377 Türk Mikrobiyol Cem Derg (2003) 33: 377-380
G‹R‹fi
‹nsan Parvovirus B19 (HPVB19) ilk kez 1975’te ‹ngiltere’de Cossart ve ark. (1) taraf›ndan tan›mla-nan küçük bir DNA virusudur. Latince küçük an-lam›na gelen “parvus” kelimesinden türetilmifltir. Omurgas›zlarda (böceklerde) infeksiyon yapan Densovirus, omurgal›larda (kufllarda) infeksiyon yapan Dependovirus’la birlikte Parvovirus ad› al-t›nda Parvoviridae ailesine aittir. Parvovirus cin-sine, insanlara infektif B19, köpeklere infektif Ca-nine Parvovirus (CPV), kedilere infektif Feline Panleukopenia Virus (FPV) dahildir. ‹nsanlarda patojen olan yaln›zca HPVB19’dur.
Parvoviridae ailesine ait viruslar ikozahedral, kap-süllü (32 kapsomerli), zarfs›z, yaklafl›k 20 nm ça-p›ndad›rlar. Bu viruslar alkol, eter, kloroform ve 56°C s›cakl›¤a 60 dk’dan daha fazla dayanabilir-ler. Parvovirus genomu lineer, tek sarmall›, mole-kül a¤›rl›¤› 1.5-1.8x106 Dalton olan DNA mole-külü içerir. ‹ki yap›sal (VP1 ve VP2) ve bir yap›-sal olmayan (NSP) proteini bulunmaktad›r. VP1
ve VP2 proteinleri kapsid yap›s›nda yer almakta olup, VP2 major komponenttir. Virus replikasyon için eritropoietik hücreleri tercih eder. Parvovirus-lar genelde bölünen hücreler replike olurParvovirus-lar ve eritroid progenitör hücrelerde litik reaksiyonlara yol açarlar (2,3).
HPVB19 tüm dünyada yayg›nd›r. En s›k okul ça¤› çocuklar›nda (5-15 yafl) görülse de tüm yafl grup-lar›nda görülebilmektedir. Eriflkinlerin %65’i HPVB19 infeksiyonu geçirmifltir. HPVB19 genel-likle solunum sistemi kaynakl› sekresyonlarla bu-laflmaktad›r. Ev içi temas ve okul salg›nlar› yay-g›nd›r. Kan ve kan ürünleri ile bulafl ayr›ca p›ht›-laflma faktör konsantreleri de yüksek bulafl riski tafl›-maktad›rlar. Bu nedenle hemofili hastalar› s›k infek-te olabilmekinfek-tedirler. Aplastik kriz nedeniyle hastane-ye kabul edilen hemolitik anemili hastalar viremik fazda olup, solunum yollar› sekresyonlar›nda B19 virusu tafl›rlar dolay›s›yla bulaflt›r›c›d›rlar. Vertikal bulafl yoluyla hidrops fetalis görülebilmektedir. Ge-belerde temasla fetal infeksiyon riski %33, fetal ölüm riski %9’dur. Virusla infekte olma durumunda Nilgün IfiIK( *), Ali A⁄AÇF‹DAN(*)
(*) ‹stanbul Üniversitesi, ‹stanbul T›p Fakültesi Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dal›, Viroloji ve Temel ‹mmünoloji Bilim Dal›, ‹stanbul
‹nsan Parvovirus B19 ‹nfeksiyonlar›n›n Tan›s›nda
Kulla-n›lan Moleküler Biyoloji Yöntemleri
ÖZET
‹nsan Parvovirus B19 (HPVB19) immun sistemi bask›lanm›fl hastalarda nötropeni ve kronik anemilere, fetal ölümlere, hemo-litik anemili hastalarda aplastik krizlere, yetiflkinlerde kronik artrite, ayr›ca eritema infeksiyozumu da içeren birçok sendro-ma sebep olsendro-maktad›r. Özellikle immun sistemi bask›lanm›fl hastalarda HPVB19 infeksiyonlar›n›n h›zl› tan›s› çok önemlidir. Son zamanlarda gelifltirilen moleküler biyoloji yöntemleri ile tan› kolaylaflm›flt›r.
Anahtar kelimeler: ‹nsan Parvovirus B19, moleküler biyoloji yöntemleri SUMMARY
Molecular Biological Methods in Diagnosis of Human Parvovirus B19 Infections
Human parvovirus B19 (HPVB19) causes several syndromes, including erythema infectiosum, chronic arthritis in adults, ap-lastic crisis in patient with hemolytic anemia fetal death and chronic anemia and neutropenia in immunosuppressed patients. The rapid diagnosis of HPVB19 infections is important, especially in immunosuppressed patients. The diagnosis has became easier by molecular biological methods which have been developed lately.
