Biyolojik bilimlerde RNA izolasyonu konusunda deneysel rehber materyal hazırlanması

BĠYOLOJĠK BĠLĠMLERDE RNA ĠZOLASYONU KONUSUNDA DENEYSEL REHBER MATERYAL HAZIRLANMASI

BĠLGE KOCAYĠĞĠT BAYEZĠT

YÜKSEK LĠSANS TEZĠ

ORTAÖĞRETĠM FEN VE MATEMATĠK ALANLAR EĞĠTĠMĠ ANABĠLĠMDALI

BĠYOLOJĠ ÖĞRETMENLĠĞĠ BĠLĠMDALI

GAZĠ ÜNĠVERSĠTESĠ

EĞĠTĠM BĠLĠMLERĠ ENSTĠTÜSÜ

AĞUSTOS, 2014

i

TELĠF HAKKI ve TEZ FOTOKOPĠ ĠZĠN FORMU

Bu tezin tüm hakları saklıdır. Kaynak göstermek koĢuluyla tezin teslim tarihinden itibaren ...(….) ay sonra tezden fotokopi çekilebilir.

YAZARIN

Adı: Bilge

Soyadı: KOCAYĠĞĠT BAYEZĠT

Bölümü: Ortaöğretim Fen ve Matematik Alanlar Eğitimi Anabilim Dalı Biyoloji Öğretmenliği

Ġmza :

Teslim tarihi: 30.12.2014

TEZĠN

Türkçe Adı: Biyolojik Bilimlerde RNA Ġzolasyonu Konusunda Deneysel Rehber Materyal Hazırlanması

Ġngilizce Adı: Preparing Experimental Guide Materials about RNA Isolation of the Biological Sciences

ii

ETĠK ĠLKELERE UYGUNLUK BEYANI

Tez yazma sürecinde bilimsel ve etik ilkelere uyduğumu, yararlandığım tüm kaynakları kaynak gösterme ilkelerine uygun olarak kaynakçada belirttiğimi ve bu bölümler dıĢındaki tüm ifadelerin Ģahsıma ait olduğunu beyan ederim.

Yazar Adı Soyadı: Bilge KOCAYĠĞĠT BAYEZĠT

iii Jüri onay sayfası

Bilge Kocayiğit Bayezit tarafından hazırlanan “Biyolojik Bilimlerde RNA izolasyonu Konusunda Deneysel Rehber Materyal Hazırlanması” adlı tez çalıĢması aĢağıdaki jüri

tarafından oy birliği / oy çokluğu ile Gazi Üniversitesi Ortaöğretim Fen ve Matematik Alanları Eğitimi Anabilim Dalı‟nda Yüksek Lisans / Doktora tezi olarak kabul edilmiĢtir.

DanıĢman: Prof.Dr. Figen ÜNLÜ ERKOÇ

(OFMA Anabilim Dalı, Gazi Üniversitesi) ………

BaĢkan: (Unvanı Adı Soyadı)

(Anabilim Dalı, Üniversite Adı) ………

Üye: (Unvanı Adı Soyadı)

(Anabilim Dalı, Üniversite Adı) ………

Üye: (Unvanı Adı Soyadı)

(Anabilim Dalı, Üniversite Adı) ………

Üye: (Unvanı Adı Soyadı)

(Anabilim Dalı, Üniversite Adı) ………

Tez Savunma Tarihi: …../…../……….

Bu tezin Ortaöğretim Fen ve Matematik Alanları Eğitimi Anabilim Dalı‟nda Yüksek Lisans/ Doktora tezi olması için Ģartları yerine getirdiğini onaylıyorum.

Unvan Ad Soyad

Eğitim Bilimleri Enstitüsü Müdürü

iv

TEġEKKÜR

Tez çalıĢmamın her aĢamasında görüĢ ve önerileri ile bana yol gösteren, hiçbir aĢamada desteğini esirgemeyen, engin tecrübelerinden faydalanmama izin veren, çalıĢma etiği ve özdisiplini ile ayrıca örnek aldığım tez danıĢmanım Prof. Dr. Figen ÜNLÜ ERKOÇ‟a teĢekkürü borç bilirim.

Tezin güvenirlik ve nicel verilerin analizi konusunda görüĢlerinden ve bilgilerinden yararlandığım Doç. Dr.AyĢe Dilek ÖZġAHĠN KĠRECÇĠ, Egemen FOTO, Hızlan Hıncal AGUġ, Selin ÖZKAN, ArĢ. Gör. Kenan KONUR hocalarıma ve biyoloji öğretmenlerine teĢekkürlerimi sunuyorum. Tez çalıĢmam sırasında bana değerli görüĢleri, bilgi ve deneyimleriyle destek olan Doç.Dr. Gülçin AKÇA hocama teĢekkürlerimi sunuyorum. Tezin deneylerini uygulama aĢamasında yanımda olan sevgili arkadaĢım Pınar ARSLAN‟a teĢekkür ediyorum.

Ayrıca sonsuz destek ve sevgileri için aileme ve eĢime teĢekkür ediyorum.

Bu araĢtırma Gazi Üniversitesi Bilimsel AraĢtırma Fonunun 04/2011-41 kodlu projesi olarak kısmen desteklenmiĢtir. Katkılarından dolayı Gazi Üniversitesi Rektörlüğü‟ne teĢekkür ederim.

v

BĠYOLOJĠK BĠLĠMLERDE RNA ĠZOLASYONU KONUSUNDA

DENEYSEL REHBER MATERYAL HAZIRLANMASI

Yüksek Lisans Tezi

Bilge Kocayiğit Bayezit

GAZĠ ÜNĠVERSĠTESĠ

EĞĠTĠM BĠLĠMLERĠ ENSTĠTÜSÜ

Ağustos 2014

ÖZ

Bu araĢtırmada, biyoloji ögretmenlerinin ve uzmanların RNA izolasyonu ile ilgili arastırmacı tarafından hazırlanan deneysel materyale iliĢkin görüslerinin incelenmesi amaçlanmıĢtır.

AraĢtırmada ilk olarak DNA‟nın moleküler yapısına göre daha çok hassas olan RNA ile çalıĢılması kararlaĢtırılmıĢtır. RNA‟nın yapısı ve RNA izolasyonu ile ilgili yurt içi ve yurt dıĢı kaynaklar ve diğer belgeler internet ve kütüphane yoluyla taranarak moleküler biyoloji konusunda gerekli bilgiler toplanmıĢ, metodlar geliĢtirilmiĢ, metodlar denenmiĢ ve sonuçlar kaydedilmiĢtir. Metodlar geliĢtirilirken herhangi bir üniversitedeki laboratuvar koĢulunda temin edilebilecek malzemelerin seçilmesi dikkate alınmıĢ ve deneyin yapım aĢamaları görsellerle zenginleĢtirilmiĢtir. Yukarıda metodları verilen deneyler Trizol® ayıracı metodu, Sıcak fenol metodu ve Guanidinyumlu metod olmak üzere üç ayrı föy Ģeklinde düzenlenmiĢ, uzman görüĢüne göre revize edilmiĢ ve uygulama föyleri ile CD hazırlanmıĢtır.

AraĢtırmanın ikinci aĢamasında araĢtırmanın çalıĢma grubunu oluĢturan Ankara‟da görev yapan 4 biyolojik bilimler uzmanı ve 10 biyoloji öğretmeninin hazırlanan föylere iliĢkin görüĢleri alınmıĢtır. AraĢtırmanın verileri araĢtırmacı tarafından hazırlanan bir görüĢme

vi

formu aracılığı ile çalıĢma grubunda yer alan öğretmenlerle yarı yapılandırılmıĢ görüĢme yapılarak toplanmıĢtır. Tüm veri materyali iki araĢtırmacı tarafından birbirinden bağımsız olarak kodlanmıĢ ve daha sonra sonuçlar karĢılaĢtırılarak Miles ve Huberman‟ın güvenirlik katsayısı hesaplama formülü kullanılmıĢtır. Yapılan hesaplama sonucu güvenirlik katsayısı değeri 0,72 olarak bulunmuĢtur.

