlanabilmekte- dir.
Bu amaçla deAişik araştınnacılar, sulandıncı içerisinde çeşitli doA;al, kimyasal ve kryoprezervatif maddeleri içeren fark-
lı sulandıncılan kullanarak köpek spennasının 4-5 oC 'de sakla- nabilirliA;i üzerine etkilerini araştımuşlardır. Spermatozoonlan soğuAun olumsuz etkilerine karşı koruyabilmek için spenna
sulandıncılanna çeşitli kryoprOlektif maddeler ilave edilmekte- dir.
Philips (16) ilk kez spennanın Iosa süreli saklanmasında
gliserolün olumlu koruyucu etkilerini bildirmiştir. GliserolUn
hUcrelerde membran bütünlüA\İnü koruyucu etkisine ek olarak (2,11,25), bir enetji kaynaAı şeklinde de görev yaptı~ belirtil- miştir (13,14). Çeşitli araştırmacılar, boAı spemıasının kısa süreli saklanmasında sulandıncıya ilave edilen deAişik oranlar- daki gHserolün, spennanın sa.k.lanabilirliAi üzerine önemli (1,9, 10), veya sınırlı (20) oranda olumlu etkilerini saptamışlardır.
Köpek spennasının kısa süreli saklanmasında gliserolUn etkilerini araştıran Foote (7) sitraı sulandıncısında %8 gliserol
oranının toksik olduğunu, Provience ve ark (17)'1 ise tris
sulandıncısı içerisinde %3 'lUk gliserol oranının herhangi bir etkisini gözleyemezken, %6 ·Ilk. oranın toksik etkili oldu~u bildirmişlerdir.
Bu araştırmada. köpek spermasının Iosa süreli saklanabilir- Iili üzerine tris suJandın.cısl içerisine ilave edilen %0 (kontrol) - 1-2 ve 4 oranlanndaki gliserolün etkilerinin araştınıması amaç-
lanmıştır.
1 9
Y.Y.Ü. Veı. Fak .. Oerg. 1999. JO( 1-2): 19-22
MATERYAL VE METOT
Yapılan çalışmada 3-5 yaşlı, 17-30 kg arasında. çeşitli ırkıardan dört adet melez erkek köpek kullanıldı. Çalışmada kullanılan köpeklerin herbirinden, Tekin ve ark (24)'nın bildirdi~i perus masajı yöntemiyle spenna üç gün aralıklarla 3 kez alındı ve spennadan zengin orta sekretin spermatolojik muayeneleri yapıldı.
Araştinna esnasında motilite, yoğunluk, ölü ve anonnal spermatozoon oranlarının tespiti Tekin (23) 'in bildirdi~i yön- temlere göre de~erlendirildi. Olü spermatozoon . oranı için eozin-nigrozin (5), anonnal spennatozoon oranı için iSe nigrozin-eozin (4) boyaları kullanılarak frotiler hazırlandı ve toplam 200 spennaıozoon sayılarak yüzde oranları belirlendi.
Araştınnada kullanılan bis sulandıncısı Rota ve ark (18)'na göre hazırlandı. Haztrlanan tris sulandıncısı dört eşit kısma bölünerek, sonuçta kontrol (gliserolsüz), % 1 - 2 ve 4
BULGULAR
oranlannda gtiserol içerecek şekilde araştınna gruplanna gliserol ilaveleri yapıldı. Su banyosu içerisinde (32°C) dört eşit kısma bölünen spenna üzerine, hazırlanan sulandıncılar LLS
oranında gruplara yavaşça ilave edildi ve O. saatteki spermatolojik muayeneleri saptandı. Sulandınlan spennanın ısısı su banyosuna buz atılarak 45 dakika içerisinde 5 oC ye düşürüldü ve buzdolabı içerisinde 96 saat süresince muhafaza edildi. Bu süre içerisinde spennanın günlük: olarak motilite, ölü ve anormal akrozom oranları belirlendi.