Türk Mikrobiyol Cem Derg (2003) 33: 377-380
378
en s›k gözlenen klinik tablo, genellikle çocuklarda, bazen de eriflkinlerde görülen beflinci hastal›k diye de adland›r›lan eritema infeksiyozum tablosudur (4). Eritema infeksiyozum (5. hastal›k): Daha çok çocuk-larda görülür. 4-14 günlük inkübasyon dönemi son-ras› atefl, titreme. Halsizlik, kas a¤r›lar ve kafl›nt› gi-bi klinik belirtiler oluflur. IgM saptand›ktan yaklafl›k bir hafta sonra IgG’ler oluflur. ‹nfeksiyonun 17. gü-nünden itibaren yanaklarda eritemli sanki tokatlan-m›fl gibi görünen döküntüler, ayn› zamanda da vücu-dun di¤er bölümlerinde de görülebilir. Döküntüler 2-3 gün sonra sekelsiz kaybolur. Virus eritema infeksi-yozum yan› s›ra; B19 artropatisi, geçici aplastik kriz, ba¤›fl›kl›k yetmezli¤i olan hastalarda özellikle anemi ve trombositopeni, gebelerde ölü do¤um, düflük ve hidrops fetalise yol açar.
Afl› ile ilgili çal›flmalar devam etmektedir, kültürde üretilemez. Korunma önlemleri özellikle kronik he-molitik anemisi olan, immun yetmezlikli hastalar ile ba¤›fl›k olmayan gebelere uygulanmal›d›r. Gebe sa¤-l›k personelinin bu hastalarla temas› önlenmelidir. ‹ntravenöz immunglobulin kullan›m›yla immun yet-mezlikli hastalarda, viremide azalma ve k›rm›z› hüc-re say›lar›nda art›fl görülmüfltür. Tan› HPVB19 IgM ya da viral DNA saptanmas›yla olmaktad›r. HPVB19 IgG ve IgM antikorlar›n›n tespitinde ELISA ve RIA teknikleri, viral DNA saptanmas›nda ise moleküler biyoloji yöntemlerinden s›kl›kla yararlan›lmaktad›r. PCR, hibridizasyon tekniklerinden daha duyarl›d›r. Elektron mikroskobisiyle serum ve dokulardaki B19 virusu (viremik fazda) saptanabilmektedir. HPVB19 infeksiyonu tan›s›nda kullan›lan birçok yöntem var-d›r. Bu yöntemler kullan›larak ya antijen antikor ta-yini ya da viral DNA tata-yini yap›lmaktad›r (5-8). Antijen ve Antikor Tayininde Kullan›lan Yöntem-ler
‹mmunoelektronmikroskopi (IEM) tekni¤i tan›da kullan›lmakta ancak maliyeti yüksek aletler gerektir-mektedir ve az say›da klinik örne¤in taranmas›na el-verifllidir. Bu nedenle antijen ve antikor tayininde s›kl›kla ELISA ve RIA teknikleri kullan›lmaktad›r. Bazen Dot-Blot Hibridizasyon yöntemi de kullan›l-maktad›r. HPVB19’a özgül IgM antikorlar›, viremi-nin bafllamas›ndan yaklafl›k 3-5 gün sonra IgG ise bir hafta sonra saptanabilir. HPVB19’a özgül IgM anti-korlar› bir ay boyunca artmaya devam eder ve 1.5-3
ay içinde kaybolur. IgG ise hayat boyu serumda bu-lunur (5,6).
HPVB19 Tan›s›nda Kullan›lan Moleküler Biyolo-ji Yöntemleri
Moleküler biyoloji yöntemleri ile serumdan, parafin preparatlardan, solunum sekresyonlar›ndan, kemik ili¤inden, dalak, amniotik s›v› ve çeflitli fetal organ-lardan HPVB19 DNA’s› saptanabilir. Moleküler bi-yoloji yöntemlerinden Dot-Blot Hibridazasyon yön-teminde, tayin limiti en fazla 104 kopyad›r. Bu da testin orta düzeyde viremi tayini yapabilece¤ini gös-termektedir. Hibridizasyon ile saptama ELISA plak-lar›nda yap›lmakta ve bu yöntemin Dot-Blot Hibridi-zasyon testine göre daha spesifik oldu¤u bildirilmifl-tir. In Situ Hibridizasyon (ISH) tekni¤i ile B19 virus lokalizasyon bölgeleri hücrelerde gösterilebilir. Böy-lelikle infekte hücrelerde morfolojik yap› ve molekü-ler yap› iflbirli¤i sa¤lan›r. ISH özellikle kemik ili¤i hücrelerine, amniotik s›v› hücrelerine ve fetal doku örneklerine yap›lmaktad›r. Bu nedenle her örnekte HPVB19 DNA’s› araflt›r›lmas›na uygun de¤ildir (3,6,9).