AraĢtırmanın sonuçlarına göre eğitimci ve uzmanların geliĢtirilen rehber materyalin kullanılabilirliğinin yüksek olduğunu, eğitimci ve uzmanlar, farklı biyolojik bilimlere direkt veya küçük değiĢiklikler yapılarak uygulanabileceğini tespit etmiĢlerdir. Deneysel rehber materyallerin moleküler biyoloji öğretiminde kullanılmasının kalıcı ve etkili öğrenmeye büyük faydası olacağı düĢünülmektedir.

Bilim Kodu : 101

Anahtar Kelimeler : Biyolojik bilimler, RNA izolasyonu, rehber materyal Sayfa Adedi : 143

vii

PREPARING EXPERIMENTAL GUIDE MATERIALS ABOUT RNA

ISOLATION OF THE BIOLOGICAL SCIENCES

M.S Thesis

Bilge Kocayiğit Bayezit

GAZI UNIVERSITY

GRADUATE SCHOOL OF EDUCATIONAL SCIENCES

August 2014

ABSTRACT

In this study it is aimed to examine the opinions of the biology teachers and experts who participated in the study, on the experimental material regarding RNA isolation, as prepared by the relevant researcher.

It is initially determined in the study to work with RNA, which is more sensitive compared to the molecular structure of DNA. Relevant data in molecular biology have been collected through scanning domestic and foreign sources and other documents on the structure of the RNA and RNA isolation, via internet or libraries, methods have been developed, methods have been experimented and results have been recorded. Selection of materials which may be obtained in any laboratory environment of any given university have been taken into consideration while developing methods and implementation phases of the experiment have been enriched by means of visuals. The experiments, methods of which have been provided above, have been arranged in three separate leaflets, which are, Trizol® reagent method, Hot phenol method and Guanidinium thiocyanate method, they have been revises in accordance with the expert opinion and implementation leaflets and a CD have been prepared.

viii

In the second phase of the study, the study group is composed of 4 biologic science experts and 10 biology teachers who are serving in Ankara. The leaflets prepared have been submitted to the study group and opinions of the study group on the topic have been obtained. Study data have been collected through semi-structured interviews with the teachers who are in the study group, by means of an interview form prepared by the researcher. All the data materials have been encoded by two researchers independently, and then the results have been compared and Miles and Huberman‟s reliability coefficient calculation formula have been used. The reliability coefficient value has been found to be 0,72, as a result of the calculation made. As per the results of the study, the educators and experts have determined that usability of the guide material is high, and that it may be applied to different biological sciences directly or after minor changes. It has been determined that use of experimental guide materials in molecular biology education will have great benefits for permanent and effective learning.

Science Code :101

Key Words :Biologic sciences, RNA isolation, guide material Page Number :143

ix

ĠÇĠNDEKĠLER

TABLOLAR LİSTESİ ... xiv

ŞEKİLLER LİSTESİ ... xv KISALTMALAR ... xviii GİRİŞ ... 1 1.1. Problem Durumu ... 4 1.2. Araştırmanın Amacı ... 4 1.3. Araştırmanın Önemi ... 5 1.4. Varsayımlar ... 6 1.5. Araştırmanın sınırlılıkları ... 6 1.6. Tanımlar ... 6 1.7. İlgili Araştırmalar ... 7

1.7.1.Biyoloji Konularının İşleyişinde Uygulamalı Öğretim ve Rehber Materyal Üzerine Yapılan Çalışmalar ... 7

1.7.2. Biyolojik Bilimlerde Kullanılabilecek RNA İzolasyonu Bazlı Prosedürlere ilişkin Araştırmalar ... 9

KAVRAMSAL ÇERÇEVE ... 21

2.1.Biyoloji Öğretiminde Kullanılan Öğretim Yöntemleri ve Öğretim Teknikleri ... 21

2.1.1. Laboratuvar Tekniği ... 21

2.1.1.1. Kapalı Uçlu Deneylerle Laboratuvar Tekniği ... 21

2.1.1.2. Açık Uçlu Deneylerle Laboratuvar Tekniği ... 22

2.1.1.3. Hipotez Test Etme Deneyleri ... 22

x

2.2.Genetik Yapı ve Genetik Mühendisliğinde Kullanılan Teknikler ile ilgili Genel Bilgi ... 22

2.2.1. Nükleik Asitler ... 22

2.2.2. DNA’nın Keşfi, Yapısı ve İşlevi ... 23

2.2.3. RNA’nın Yapısı ve İşlevi... 23

2.2.4.Protein Sentezi ... 27

2.2.5. Gen , Gen İfadesi, Gen İfadesinin bulunması aşamasında yapılan araştırmalar ... 28

2.2.5.1. Gen ... 28

2.2.5.2. Gen İfadesi ... 28

2.2.5.3. Gen İfadesinin bulunması aşamasında yapılan araştırmalar ... 28

2.2.6. Biyoteknoloji ve Genetik Mühendisliği ... 30

2.2.6.1. Gen terapisi ( Gen Tedavisi)... 30

2.2.6.1.1. Exvivo Gen Tedavisi ... 30

2.2.6.1.2. In vivo Gen Tedavisi ... 30

2.2.6.2. Ökaryotlarda rekombinant DNA Teknolojisinin kullanımı ... 31

2.2.6.2.1. İnsülin Üretimi ... 31

2.2.6.2.2. Hayvanlarda Farmosötik Ürünler Üretimi ... 31

2.2.6.2.3. Herbisitlere Dayanıklı Kültür Bitkileri ... 31

2.2.6.2.4. Rekombinant Aşılar ... 32

2.2.6.2.5. Adli Tıpta Kullanımı ... 32

2.2.6.2.6. Antisens Teknolojisi ... 32

2.2.6.3. DNA izolasyonu ... 32

2.2.6.3.1. DNA’nın kesilmesi ve Restriksiyon Enzimleri ... 33

2.2.6.3.2. DNA’nın Birleştirilmesi ve DNA Ligazlar ... 34

2.2.6.3.3. Klonlama Vektörleri ... 34

2.2.6.3.4. DNA Kütüphaneleri ... 35

2.2.6.3.5. DNA Kütüphanelerinden Spesifik Dizilerin Bulunması ... 36

2.2.6.4. RNA İzolasyonu ... 37

2.2.6.4.1. Niçin RNA ile çalışılmalı? ... 37

2.2.6.4.2. RNA İzolasyon Stratejileri ... 38

2.2.6.4.3. RNA Saflaştırmasındaki Hedefler ... 39

2.2.6.4.4. RNA izolasyonu ve Saflaştırılması: ... 41

2.2.6.4.5. Jelin kontrolü: ... 42

xi 2.2.6.4.7. Reverse transkriptaz ... 43 2.2.6.4.8. RNAi ve siRNA ... 44 2.2.6.5. PCR ... 44 2.2.6.6. Elektroforez ... 46 2.2.6.6.1. Elektroforez Çeşitleri ... 47

2.2.6.7. RNA Fragmentlerinin Kalite ve Fragment Analizi ... 54

2.2.6.7.1. Spektrofotometrik Metodlar ... 54 YÖNTEM ... 59 3.1. Araştırmanın Modeli ... 59 3.2. Evren ve Örneklem ... 59 3.3. Verilerin Toplanması ... 59 3.4. Verilerin Hazırlanması ... 62 3.5. Verilerin Analizi ... 63 3.6. Deney Protokolleri ... 64