ıstatistik anaUz: Gruplann günlük spermatolojik değişimleri arasındaki istatistiki farklılıklar Minitab isimli istatistik prowamında varyans analiz yardımıyla karşılaştınldı.
Tablo 1 'de sunulan taze spermaya ait ortalama spermatolojik değerler 4 .köpek'den alınan 3 öme~e (n: 12), tablo 2'de araştırma gruplanna ait bildirilen ortalama değerler yapılan 8 tekrann sonuçlarına göre tespit edildi (n:8).
Dört köpekten penis masajı yöntemiyle elde edilen taze spermaların orta sekretlerine ait ortalama spermatolojik ve standan sapma degerleri tablo 1 'de verilmiştir.
Farklı gliserol oranları ve kontrol grubuna ait 96 saat süresince sulandınlmış spermada degişen motilile, ölü spermatozoon ve anormal akrozom oranlanna ait de~şimler tablo 2 ile grafik i, 2 ve 3 'te verilmiştir.
Tablo .1. Taze s Miktar
(ml)
rmanın orta sekretlerine ait s
pH Yoğunluk
(xI06 /ml)
rmatolo·ik de erler n:12 X±sO) Motilite
(%)
LU sp. Oranı (%)
Anormal sprınatozoon oranı Akrozom Baş, Orta, Kuyruk
(%) (%)
l.2±O.27 6.4±O.13 353.Ot45.70 88.3±4.08 l.8±O.5ı L.2±O.37 6.9±2.1O X: Ortalama, SO : Standart sapma
Tablo 2. Farklı gliserol oranlan ve kontrol grubuna ait sulandınlmış spermalann 96 saat süresince motilite, ölü spermatozoon ve anonnal akrozom oranlanna ait değişimler (n:8X XtSO)
S~t O 24
Kontrol (%O) 87.1±2.67 a 78.1±S.94 i Motilite (%) Gliserol (%1) 84.4±4.17 i 70.0±1 1.30 i
Gliserol (%2) 83.1±3.72 i 67.5±14.40"
Gliserol (%4) 82.5±2.67 • 6L.2±18.08 i Aynı sütunda de&işik harf taşıyan gruplar arasındaki fark önemlidir P<O.OOI
Kontrol (%O) 2.8±O.84 • 7.2±1.33 • ÖIU sp. Gliserol (%1) 3. 1±O.82· 8.Otl.28 • Oranı Gliserol (%2) 3.I±O.86 i 8.6±1.l5 i (%) Gliserol (%4) 3.2±O.92 i. 9.0±1.l3 i Aynı sütunda dekişik harftaşıyan gruplar arasındaki fark önemlidir P<0.05
Anormaı Kontrol (%O) 1.8±O.37i 16.7±2.22i Akrozom oranı Gliserol (% ı) 1.9±O.5 ı i 17 .5±2.25 i
(%) Gli,erol (%2) 2.0±0.49· 17.9±L.76·
Gliserol (%4) 2.0±0.49· 19A±2.96 a Aynı sütunda değişik harftaşıyan gruplar arasındaki fark önemlidir P<O.OI
48 65.6±13.50 d 31.9±11.63 b
13.7±4.43 • 6.2±4.43 a
ıo.9±2.21 a 12.4±2.30 a 13.1±1.82 i 15.4±1'86 b
23.6±1.34 i 25.1±1'34 a 25.9±L.76 ılı 27.7±L.89 b
72 47.5±9.63 d 15.O±ıo.35 a 3.7±3.53 a 1.3±3.53 i
14.0±0.63 a 16.1±3.46"
l7.1±3.21 a 19.2±2.99 b
30.4±2.47 a 32.7±2.57 ılı 34.2±2.00b 39.4±2.ıod
96 20.6±9.03 6
O.O±O.OO·
O.O±O.OO a O.O±O.OO a
19.1±S.27"
21.9±5.23 a 22.9±5.30' 27.4±5.06 b
34.5±2.20a 37.2±2.47 a 38.6±2.77a 45.8±3.Q7 b
Sulandınlmış spennada motilite açısından en iyi oranın 48.