Bu teknikler göz önüne al›nd›¤›nda aç›kça PCR, HPVB19 DNA tayininde en duyarl› yöntemdir. Her türlü örnek kullan›labilmektedir. Tüm moleküler bi-yolojik yöntemlerde, kontaminasyonun önlenmesi için test s›ras›nda uyulmas› gerekli kurallara (steril alet ve ortamlar›n kullan›lmas›, laminer kabinlerin kullan›lmas› gibi rutin PCR laboratuvar önlemleri) dikkat edilmelidir. Hibridizasyon yöntemlerine göre PCR ile viremi uzun süreli takip edilebilir. Özellikle persistan infeksiyonlar ve maternal infeksiyonlar›n tespitinde kullan›lmaktad›r. PCR ile kantitatif olarak DNA miktar tayini de yap›labilmektedir. HPVB19 DNA miktar tayininde kullan›lan de¤iflik PCR çeflit-leri de bulunmaktad›r. Bunlar; Single-Step PCR, Nested PCR, PCR-ELISA ve Real-time PCR’d›r. Single-Step PCR, iki oligonükleotid primer kullan›-larak tek aflamada iflaretli internal probla hibridize olan hedef bölgenin ço¤alt›lmas›na dayan›r. Nested PCR’da, iki set “primer”da iki aflamal› PCR yap›la-rak daha spesifik bölgeler ço¤alt›l›r, Nested PCR du-yarl›l›¤› tek basamakl› PCR’dan 10-100 kat fazlad›r. PCR-ELISA’da ise hibridizasyon aflamas› ELISA plaklar›nda immunoenzimatik reaksiyonla gerçek-lefltirilir. Hedef ve internal standartlar ayn› set
“pri-379 mer”la amplifiye edilir (3,6,9).
Real-time PCR sistemlerinde bugüne kadar yap›lan çal›flmalar HPVB19 DNA’s›n›n kantitatif tayininde kullan›lacak en duyarl› ve özgül test oldu¤unu gös-termifltir. Testte kullan›lan ekzojen internal kontrol-lerle oluflabilecek yanl›fl negatif sonuçlar engellen-mifl olur. Ayr›ca testte miktarlar› bilinen standartlar kullan›larak ve amplifikasyonun her döngüsü moni-törde takip edilebilmektedir. Testte kontaminasyon oran› di¤er PCR’lara oranla çok daha azd›r. Ayr›ca sistemde s›cakl›¤› h›zla artt›r›p so¤utma ifllemi, or-tam havas›n›n ›s›t›l›p so¤utulmas›yla oldu¤u için döngüler aras› zaman çok k›sad›r ve böylelikle test sonuçlar› k›sa sürede al›n›r. Testin de¤erlendirilmesi s›ras›nda oluflmufl primer-dimer veya inhibisyonlar›n alette görülebilmesi mümkündür. Ayr›ca PCR döngü oran› testin herhangi bir an›nda artt›r›labilir. Tüm bunlar Real-time PCR avantajlar›ndand›r. Hem fetal hem maternal örnekler, kan ve kan ürünleri, plazma konsantreleri gibi çoklu örneklerin taranmas›na uy-gun bir yöntemdir. HPVB19 infeksiyonlar›n›n tan›-s›nda kullan›lan tüm bu moleküler biyoloji testleri-nin özellikleri yan› s›ra tan›da en önemli etkenlerden biri de hastan›n immun durumudur. E¤er sa¤l›kl› ki-fli ise antikor yan›t› iyi olabilece¤inden serolojik test-ler dahi tan›da çok önemlidir. Fakat immun yetmez-likli hastalarda bu durum daha farkl›d›r. Özellikle bu hasta gruplar›nda önemli komplikasyonlar (aplastik kriz, hemolotik anemi) olabildi¤inden ve hastalar›n antikor yan›tlar› güçlü olmad›¤› için erken tan› ama-c›yla PCR kullan›lmaktad›r (3,6,9,10). HCV, HBV ve HIV gibi viruslar›n, kan ve plazma taramalar›nda tespit edilmesi için gelifltirilmifltir. Nükleik Asit Amplifikasyon Tekni¤i (NAT) ile kan ve plazma ha-vuzlar›nda tarama yap›l›rsa pencere dönemindeki olas› HCV, HBV ve HIV bulaflma riski %45-72 ora-n›nda azal›r. NAT ile düflük viremiler saptanabilir. Solvent deterjan yöntemi, ›s›tma ile virusun dekonta-minasyonu HCV, HBV, HIV için etkili, HPVB19 için etkisizdir. Çünkü HPVB19 ›s›ya dayan›kl› ve zarfs›z bir virustur. Pencere dönemi yoktur, akut faz çok k›-sad›r. Bu nedenle, HPVB19 içinde kan ve plazma ör-neklerinde NAT yap›lmas› önerilmektedir (‹mmun suprese hastalar, transfüzyon yap›lanlar, v.b.). HPVB19 DNA’s› 103 kopya/ml ise viremi geçebilir. <103 kopya/ml ise bulaflt›r›c› olmad›¤› bildirilmifltir (11,12).