3.6.1.Total RNA İzolasyonu (17.01.2012) ... 64

3.3.1.1. Materyaller ... 64

3.6.1.2 Hazırlık ... 64

3.6.1.3. İzolasyona başlarken ... 67

3.6.1.4. Total RNA İzolasyonu Metodu ... 71

3.6.1.5. Saflık Kontrol Tekniği ... 77

3.6.1.6. Nükleik asit konsantrasyonunu belirleme ... 77

3.6.1.7. Elektroforezde RNA fraksiyonları izleme ... 78

3.6.2. Sıcak Fenolle RNA İzolasyonu (Hot Phenol RNA Isolation) ... 79

3.6.2.1. Materyal ... 79

3.6.2.2. Metod ... 80

3.6.2.3. Saflık Kontrol Tekniği ... 83

3.6.2.4. Elektroforezde RNA fraksiyonları izleme ... 83

3.6.3. Guanidinyum Tiyosiyanat-Fenol-Kloroform ile Basit RNA İzolasyon Adımları (The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: Chomcsynski, P. & Sacchi, N.,2006). ... 83

3.6.3.1. Materyal ... 83

3.6.3.2. Hazırlık ... 84

3.6.3.2.1.Homojenizasyon ... 84

xii

3.6.3.3.1. İlk çöktürme ... 86

3.6.3.3.2. İkinci çöktürme ... 86

3.6.3.3.3. RNA Yıkama ... 86

3.6.3.3.4. RNA Çözme ... 87

3.6.3.4.RNA’nın miktarını belirleme ... 87

3.6.3.5. Guanidinyumlu metodla izole edilen RNA’ların elektroforezde RNA fraksiyonları izleme ... 88

BULGULAR VE YORUM ... 89

4.1.Deney Protokolleri ve Sonuçları ... 89

4.1.1.Spektrofotmetre Bulgu ve Yorumu ... 89

4.1.1.1. Trizol® Reagent ile İzole Edilen RNA’ların Spektofotometre Bulguları ve yorumları ... 89

4.1.1.1.1. Tablo 6’nın bulguları ... 90

4.1.1.1.2.Tablo 7’ nin bulguları ... 91

4.1.1.1.3. Tablo 8’ in bulguları ... 92

4.1.1.2. Sıcak Fenol RNA Metodu ile İzole Edilen Numunelerin Spektrofotometre Bulgu ve Yorumları ... 93

4.1.1.2.1. Tablo 9’un bulguları ... 93

4.1.1.2.2. Tablo 10’un bulguları ... 94

4.1.1.2.3. Tablo 11’in bulguları ... 95

4.1.1.3. Guanidinyum Tiyosiyanat ile İzole Edilen RNA’ların Spektrofotometre Bulgu ve Yorumları ... 96

4.1.1.3.1. Tablo 12’nin bulgu ve yorumları... 96

4.1.1.3.2. Tablo 13’ün bulgu ve yorumları ... 97

4.1.2. RNA Fraksiyonlarının Elektroforez Bulgu ve Yorumu ... 98

4.1.2.1. Trizol® Reagent ile İzole Edilen RNA’ların Fraksiyonlarının Elektroforezdeki Bulgu ve Yorumları ... 98

4.1.2.1.1. Şekil 49. Yorumları ... 98

4.1.2.1.2. Şekil 50. Yorumları ... 99

4.1.2.1.3. Şekil 51. Yorumları ... 100

4.1.2.2. Sıcak Fenol RNA Metodu ile İzole Edilen RNAların Fraksiyonlarının Elektroforezdeki Bulgu ve Yorumları ... 101

4.1.2.2.1. Şekil 52. Yorumları ... 101

4.1.2.2.2. Şekil 53. Yorumları ... 102

xiii

4.2. Nitel Araştırma Sonucu Elde Edilen Bulgular ve Uzman Görüşlerinin Yorumu ... 105

4.2.1. Moleküler Biyoloji Öğretiminde Karşılaşılan Güçlüklerle İlgili Uzman Görüşleri ... 107

4.2.2. Deneysel Materyallerin Moleküler Biyoloji Tekniklerinin Öğretilmesinde Kalıcı ve Etkili Öğrenme Verimine Etkileri ile İlgili Uzman Görüşleri ... 110

4.2.3. Hazırlanan Deneysel Materyalde Görülen Eksiklikler, Eklenebilecek Diğer Deney ve Teknikler ile İlgili Uzman Görüşleri ... 113

4.2.4. Deneysel Materyalin Birlikte Kullanılabileceği Diğer Öğretim Yöntemleri ile İlgili Uzman Görüşleri ... 115

4.2.5. Deneysel Materyalin Uygulanabilirliği, Kullanılabilirliği, Biyolojik Bilimlerin Değişik Alanlarına Uygunluğu ile İlgili Uzman Görüşleri ... 118

4.2.6. Deneysel Materyal Hakkında Uzman ve Öğretmenlerin Önerileri ... 120

SONUÇ VE ÖNERİLER ... 123 5.1 Sonuç ... 123 5.2 Öneriler ... 127 KAYNAKÇA ... 129 EKLER ... 135 EK-1 ... 135 EK-2 ... 137 EK-3 ... 138

xiv

TABLOLAR LĠSTESĠ

Tablo 1. RNA ÇeĢitleri... 24

Tablo 2. Rekombinant DNA Teknolojisinde Yaygın Olarak Kullanılan Bazı Restriksiyon Enzimleri ... 34

Tablo 3. DNA molekülünün büyüklüğüne göre agaroz konsantrasyonun ayarlanması... 51

Tablo 4. Nükleik asit saflığının stratejik belirteçleri... 56

Tablo 5. Kısaltmalar... 62

Tablo 6. Trizol® metodu ile izole edilen RNA numunelerinin spektrofotometre sonuçları... 90

Tablo 7. Trizol® metodu ile izole edilen RNA numunelerinin spektrofotometre sonuçları... 91

Tablo 8. Trizol® metodu ile izole edilen RNA numunelerinin spektrofotometre sonuçları... 92

Tablo 9. Sıcak Fenol RNA izolasyonu saflık sonuçları... 93

Tablo 10. Sıcak Fenol RNA izolasyonu saflık sonuçları... 94

Tablo 11. Sıcak Fenol RNA izolasyonu saflık sonuçları... 95

Tablo 12. Guanidinium thiocyanate RNA izolasyonu saflık sonuçları... 96

Tablo 13. Guanidinium thiocyanate RNA izolasyonu saflık sonuçları... 97

Tablo 14. Uzman ve eğitimciler görüĢmelerin analizi sonucu elde edilen kategori ve kodlar...105

xv

ġEKĠLLER LĠSTESĠ

ġekil 1. tRNA‟ nın yapısı... 25

ġekil 2. Protein sentezi.. ... 27

ġekil 3. RNA‟ nın jelde yürüme görüntüsü... 42

ġekil 4. Elektroforez tankı... 48

ġekil 5. Güç kaynağı... 48

ġekil 6. Jellerin hazırlandığı cam plaklar... 48

ġekil 7. Jeldeki örnek yükleme kuyularını oluĢturan taraklar ... 48

ġekil 8. Jel kasedi ve standı... 48

ġekil 9. Jelin cam plaklar arasına yerleĢtirilmesi... 49

ġekil 10. Tankın güç kaynağına bağlanması... 49

ġekil 11. Coomassie Brilliant Blue ile boyandıktan sonra fiksatife alınmıĢ jel görüntüsü ... 50