saatten başlayarak kontrol grubu sulandıncısında oldu~ göz- lenmiş olup, bu grup ile di~er gruplar arasında istatistiki bir
farkJılı~ın olduğu belirleruniştir (P<O.OOl).OIü spermatozoon oranlan yöniinden, sulandınımış spermada en düşük: oranın 48.
saatten itibaren kontrol, % ı ve %2 oranlanna ait olduğu ve bu
20
gruplar ile %4 oranında gliserol ilave edilen grup arasında ista- tistiki farklılığın olduğu tespit edilmiştir (P<O.OS). En düşük anormal akrozom oranı 96 saat süresince kontrol grubu su-
landıncıda olup, özellikle %4 oranında ilave -edilmiş gliserolün akmzom membranlan üzerinde önemli hasarlar oluşturduğu belirlenmiştir(P<O.O ı).
100
~ -+-"AD Gi9ard ... %1 Gisard
00 - - %2 G1iserd --o-%4 Gisıerd
70 00 50 40
~
20 10 O
% O 24 48
n
96Grafikl. Araştınna gruplanna aİt motilite oranlannda gözlenen
değişimler
50 ... %OGiseıd
-%1Gseıd
40 -+-%2Gisıeıd
-o-%4 Gisıeıd
~
:il 20
10 Zenaı(sea)
O
,
"
O 24 48 72 96Grafik 2. Araştırma gruplanna ait ölü spermatozoon onınlannda
gözlenen değişimler
30 25 20
15 10 5
-+-%o GIiSerOI _%1 GIiSerOI
-"''''''''''
-o-%4 Gisıeıd
ZMwı(saat)
o~--~----~--~----~--~
% O 24 48 72 96
Grafik 3. Araştırma gruplanna ait ananna! akrozom oranlannda gözlenen değişimler
Y.Y.Ü. Vet. _ Derg. 1999. /O( 1-2),19-22
TARTIŞMA VE SONUÇ
Sunulan araştırmada, tablo I'de bildirilen köpeklere ait ortalama spennatolojik değerlerin nonnal sınırlar içerisinde
olduğu belirlenmiştir (6, 19,21,22).
Kontol grubu tris sulandıncısında, 96 saat süresince günlük olarak belirlenen motilite düşüş oranlan, tris sulandıncısı
içerisine herhangi bir ek katkı maddesİ ilave etmeyen kimi
araştınnacının bildirdiği motilite değişim oranına benzer
bulunmuşken (12), kiminin tespit ettiği değerden düşük (18), ancak diğer farklı bir araştınnacının buldu~ değerden de yüksek olarak tespit edilmiştir (17). Köpek spennasının kısa
süreli saklanmasında, spennanın i :30 oranında sulandınlmasının, daha düşük sulandınna oranlanna göre spennatozoon canlılığı ve motilitesini daha uzun bir süre
koruyabildiği bildiriImişdir (8). Yapılan araştınnada kontrol grubu tris sulandıncısı ile yukandak.i çeşitli araştınnacılann
bildirdikleri sonuçlar arasında tespit edilen motilite oranlanndaki farklılıklara muhtemelen spenna sulandınna oranlan ve sulandıncı içerisinde kullanılan doğal ve kimyasal madde kompozisyonundaki değişiklikler, sulandıntan spenna
ısısının S °C'ye düşüriilme hız ve tekniğinde kullarulan
farklılıklar etkili olmuş olabilir.