HPVB19 ‹nfeksiyonlar› Tan›s›nda Kullan›lan Moleküler Biyoloji Yöntemleri ‹le ‹lgili Yap›lan Çal›flma Örnekleri
HPVB19 infeksiyon flüpheli hastalardan al›nan 95 serum örne¤i (anti-B19 IgM (+)) PCR ile test edilmifl %63 pozitiflik saptanm›flt›r (13).
PCR ve Dot-Blot Hibridizasyon testleri karfl›laflt›r›l-m›fl B19 DNA tayininde PCR’›n 104 kez daha duyar-l› oldu¤u saptanm›flt›r. PCR’da idrar, amniotik s›v›, plevral s›v› örnekleri kullan›lm›flt›r. Sonuç olarak, e¤er tek serum örne¤inde PCR çal›fl›lacak ise serolo-jik testlerle desteklenmesi gereklili¤i vurgulanm›flt›r (14).
HPVB19 infeksiyonlu hasta serum örnekleri ve kan mononükleer hücrelerinde Nested-PCR ile DNA ta-yini yap›lm›flt›r. %70 örnek pozitif bulunmufltur. In Situ Hibridizasyon yöntemiyle mononükleer hücre-lerde B19 lokalizasyonlar› tespit edilememifltir (15). Özellikle immun yetmezlikli hastalarda hastal›¤a ait semptomlar antikor üretimi öncesinde görüle-bildi-¤inden, DNA tespitinin önemli oldu¤u vurgulanmak-tad›r. DNA tespitinin bu hastalarda immunglobulin tedavisine bafllanabilmesi aç›s›ndan önemli oldu¤u bildirilmifltir (16).
Bir çal›flmada kan ve kan ürünleri ile plazma pulla-r›nda HPVB19 DNA’s›n›n araflt›r›lmas› gerekti¤i ve rutin tan› testleri aras›na girmesinin yararlar›ndan bahsedilmifltir. Böylelikle tüm kan ve faktör ekstre-lerinin PCR ile taranmas›n›n gereklili¤i vurgulan-m›flt›r (17).
Real-time PCR ile HPVB19 DNA tayini yap›lan bir di¤er çal›flmada örneklerin IgM ve IgG’lerin negatif olsa bile PCR ile DNA’lar› tespit edilebilmifltir. PCR-ELISA testine göre Real-time PCR’›n befl kat daha h›zl› sonuç verdi¤i, ayr›ca PCR ile 4-6 ay bo-yunca DNA tayini yap›labilece¤i ve Real-time PCR tekni¤inin HPVB19 laboratuvar tan›s›ndan kullan›-lacak en duyarl› ve özgül yöntem oldu¤u vurgulan-m›flt›r (18).
HPVB19 DNA tayininde Real-time PCR kullan›m›y-la ilgili birçok çal›flmada özellikle immun yetmezlik-li hastalarda afl›lama ve transfüzyon ile immunglobu-lin tedavilerinin uygulanabilmesi için virusun DNA’s›n›n olmad›¤›n›n tespitinin duyarl› ve özgül testlerle yap›lmas› gerekti¤i bildirilmifltir (19). N. Ifl›k, A. A¤açfidan. ‹nsan Parvovirus B19 ‹nfeksiyonlar›n›n Tan›s›nda Kullan›lan Moleküler Biyoloji Yöntemleri
Türk Mikrobiyol Cem Derg (2003) 33: 377-380
380
Bultmann ve ark. (10) hematolojik hastal›klar›n bir-ço¤undan sorumlu patojenlerden biri olarak HPVB19’u bildirmifl ve HPVB19 DNA tespitinde moleküler biyoloji yöntemlerinin önemini vurgula-m›fllard›r.