ġekil 12. Agarozun görüntüsü ... 50

ġekil 13. Yatay elektroforez tankı... 51

ġekil 14. BoyanmıĢ agaroz jel görüntülemesi... 52

ġekil 15. Yatay elektroforezde jelde yürütülmüĢ RNA görüntüsü... 53

ġekil 16. Etidyum bromürle boyanmıĢ agaroz jel görüntüsünde DNA fragmentleri... 54

ġekil 17. Steril edilmiĢ malzemeler... 65

ġekil 18. Azot tankı, mikropipetler, hazırlanmıĢ çözeltiler, steril edilmiĢ pipet uçları... 65

ġekil 19. Trizol® deneyi için hazırlanmıĢ çözeltiler ve mikropipetler... 66

ġekil 20. OtoklavlanmıĢ pipetuçları, % 70‟ lik alkol ile tezgahın steril edilmesi... 66

ġekil 21. Steril edilmiĢ malzemenin yanmayan yağıtlardan çıkarılması... 66

xvi

ġekil 23. Karaciğer parçasının sıvı azot yardımıyla ezilmesi... 68

ġekil 24. Karaciğer parçasının nemlendirmeden havanelini sağa sola çevirerek ezilmesi... 68

ġekil 25. Karaciğer parçasının un ufak hale getirilmesi... 69

ġekil 26. Ependorf tüpünün tartılması... 69

ġekil 27. Ependorf tüpünün darasının alınması... 70

ġekil 28. Darası alınan ependorf tüpüne ezilmiĢ numunenin ince uçlu spatula ile eklenmesi ve tartılması... 70

ġekil 29. Trizol® eklenmiĢ tüplerin buzda bekletilmesi... 72

ġekil 30. Numuneye izopropanol eklenmesi ... 72

ġekil 31. Vorteks... 72

ġekil 32. Numunenin vortekste düĢük hızda çalkalanması... 73

ġekil 33. Numunenin santrifüj aletine yerleĢtirilmesi... 73

ġekil 34. Santrifüjden çıkarılmıĢ fazlarına ayrılmıĢ numune... 74

ġekil 35. Santrifüjden sonra fazlarına ayrılmıĢ numune ... 74

ġekil 36. Isıtmalı karıĢtırıcıdaki numuneler... 76

ġekil 37. RNA‟nın spektrofotometredeki görüntüsü... 76

ġekil 38. RNA numunelerinin yatay elektroforezde yürütülmesi... 77

ġekil 39. Hazırlanan çözeltiler... 79

ġekil 40. Küçük ĢiĢeye alınmıĢ NaOAc... 80

ġekil 41. Su ile DoyurulmuĢ Fenolün Isıtılması... 80

ġekil 42. Isıtmalı karıĢtırıcıdaki numuneler... 80

ġekil 43. Santrifüj sonrası fazlarına ayrılmıĢ numuneler... 81

ġekil 44. Fazlarına ayrılmıĢ numunenin üst fazının baĢka bir ependorf tüpüne alınması ... 81

ġekil 45. Üst faza kloroform eklenmesi... 81

ġekil 46. Kloroformlu numunenin santrifüj cihazına yerleĢtirilmesi... 82

ġekil 47. Homojenizatör (Doku parçalayıcı)... 84

ġekil 48. Polipropilen tüplerde numune... 85

ġekil 49. 16.02.2012 tarihli solungaç dokusundan Trizol® ile izole edilen RNA‟ların jel görüntüleri... 98

ġekil 50. 28.02.2012 tarihli solungaç dokusundan Trizol® ile izole edilen RNA‟ların jel görüntüleri... 99

xvii

ġekil 51. 25.02.2013 tarihli solungaç ve karaciğer dokusundan Trizol® ile izole edilen RNA‟ların jel görüntüleri... 100 ġekil 52. 23.02.2012 tarihli solungaç dokusu jel görüntüsü... 101 ġekil 53. 22.03.2012 tarihli solungaç dokusu jel görüntüsü... 102 ġekil 54. Solungaç ve karaciğer dokularının guanidinyum tiyosiyanat metodu

xviii

KISALTMALAR

DNA : Deoksiribonükleikasit

RNA : Ribonükleikasit

PCR : Polymerase Chain Reaktion (Polimeraz zincir reaksiyonu)

RT-PCR : Real Time Polimerase Chain Reaktion (Gerçek zamanlı-Polimeraz zincir reaksiyonu)

mRNA : Messenger RNA (Mesajcı RNA)

cDNA : Complementary DNA (Tamamlayıcı DNA)

Rpm : Revolution per minute (dakikadaki devir sayısı)

dk : Dakika

s. : Saniye

CTAB : Setiltrimetilamonyum bromid

1

I.BÖLÜM

GĠRĠġ

Moleküler biyolojinin disiplinler arası özelliği, biyokimya, biyoteknoloji, farmakoloji, fizyoloji ve gen mühendisliği ile çok yakın iliĢkili olması, temel kimya kavramlarına yer yer dayanması ve son yıllarda moleküler biyoloji, moleküler genetik ve nanobilim ile giderek alanını geniĢletmesi moleküler biyoloji ve moleküler biyoloji laboratuvarı eğitiminde yeni yaklaĢımları gündeme getirmiĢ ve güncel uygulamaların kolay temin edilebilir malzeme, olanaklar ve standardize edilmiĢ DNA, RNA, protein izolasyon protokolları ile öğretilmesi ihtiyacını oluĢturmuĢtur. Yukarıda bahsedildiği gibi pek çok bilimsel araĢtırmada proteinlerin indüksiyonu yani gen ifadesinin tespiti istendiğinden, moleküler biyoloji konusunda uzmanlaĢmıĢ kiĢilere bağımlı ve ortak çalıĢmak gerekmektedir.

Biyolojik bilimlerin farklı alanlarında çalıĢan araĢtırıcılar RNA izolasyon protokollerine ulaĢmada ve bu protokolleri gerçekleĢtirme de bazı zorluklar yaĢamaktadır. Biyolojinin diğer dallarında çalıĢan bir çok bilim insanı RNaz‟ların varlığından, RNA‟nın çabuk kontamine olmasından, tek zincirli olmasından, stabilizasyonunun az olmasından dolayı izolasyon sırasında da bir çok sorun yaĢamaktadır. Bu tezle bu sorunlar tespit edilmiĢtir ve bu sorunların çözümlenmesi konusunda çalıĢılmıĢtır. Ayrıca Ġzole edilen RNA tipi ve doku çeĢidi arasındaki iliĢkiye de değinilmiĢtir. Bu sebeplerle bu tezde total RNA, mRNA gibi gen ekspresyonunun birinci basamağında elde edilmesi gereken bu moleküler yapılar için standardize protokoller hazırlanması amaçlanmıĢtır.

Tez kapsamında deney föyü halinde özellikle izolasyon sırasında hızlı ve kolay yıkıldığı, ortamdaki genomik DNA‟larla kolay kontamine olduğu için izolasyonu zor olan mRNA‟nın izolasyonu için moleküler biyoloji uzmanı olmayan kiĢilerin rahatlıkla temin

2

edebileceği standardize deney protokolları hazırlanmıĢtır. Hazırlanan eğitim materyalleri uzaktan öğretim, bilgisayar destekli öğretim ve web tabanlı öğretim yaklaĢımlarına uyarlanabilirdir ve böylece geniĢ bir araĢtırıcı, öğretim elemanı ve öğrenci grubunun eriĢimine açık olacağından çok yaygın kullanılabilir durumdadır.

Biyoloji teorik dersinin ve laboratuvarının deneysel özelliği ve ilgili diğer tarım, tıp, veteriner hekimlik, ormancılık, gıda, biyoteknoloji gibi ilgili alanların temelini oluĢturması ve multidisipliner alanlara katkısı, öğrenme için hem beceri hem temel bilgiler gerektirmesi biyoloji öğretiminde yalnızca bir öğretim stratejisinin uygulanmasıyla baĢarıya ulaĢılamayacağını göstermektedir.