Araştınna da kontrol ve değişik. oranlardaki gtiserol gruplan
arasında molilite (P<o.ooı) ve ölü spennatozoon (p<O.OS) oranlan açısından 48,. saatten itibaren başlayarak istatistiki farklılıklar belirlenmiştir (Tablo 2, Grafik ı
-
2). Sunulançalışmada sulandıncı içerisine ilave edilen tüm gtiserol miktarlanmn 48. saatten itibaren motiliteyi bas1oladığl, %4 'lUk gliserol ilavesİnİn ise spennatozoon canlılığı üzerine tokSİk etki
yaptığı belirlendi. Foote (7) motilite açısından spenna
sulandıncısı içerisine eklediği %8 'lik gliserol oranını %4 'den daha zararlı oldu~nu bulmuştur. Provience ve ark (17)'1
sulandınımış spennanın kısa süreli saklanmasında %6 'lık
gliserol oranının motHiteyi baskıladığıru, ancak %3 'lük oranın ise herhangi bir zararlı etkisini tespit edemediklerini
bildinnişlerdir. Sunulan araştınnada tespit edilen motilite
oranları Foote (7)'a benzer, ancak Provience ve ark (l7)'nm %3
oranında ilave ettikleri araştınna grubundan da düşük bulurimuştur. Bu farklı sonuçlar muhtemelen, Provience ve ark (I 7) tarafından gliserollü sulandıncının, spermanın S oC ye
düşüriilmesinden sonra ilave edilmesine bağlı olarak
şekillenmiş olabilir. çünkü Critser ve ark (3) 'ı spermanın uzun süreli saklanmasında, sulandıncıya -S oC de gliserol ilavesinin, 25 oC 'de yapılan ilaveye göre çözüm sonrası 24. saatteki motilite üzerine önemli koruyucu etkileri olduğunu saptamışlardır.Tablo 2 ve Grafık 3'te gözlenebildiAi gibi, akrozom anormalitesi yönünden 48. saatten itibaren özellikle
%2 ve %4 gliserol oranlannda önemli istatistiki farklıklılar belirlenmiştir (P<O.OI). Sulandıncı içerisindeki gliserol oram yükseldikçe 48. saatten başlayarak anonnal akrozom oranının
da arttığı tespit edilmiştir. Değişik araştınnacılar gliserolUn toksik olmayan seviyelerde cklerurlesinin hücrelerin intraselOIJer ve ekstraselül1er çözelti yoğunlu~u (15) ve
membranlannı koruduAunu (I I, 25) bildirmişlerdir. Yapılan araştınnada belirlenen, gtiserol oranlanndaki yükselme ile akrozom membranlannda ortaya çıkan genel anonnalite 21
r.r.O. Vet. Fak. Derg. 1999, JO! 1·2 j, 19·22
artışına, muhtemelen spermatozoonlara ait intraselUller ve ekstraseliiller çözelti yo~luk dengelerinin ve membranlannm gliserolden olumsuz yönde etkilenmiş olmasından kaynak1anmış olabilir.
Sonuç olarak köpek spennasının kısa süreli saklanmasında
tris sulandıncısı içerisine ilave edilen düşük gliserol oranlan ve kontrol gruplanna ait spennatolojik özeııikler karşılaştınl
dığında, sulandıncıya ilave edilen tüm gliserol miktarlarının
motiliteyi baskıladığı. 0/04 oranında ilave edilen gliserol
oranının spennatozoon canlılığı üzerine daha toksik etkili
olduğu ve akrozom membran hasarlanm arttırdığı saptandı.
KAYNAKLAR
l-Alm.quist JO (19S9) : Efficient, laweast results using milk -glycerol diluent. A.1. Digest., 7(8): 11-14.
ı.Buscb W., Löble K. Und Peter W (1991):10 : KUnstliche Besamung bei Nutztieren. Ed by W Busch. Gustav FischervVerlag. Jena, Srottgart.
3-Critser JK., Ameson BW., Huse-Beoda AR.. BaU GD and Aaker DV (1988): Cryopreservation of human spermatozaa. III. The effeet of cryoproteetams on motiliıy.
Fertility and Sterility .• 50: 2. 314-320.
4-Dott RM and Foster GC (1972): A teehnique for studying the morphology of mammalian spermatozaa which are eosinophilic in a differantial 'live/dead' sıain. 1. Reprod FertiL..
29 , 443-445.