Kan ve kan ürünleri, kemik ili¤i, plazma ekstreleri gibi örneklere yap›lan rutin tarama testleri aras›na, HPVB19 DNA’s›n›n moleküler biyoloji yöntemle-riyle araflt›r›lmas›n›n gereklili¤i, özellikle transfüz-yon yap›lan immunsuprese hasta guruplar›nda olufla-bilecek reinfeksiyonlar› önleme aç›s›ndan yararl› olaca¤› görülmektedir..
KAYNAKLAR
1. Cossart YE, Field AM, Cant B, Widdows D: Parvovi-rus-like particles in human sera. Lancet 1:72(1975) 2. Anderson MJ: Human Parvoviruses. “AJ Zucker-man, JE Banatvala, JR Pattison (eds): Principles and Practice of Clinical Virology”, p507 John Willey, New York (1987).
3. Clewley JP: PCR detection of Parvovirus B19. “DH Persing, T F Smith, FC Tenover, TJ White (eds): Diag-nostic Molecular Microbiology: Principles and Applicati-ons”, p367-72. American Society for Microbiology, Was-hington DC (1993).
4. Krugman S, Katz S, Wilford C, Gershon A: Infectious Disease of Children, p326-34, 9th ed. Mosby, St Louis (1998).
5. Fridell E, Cohen BJ, Wa h ren B: Evaluation of a synthe-tic-peptide enzyme-linked immunosorbent assay for immu-noglobulin M to human parvovirus B19. J Clin Microbiol 29:1376 (1991).
6. Clewley JP, Cohen BJ: Investigation of human parvovi-rus B19 infection using PCR. “JP Clewley (ed): The Poly-merase Chain Reaction (PCR) for Human Viral Diagnosis”, p205-215, CRC Press, London (1995).
7. Manaresi E, Gallinella G, Zuffi E, Bonvicini F, Zerbi-ni M, MusiaZerbi-ni M: Diagnosis and quantitative evaluation of parvovirus B19 infections by real-time PCR in the clinical laboratory. J Med Virol 67:275 (2002).
8. Saito T, Munakata Y, Fu Y, et al: Evaluation of anti-par-vovirus B19 activity in sera by assay using quantitative polymerase chain reaction. J Virol Methods 107:81 (2003). 9. Zerbini M, Gallinella G, Cricca M, Bonvicini F, Mu-siani M: Diagnostic procedures in B19 infection. Pathol Bi-ol 50:332 (2002).
10. Bultmann BD, Klingel K, Sotlar K, Bock CT, Kan-dolf R: Parvovirus B19: a pathogen responsible for more than hematologic disorders. Virchows Arch 442:8 (2003). 11. Tabor E, Epstein JS: NAT screening of blood and plas-ma donations: evolution of technology and regulatory po-licy. Transfusion 42:1230 (2002).
12. Brown KE, Young NS, Alving BM, Barbosa LH: Par-vovirus B19: implications for transfusion medicine. Sum-mary of a workshop. Transfusion 41:130-5 (2001). 13. Clewley JP: Polymerase chain reaction assay of parvo-virus B19 DNA in clinical specimens. J Clin Microbiol 27:2647(1989).
14. Koch WC, Adler SP: Detection of human parvovirus B19 DNA by using the polymerase chain reaction. J Clin Microbiol 28:65 (1990).
15. Patou G, Pillay D, Myint S, Pattison J: Characteriza-tion of a nested polymerase chain reacCharacteriza-tion assay for detec-tion of parvovirus B19. J Clin Microbiol 31:540 (1993). 16. Hicks KE, Beard S, Cohen BJ, Clewley JP: A simple and sensitive DNA hybridization assay used for the routine diagnosis of human parvovirus B19 infection. J Clin Micro-biol 33:2473 (1995).
17. Aubin JT, Defer C, Vidaud M, Maniez Montreuil M, Flan B: Large-scale screening for human parvovirus B19 DNA by PCR: application to the quality control of plasma for fractionation. Vox Sang 78:7 (2000).
18. Manaresi E, Gallinella G, Zuffi E, Bonvicini F, Zer-bini M, Musiani M: Diagnosis and quantitative evaluation of parvovirus B19 infections by real-time PCR in the clini-cal laboratory. J Med Virol 67:275 (2002).
19. Harder TC, Hufnagel M, Zahn K, Beutel K, Schmitt HJ, Ullmann U, Rautenberg P: New LightCycler PCR for rapid and sensitive quantification of parvovirus B19 DNA guides therapeutic decision-making in relapsing infections. J Clin Microbiol 39:4413 (2001).