Biyoloji öğretiminde kullanılan bazı metodlar: 1. Anlatım Yöntemi

2. Soru- Cevap Yöntemi 3. Problem Çözme Yöntemi 4. Laboratuvar Yöntemi

a. Gösteri (Demonstrasyon) Yöntemi b. Gözlem Yöntemi

c. Deney Yöntemi 5. TartıĢma Yöntemleri

a. Küme tartıĢması b. Münazara

c. Komisyon ve Komite çalıĢmaları d. Açık oturum (Panel)

e. Forum f. Sempozyum g. Seminer

h. DüĢünce taraması 6. Örnek olay incelemesi

3

Biyoloji laboratuvar öğretiminde bütün yaĢam bilimlerinde olduğu gibi, öğrencilerin yaparak-yaĢayarak öğrenmeleri en kolay laboratuvar ortamında gerçekleĢmektedir. Üniversite düzeyindeki teorik biyoloji dersleri; fizik, kimya, matematik ve istatistik temel bilgilerine sahip olmayı gerektirmekte; ayrıca alanın çok geniĢ olması biyolojinin öğrenilmesinde öğrenme problemlerine neden olmaktadır. Yukarıda bahsedildiği gibi biyoloji teorik dersleri ile laboratuvar deneylerinin paralel yürütülmesi zorunluluğu klâsik öğretim metodlarının yanısıra alternatif içeriklerin öbekler halinde düzenlendiği ve anlamlı bir bütünün parçalarını temsil ettiği modüler programlama yaklaĢımının benimsenmesini baĢarılı bir eğitim için gerekli kılmaktadır. Biyolojik bilimler öğretiminde laboratuvar kullanmanın ve uygulamalı çalıĢmaların öğrencilerde muhakeme yeteneklerini arttırdığı, görerek, yaparak-yaĢayarak öğrenmenin öğrencide kalıcı öğrenmeyi sağladığı, öğrencilerin el becerilerinin artmasına yardımcı olduğu ve öğrencilerinin özgüvenlerinin artmasına katkıda bulunduğu görülmüĢtür (ÖztaĢ vd., 2004). Köseoğlu ve Soran (2004) yaptıkları araĢtırma sonucunda öğretmen yeterliliklerinin öğrenci baĢarısını etkilediğini bildirmiĢlerdir.

Moleküler biyoloji deneysel bir bilim dalıdır; teorik dersi ve buna bağlı moleküler biyoloji laboratuvarı uygulamaları ülkemizde farklı fakülteler ve meslek yüksekokullarında öğretilmektedir. Biyolojik bilimlerdeki geliĢme eğiliminin bilimsel araĢtırmaların bir safhasında moleküler biyoloji teknikleri kullanılarak gen ekspresyonunun tespitini gerektirdiği bilinmektedir. Örnek vermek gerekirse biyokimya, farmakoloji/toksikoloji, fizyoloji, genetik, biyoteknoloji, gıda mühendisliği, agronomi, nanobilim ve çevre mühendisliği gibi alanlarda yapılan çalıĢmalarda hem sinyalleĢme yollarında hangi proteinlerin indüklendiği hem de çevre toksikolojisi gibi multidispliner alanlarda çevre kirleticilerinin hücre seviyesinde hangi hedef molekülleri etkilediği gen ekspresyonu çalıĢmaları ile gösterilmektedir.

Doğrudan proteinlerin indüksiyonunu gösteren Western Blot tekniği de (Farrell ve Ranallo, 2000) kullanılabilmekle beraber bu teknik pahalı monoklonal antikorlara ihtiyaç göstermekte; antikoru temin edilemeyen proteinlerin kalitatif indüksiyonunu göstermek mümkün olamamaktadır. Metodun temeli hücre patlatıldıktan sonra elde edilen ham protein karıĢımından istenilen proteini (enzim aktivitesi olan proteinler için kantitatif tayin metodları unite (U)/mg protein cinsinden reaksiyon hızı ile hesaplanabilmektedir) önce elektroforetik bir yöntem olan SDS-PAGE yöntemiyle ayrıĢtırılmasına, daha sonra da

4

çeĢitli blotloma teknikleri kullanılarak (elektro-, ya da kapiller blotlama) proteinleri ince bir nitroselüloz veya diğer adsorban malzemeye aktararak, burada çok spesifik primer ve sekonder antikorlar ile çöktürmek ve göstermeye dayanır. Diğer taraftan teknik uzmanlık gerektiren elektroforez ve blotlama sistemlerinin kullanılmasına dayandığından, sınırlı laboratuvarda bulunmakta bunu da ancak eğitimli personel kullanabilmektedir. AraĢtırmada son yıllarda yaygın kullanılan bazı organik fosforlu ve sentetik piretroid pestisitler, yaygın bulunan ve üretilen Sazan balığında (Cyprinus carpio L.) indikatör proteinlerin mRNA seviyesinde indüklenmesi için kullanılarak; sonuçlar deneysel eğitim materyali haline föy ve CD olarak geliĢtirilip eğitim/öğretimde uygulamalı hale getirilmiĢtir. Laboratuvar ortamında hazırlanacak deneyler biyolojik bilimlerin öğretiminde tercih edilen “yaparak, yaĢarak öğrenme” yaklaĢımını amaçlamaktadır.

1.1. Problem Durumu

Deneye dayalı bir bilim dalı olan moleküler biyoloji, farklı fakülteler ve meslek yüksekokullarında teorik ders ve laboratuvar uygulamaları olarak öğretilmektedir. Biyolojik bilimlerdeki geliĢme eğiliminin bilimsel araĢtırmaların bir safhasında çok farklı meslek gruplarından araĢtırıcıların moleküler biyoloji teknikleri kullanılarak gen ekspresyonu çalıĢmaları yapmaları gerekmektedir. Biyolojik bilimler alanında çalıĢan bütün meslek gruplarının kullanabileceği mRNA gen ekspresyonuna dayalı ucuz, kolay ve basit deneyler eğitim/öğretim amacıyla kullanılabilir mi? Bu bağlamda arastırmaya katılan biyoloji ögretmenlerinin ve uzmanların RNA izolasyonu ile ilgili arastırmacı tarafından biyolojik bilimlerin farklı alanlarında çalıĢan araĢtırıcılara yönelik hazırlanan materyale iliĢkin görüsleri nelerdir?

1.2. AraĢtırmanın Amacı

Yeni öğretim yöntemleri kullanılarak geliĢtirilen deneyler çok değiĢik eğitim kurumlarında da kullanılabilecektir. AraĢtırmada son yıllarda tercih edilen yeni pedagojik stratejilerin uygulandığı dinamik ve öğrenci merkezli, öğrenme ortamı hedeflenmektedir. Bu proje ile “real learning process” hedefine yönelik, öğrenci merkezli (üniversitelerin tıp, eczacılık, diĢ hekimliği, veteriner hekimlik, biyoloji, kimya, gıda mühendisliği, çevre mühendisliği, orman mühendisliği, ziraat mühendisliği, sağlık bilimleri fakültelerinin farklı bölümleri ile yüksek okulların ilgili bölümlerinin lisans ve lisansüstü öğrencileri ve araĢtırıcılar için), esnek moleküler biyoloji uygulamaları için mRNA izolasyon deney protokolu föyleri geliĢtirilmesi amaçlanmıĢtır.