5-Evans G and MaxweD WMC (1987): Handling and Examination of Semen In : Salamon's Aıtificiallnsemination of Sheep and Goats. Ed by WMC Maxweıı., ii: 93.-106. Sydney.
6-FauUmer LC and Pineda MH (1983):Artificial Insemination. In :Veterinary Endocrinology and Reproduction.
Ed by LE Donaıd. i i: 330-349. Third Edition. Philadelphia.
'-Foole RH (1964): The Effects of Eleetrolytes, Sugars, Glycerol and Catalase on Survival of Dog Sperm Stored in Buffered-Yolk Mediums. Am. 1. Vet. Res .• 25:104.32-36.
3-Foote RH (1964): The influence of frequency of semen
coııeetion, fracıionation of the ejeeulate, and dilution rate on the survival ofstored dog semen. The Comeıı Vet., 54: 89-97.
9-Foote RH and Bratton RW (1960): Survival of boyine spermatozaa stored at 5 and 25 oC in e~tenders containing varying levels of egg yolk, glucose, glycine, glycerol, citrate.
and other salts. I. Dairy SeL, 43 : 1322- 1329.
IO-Foote RH., Gray LC., Young OC and Dunn HO (1964): Fertility of bull semen stored up to for days at 5 oC in 20% egg yolke~tenders.I. Dairy SeL, 43: 1330-1334.
ll-Garner DL (1991): Artificial Insemination. In :Reproduction in Domestic Animals., Ed by PT Cupps, 7, 251- 270. Academic Press Inc, Sen Diago.
12--Günzel A.R (1986): Semen colleetion, evaluation and preservation and artificial insemination in the dog.
Tieraerztliche Praxis., 14(2)275-282.
13·Jon .. AR., Chantrill LA and Cokinalds A (1992):
Metabolism of glycerol by matuee boar spermatozaa.I. Reprod.
Fert.,94,129·134.
14-Jones AR and GUlan L (19%): Metabolism of glycerol 3-phosphate by maıure boar spennatozoa.I. Reprod. Fen., 106, 321·327.
IS-McGann LE (1978): Differing actions of penetrating and nonpenetrating cryoproteetive agents. Cryobiology., 15
382. •
16-PhiUps PH (1939): Preservation of bull semen. 1. Biol.
Chern., 130: 415.
17-Province CA., Amann RP., Pidet BW and Squires EL (1984): E~tender for reservation of Canine and Equine spermatozaa at 5 oc. Theriogenology., 22,4: 409 -415.
18-Rota A., Ström B and Linde -Forsberg C (1995):
Effeets of seminal plasma and three extenders on canine semen stored at 4 oC. Theriogenology., 44: 885-900.
19-5etcbeU BP (1991): Male reproductive Organs and Semen. In :Reproduction in Domestic Animals. Ed. by PT Cupps.-6: 221-278. Academic Press Ine, San Diago.
2O-Sbanna KB and Tomar NS (1984): Studies on the effeet of glycerol on the keeping quality of bovine semen at 5 oC. Indian Vet. I., 496-500.
ll-Smith FO (1989): Ex.arnining male dogs and cats for breeding soundness. Vet. Med., 594-603.
22-Stockner PK and Bardwick C (1991): The relationship of semen parameters to fenility in the dog. Canine Practice., 16, 2,15·23.
23-Tekin N (1994): Spermanın muayenesi ve
değerlendirilmesi. In :Evcil Hayvanlarda Reprodüksyon Sun'i Tohumlarna, Doğwn ve İnfertilite. Ed by E Alaçam, 7: 69-79. i.
Baskı, Konya.
24-Tekin N., İzgür H ve Özyurt M (1987): Köpeklerde penis rnasajı yöntemiyle sperma alma ve başlıca spennatolojik özellikler üzerinde araştırmalar. Selçuk Ünv. Vet. Fak. Dergisi., 3.1,83·95.
25-Walson PF (1979): The preservation of semen in mammals. In :O~ford Reviews of Reproduction and Biology.
1:283-351. Oxford Unv Press, O~ford.