5

Ayrıca moleküler biyoloji alanında son zamanlarda bilginin gittikçe artması çeĢitli bilim dallarından üniversite öğrencileri bu bilgilerin hepsine hızla yetiĢememektedir. Laboratuvar deneyimleriyle baĢa çıkmak için bazı konseptleri iyi bir Ģekilde anlamak gerekmektedir. DNA teknolojisinde pratik deneylerin öğretilmesi ya da öğrenilmesi bu konseptleri öğrencilerin anlamasını sağlar. Biyokimya kursları, öğrencilerin kullandığı ortak metodolojiler ve moleküler biyoloji tekniklerinin sonuçları da DNA teknolojisini anlamada avantaj sağlar. Fakat RNA ekstraksiyon protokollerine genellikle laboratuvarlarda öğrenciler ulaĢamazlar. Halbuki gen ekspresyonlarının düzenlenmesinin anlaĢılmasında RNA‟nın izole edilmesinin çok büyük avantajları vardır. RNA‟nın izolasyon süreci DNA‟ya göre çok daha zordur. Çünkü RNaz‟lar yaygın, stabil çok aktiftirler ve kofaktöre ihtiyaç duymazlar. Hayvan organlarının, hücrelerin ve domatesten bile mRNA izolesi ile ilgili pratik deneylerle ilgili bazı giriĢimlerde bulunulmuĢtur. Bu tezle protokollere ulaĢılması güçlüğü ya da protokollerin gerçekleĢtirilmesi aĢamasındaki güçlüklerin çözümüne iliĢkin boĢluğun doldurulması amaçlanıyor.

1.3. AraĢtırmanın Önemi

Biyolojik bilimlerde konuların kavratılması, kalıcı öğrenmenin sağlanması laboratuvar yönteminin etkinliği ve uygulamaların öğrenci merkezli yapılabilmesi öğrenci baĢarısını arttırmaktadır. Deney yaparken öğrencinin aktif katılımı, öğretimi sorumlu öğretim elemanı merkezli iĢlenmekten kurtarılarak derslerin monoton, gündelik yaĢamdan uzak olmadan iĢlenmesini ve öğrencilerin biyolojiyi ve çevresel kirleticilerin genetik hasara sebep olabileceğini yani genotoksik etkilerini kavramasını sağlayacaktır. Laboratuvar yöntemi biyolojinin hipotez kurma, gözlem yapma ve sistematik düĢünme gerektiren bir bilim dalı olarak algılamasına ve sonuç olarak öğrenmenin daha verimli hale gelmesini sağlayan farklı zihinsel yapılara sahip öğrencilerin kavram, bilgi ve Ģemaları benzer biçimde oluĢturarak biyoloji öğretiminin baĢarısını arttırması beklenmektedir. Benzer durum çok değiĢik araĢtırma alanlarından araĢtırıcıların kendi araĢtırmalarını yaparken kullanmak zorunda kaldıkları moleküler biyoloji, mRNA gen ekspresyonu ve gen mühendisliği alanlarında da geçerlidir. Bu tezde biyolojik bilimlerin farklı alanlarında çalıĢan araĢtırıcılara RNA izolasyonu ile ilgili basit tekniklerden oluĢan protokoller hazırlanmıĢtır. Günümüzde gen manipülasyonları, gen terapileri, gen ekspresyonları gibi uygulamalar birçok bilim alanında ve insanın yapısının tanınması noktasında çok önemli hale gelmiĢtir. Gen ekspresyonunun önceki aĢaması mRNA izolasyonudur. Farklı alanlardaki birçok bilim insanının bu izolasyon materyaline kolayca ulaĢabilmeleri

6

ekonomiklik kazandıracaktır. Ayrıca araĢtırıcıların basit teknikleri anlaması, karĢılarına çıkabilecek herhangi bir zorlukla baĢ edebilmesi açısından da yapılan araĢtırma, çıkan sonuçlar ve edinilen deneyimler bakımından önemlidir. AraĢtırmanın yöntemi bakımından ise rehber materyallerinin verimliliğinin araĢtırılması aĢamasında uzmanlara danıĢılması materyalin kullanılabilir, ekonomik, verimli, kolayca ulaĢılabilir olması konularında ıĢık tutmuĢtur.

1.4. Varsayımlar

 AraĢtırma sonunda görüĢü alınacak biyolog, biyoloji öğretmeni ve diğer araĢtırıcıların deneyler hakkında görüĢ, fikir ve önerilerini içtenlikle değerlendirdikleri varsayılmıĢtır.

 Seçilen örneklem evreni temsil etmektedir.

 ÇalıĢmada araĢtırmacı herhangi bir ön yargı ile hareket etmemistir.

 Çalısmaya katılan öğretmenlerin moleküler biyoloji ile ilgili bilgi düzeylerinin farklı olduğu varsayılmaktadır.

 Literatür kaynaklarından elde edilen bilgilerin güvenilir, geçerli ve konuyu kapsadığı varsayılmıstır.

1.5. AraĢtırmanın sınırlılıkları

 AraĢtırmada eğitim materyali olarak üç deney föyünün farklı dokulara uygulanabilmesi

 Veri toplama aracı olarak görüĢme formunun kullanılması

1.6. Tanımlar

Laboratuar Tekniği: Ögrencilerin öğrenim konularını laboratuvar veya laboratuvar

biçiminde hazırlanmıĢ özel dersliklerde bireysel ya da küçük gruplar halinde, el becerisini, yöntemsel yeteneği, gözlem becerisini geliĢtirmek, düĢünme gücünü canlandırmak amacıyla kullanılan yaparak yaĢayarak öğrenme etkinliğidir.

Deney: Konu ile ilgili olay ya da durumların gerçeğe yakın olarak ortaya konulması ve

tüm aĢamalarının gözlenmesi etkinliğidir. Deneylerde bir olay veya durumla ilgili neden-sonuç iliĢkisi ortaya çıkarılır ve gerçekler göz önüne serilir.

Rehber Materyal: Öğretim sürecinde konunun öğretilmesi için öğretmene, öğrenilmesi

7

kalıcılığını arttıran ve eğitimin özel amaçlarına ulaĢılmasını kolaylaĢtıran tüm döküman ve malzemeler bütünüdür.

Biyoteknoloji: Biyoteknoloji genetik olarak değiĢtirilmiĢ organizmaların tarımda ve

sanayide kullanımını ifade eder (Campbell, 2006). Biyoteknoloji, yeni bitkisel çesitlerin geliĢtirilmesi, bitkilerin herbisitlere, hastalık ve zararlılara dayanıklılığının arttırılması, ekstrem koĢullarda yetiĢebilen bitkilerin geliĢtirilmesi, in vitro koĢullarda gıda maddelerinin üretilmesi, ürün kalitesinin arttırılması, ürünlerin raf ömrünün uzatılması gibi amaçlar için kullanılmaktadır ( Altun, 2009).

Genetik Mühendisliği: Canlıların kalıtsal özelliklerinin değiĢtirilerek, onlara yeni iĢlevler

kazandırılmasına yönelik araĢtırmalar yapılan bilim alanıdır. DNA teknolojisi olarak da isimlendirilen genetik mühendisliği ile hastalıkların tanımlanmasına, gen tedavisine, eczacılık ürünlerinin in vitro koĢullarda üretilmesine, adli vakaların çözümlenmesine, çevresel problemlerin çözümlenmesine ve tarımsal ürünlerin üretilmesine meydan vermiĢtir.

Moleküler Biyoloji: Canlıları moleküler düzeyde tetkik eden bir bilim dalıdır. Ġnsan

sağlığından tarıma, kimya mühendisliğinden çevre korumaya, gıda üretiminden enerji üretimine kadar yaĢamın pek çok alanı bu teknolojinin kapsamına girmiĢtir (Altun, 2009).

Gen Haritalama: Canlının sahip olduğu DNA moleküllerinin tamamına genom denir.

Genom, yapısal veya enzimatik görev üstlenmiĢ nesilden nesile aktarılan gen adı verilen DNA dizi bölgeleri içerir. Ġnsan genomu yaklaĢık 3.28 milyar bç (baz çifti) içerir ve bunun sadece yaklaĢık %5‟i genlerden oluĢur. Gen haritalama, bir genin genom içindeki özgün yerinin belirlenmesi iĢlemidir. Üç çeĢit haritalama yöntemi vardır: genetik haritalama, sitogenetik haritalama, fiziksel haritalama gibi (Yıldırım, Bardakçı, Karatas ve Tanyolaç, 2007, s.489)

1.7. Ġlgili AraĢtırmalar

1.7.1.Biyoloji Konularının ĠĢleyiĢinde Uygulamalı Öğretim ve Rehber Materyal Üzerine Yapılan ÇalıĢmalar

Uluçınar ve arkadaĢlarının (2004) yaptığı fen derslerinde laboratuvar uygulamalarının değerlendirildiği bir araĢtırmada, 20 ilköğretim ve 10 ortaöğretim okulunda görev yapan 72 Fen Bilimleri (Fizik, Kimya, Biyoloji ve Fen Bilgisi) öğretmeninin görüĢlerinden yararlanılmıĢtır. Fen derslerinin iĢleniĢinde laboratuvar yönteminden ne ölçüde

8

yararlanıldığı, uygulamaların amacı ve öğrenmeye etkilerini belirlemeye çalıĢmıĢlardır. Daha önce yapılan pek çok araĢtırmada deneysel uygulamaların öğrencide fen konularını anlama, akılda tutma ve bilimsel düĢünme ile ilgili yetenekleri geliĢtirdiği, öğrencilerin daha baĢarılı olduklarını ifade etmektedirler. Yaptıkları araĢtırma sonucunda: Öğretmenler;  Okullardaki laboratuvar koĢullarının yetersiz olduğunu,

 Sınıf mevcutlarının kalabalık olduğunu,

 Ders saatlerinin laboratuvar uygulamalarını yapmak için yeterli olmadığını,  Laboratuvarda güvenlik unsurlarının eksik olduğunu,

 Öğretmenlerin müfredattaki yenilikler konusunda yetersiz kaldıklarını ve tam anlamıyla laboratuvarlardan etkin bir Ģekilde yararlanılmadığını tespit etmiĢlerdir. Uygulamaları kolaylaĢtırmak amacıyla sınıflardaki öğrenci yoğunluğunun azaltılması, laboratuvar uygulamalarında öğretmene yardımcı teknisyenlerin görevlendirilmesi ve laboratuvar Ģartlarının iyileĢtirilmesi önerilmektedir. Atik (2008) ve Altun (2009) geliĢtirdikleri öğretmen rehber materyalinde laboratuvar uygulamalarının önemini vurgulamıĢlardır.

Akaydın ve Soran‟ın (1998) yaptığı liselerde görev yapan biyoloji öğretmenlerinin, konuları uygulamaya yönelik olarak iĢleyebilme olanaklarının araĢtırıldığı çalıĢmada, ders programlarının uygulamalı olarak iĢlenebilmesi (laboratuvar çalıĢmaları, inceleme gezileri vb.) okulların maddi olanakları ile yakından iliĢkili olduğunu göstermektedir. AraĢtırmaya katılan ve Ankara ilinin çeĢitli ilçelerinde görev yapan 60 biyoloji öğretmeninin yarısından fazlası (%66,67) liselerdeki biyoloji laboratuvarlarının tam teĢekküllü olmadığını belirtmiĢlerdir. Öğretmenlerin %36,67‟sinin laboratuvarları ayda bir kez, %23,33‟ü haftada bir kez kullandıklarını, %8,34‟ünün okullarında hiç biyoloji laboratuvarı bulunmadığını, %11,67‟si ise ders yılı boyunca sadece bir kez laboratuvarı kullandığını belirtmiĢtir. Aynı araĢtırmada mikroskobu bulunmayan okula rastlanmadığı, aynı zamanda her öğrenciye bir mikroskop ile çalıĢma olanağı olan okula da rastlanmadığı ifade edilmektedir. Biyoloji öğretmenlerinin büyük bir kısmı (%78,83) biyoloji dersi ile ilgili inceleme gezileri yaptıramadığını, %15,00‟i kısmen yaptırabildiği, %6,67‟si ise her zaman yaptırabildiğini belirtmiĢlerdir. Ġnceleme gezileri yapamayan öğretmenlerin çoğunluğu (%70,22) buna gerekçe olarak zamanın yeterli olmamasını göstermiĢlerdir. Maddi güçlükleri gerekçe gösterenlerin oranı ise %17,02‟dir. Öğretmenlerin %8,5‟i de sınıflarının çok kalabalık

9

olmasını ve programda yer almamasını gerekçe göstermiĢtir. AraĢtırma sonucuna göre liselerdeki biyoloji öğretmenlerinin uygulama yaptırma olanaklarının yeterli olmadığı sonucu ortaya çıkmaktadır.

Liselerde veya üniversitelerde uygulamalı öğretimin verilebilmesi için eğitimcilerin deneysel prosedürlerle biliĢsel düzeylerini zenginleĢtirmeleri gerekmektedir. Bu amaçla hazırlanmıĢ biyolojik bilimlerde kullanılabilecek RNA izolasyonu bazlı prosedürlerin hazırlandığı araĢtırmalar aĢağıdaki gibidir.

1.7.2. Biyolojik Bilimlerde Kullanılabilecek RNA Ġzolasyonu Bazlı Prosedürlere iliĢkin AraĢtırmalar

Boyer‟in „Biochemistry Laboratory, Modern Theory and Techniques (2009)‟ adlı kitabında söz ettiği RNA izolasyonu ve karakterizasyonu ile ilgili önemli bazı noktalar aĢağıda verilmiĢtir.

 RNA molekülleri doğal olarak DNA‟dan daha kısadır. Bu durum RNA‟yı fiziksel güçlere daha az hassas yapmaktadır; hücre lizisinde daha sert Ģartlar kullanılabilmektedir.

 DNA‟daki fosfodiester bağı pH 3-12 arasında stabildir; ancak, RNA‟da 2‟-OH gruplarının bulunması baz- ve enzimle-katalizlenen (RNaz) yıkıma daha hassas hale getirir.

 RNA‟yı yıkan kimyasallara karĢı etkili tedbirler alınması ve izolasyon tamponlarına nükleaz aktivitesi gösteren endojen proteinleri yıkan kimyasallar eklenmesi gerekir.  EDTA gibi Ģelat yapıcılar ve sitrat, RNaz aktivitesi için gerekli olan metal iyonlarını

bağlar.

 Özellikle nükleazlar baĢta olmak üzere bazı proteinleri denatüre eden deterjanlar eklenmelidir.

 Guanidinyum tiyosiyanat gibi kimyasallar RNaz inhibitörü ve protein denatüre edici olarak eklenmektedir.

 Deneyleri yaparken çıplak deriden nükleazların geçmesini engellemek için plastik eldiven giyilmelidir.

 Saf RNA için dansite gradiyent santrifügasyonu kullanılabilir.

 Ġzole edilen RNA örnekleri saflık tayini için agaroz jelde, DNA‟ya benzer Ģekilde, incelenir.

10

 Bazı RNA tipleri afinite kromatografisi ile izole edilebilir. Örnek ökaryot RNA‟larında (hücresel RNA‟nın %2-5‟ini oluĢturur) 3‟-ucunda bir poli (A) bölgesi (3-200 adenilat kalıntısından oluĢan) vardır. Poli (T) veya poli (U) kullanılarak, yüksek iyonik kuvvetteki ortamdan, agaroz veya selülozdan izole edilebilirler.

Son yıllarda biyolojik bilimlerin her alanındaki araĢtırmalarda balıklar model organizma olarak kullanılmaktadır. Sucul ortamlarda besin zincirinde üst sıralarda bulunmaları yanında solunum için yüksek oranda su kullanmaları, kirleticilere maruz kalma oranlarını oldukça etkin kılmaktadır. Bu nedenle, özellikle son yıllarda balık doku ve hücrelerinin biyolojik bilimlerdeki araĢtırmalarda kullanımında artıĢ görülmüĢtür. Böylece genomiks, proteomiks ve transkriptogenomiks seviyesinde yapılan araĢtırmalarda balık türleri in-vivo ve in-vitro yaygın kullanılan önemli organizmalar haline gelmiĢlerdir.

Noorani ve arkadaĢları (2013)‟nın yaptığı araĢtırmada, zamanı iyi kullanmak ve masraftan kaçınmak için virüs teĢhisinde en iyi yöntemin mRT-PCR(Multiplex Real time polimerase chain reaction) olduğu görülmüĢtür. mRT-PCR iki veya daha fazla virüsü aynı anda teĢhis eden bir PCR çeĢididir. Bitki virüslerinde kullanılan, zamandan ve paradan tasarruf sağlayan bir sistemdir. Batı Himalaya bölgesinde bulunan tatlı kiraz ağacında 20 çeĢit virüs bulunur. Nükleikasit hibritleme ve RT-PCR sadece CVA adı verilen virüs için kullanılır. Ġki adımlı bu PCR yöntemi aynı anda CVA, CNRMV, LChV-1 ve PNRSV virüsleri için kullanılır. Nad5 mRNA ve RNA kalitesini ve etkililiğini RT-PCR‟ı da kontrol eder. Bitki RNA‟sının izolesinde etkili olarak kullanılan prosedürlerden biri olan Zeng ve Zang (2002) tarafından geliĢtirilmiĢ prosedür kullanılır. Kısaca; DonmuĢ yaprak dokuları(100mg) havan ve eli kullanılarak sıvı nitrojenle ezilir. 1 mL CTAB (Setiltrimetilamonyumbromüd) tamponu (%2 CTAB, %3 PVP-40, 100 mMTris HCl pH 8, 2 M NaCl, 25 mM EDTA pH 8, % 0,05 spermidin ve %1 β-merkaptoetanol), içeren mikrosantrifüj tüpüne konulur. Tüp 1 dk vortekslenir. 10 dk 650C‟ de inkübe edilir. 15,000 × g 1dk santrifüj edilir. Süpernatan yeni bir tüpe transfer edilir (700 μl). EĢit hacimde kloroform ve izoamilalkol (24:1) yeni tüpe aktarılır. 18,000 × g de 10 dakika santrifüj ettikten sonra, süpernatan içinde 300 μl LiCl (7.5 M) olan yeni bir tüpe alınır (600 μl). KarıĢım −800C 15 dakika bekletilir ve 18,000 × g 20 dk santrifüj edilir. Pelet %80 etanol ile yıkanır ve son olarak 60 μl nükleaz olmayan suda çözülür. RNA‟nın tamamı etidyum bromür‟lü %1 agaroz jelde yürütülür. RT-PCR‟ da internal kontrol için kullanılır. Konsantrasyon ve kalite Nano- Drop 2000/2000c (Spectrophotometers (Thermoscientific) ile ölçülür. DonmuĢ, taze yaprak

11

dokusu ya da etli çekirdekli meyve bitkilerinden total RNA izolasyonu için bu metod kullanılabilir. RNA izolasyonu için birçok metod var. Kara düzen ya da birçoğu satılan kitler RNeasy Plant Mini Kit, QIAGEN and NucleoSpin®RNA Plant Kit, Machery-Nagel, Germany gibi kitlerdir. Geleneksel metodlar genellikle zaman harcatır, tehlikeli olabilir ve zahmetlidir. Aksine; ticari ekstraksiyon kitleri ise pahalı olabilir ve bazen etli ve çekirdekli meyveler polifenol ve polisakkarit yapısı bakımından zengindir ve bu tip meyveler kitlere uyumsuz olabilir (Li vd., 2008). Bu çalıĢmada primer dimer formasyonunu en aza indirmek için CVA ve CNRMV için tekli antisense primer kullanıldı. Bu tip çalıĢma spovirüsün farklı bir türü olan patates virüsü Y „den RT-PCR ile (Nie and Singh, 2002) çalıĢıldı. Son zamanlarda cDNA sentezinde ortak rastgele hekzamer ve oligo (dT) karıĢık primerleri ile RT‟yi daha hızlı ve ekonomik yapmak için çalıĢıldı. Aynı RT ile aynı bitkiden diğer RNA virüslerini belirlemek için çalıĢıldı. Bu bilgilerin en iyi yanı mRT- PCR ile aynı anda dört tane (CVA, CNRMV, LChV-1 and PNRSV) kiraz virüsünün belirlenmesi sağlandı bu da virüs indeksinin hazırlanmasında, bitki karantinasında ve sertifika programlarında yardımcı olacaktır.

Claros ve Canovas (1999)‟ın yaptığı araĢtırmaya göre; birçok bitki materyali kofullarında yüksek oranda aktif RNaz bulundurmaktadır. Bu durum bitki RNA ekstraksiyonunda hücrenin parçalanması esnasında çok önemlidir. Laboratuvar kaynaklarından herhangi birinde az miktarda dahi olsa RNaz kalıntısının bulunması engellenmelidir. Normalde RNaz‟lar düzenli yapılardır. Fakat hücre parçalandığında düzenleme mekanizması dağılır ve degradasyonlar hızlıca ortaya çıkar. Enzimler kendiliğinden düĢük sıcaklıkta aktif konformasyonlarına (Ģekil) katlanabildiklerinden beri, RNaz‟lar kaynatılarak denatüre edilemezler. Bazı deterjanlar (SDS-N- lauril sarkosin gibi) ribonükleazı denatüre ve inhibe eder. Fakat inaktivasyon yavaĢ gerçekleĢir. Bu sırada solusyon seyreltilirse enzim tekrar katlanır. Diğer kimyasal ajanlar DEPC( Dietil prokarbonat), rRNaz‟ları yok eder. DEPC toksiktir ve mRNA aktivitesinin translasyonunu da yok eder. Eğer saflaĢtırma mekanik bir aletle sıvı nitrojenin içinde yapılacaksa ribonükleaz aktivitesini hızlıca yıkacak kimyasal ajanlarla çalıĢılmalıdır. Bunlardan biri asit fenoldür ki güçlü hidrojen bağları peptid oksijen atomlarından oluĢur. Aminoasit kalıntıları ile tuzu bağlayan fenolde protein çözeltisinin sonucu olan aromatik halkalarla hidrofobik iliĢki içindedir. Diğer kilit ajan ise 2-merkaptoetanol‟dür. Ribonükleaz‟daki disülfit bağlarının kopmasına sebep olmaktadır. Kontaminasyon problemlerinden kaçınmak için solusyonlar Milli-Q otoklavlanmıĢ su ile hazırlanmaktadır. Tüm cam eĢyalar ve tüpler iki kez otoklavlanmalıdır. Diğer plastik

12

malzemeler, kloroform, H2O2 (Hidrojen peroksit)‟le muamele edildikten sonra 4 saat 160 0_{C‟de pastör fırınında tutulmalıdır. Eldivenler muhakkak giyilmelidir. SaflaĢtırmada NH}

4 –

asetat proteinin izlerini, küçük nükleikasit ve nükleotidleri yok eder. LiCl çöktürmesi DNA, tRNA ve snRNA‟yı uzaklaĢtırır. Bu nedenle RNA saflaĢtırılması sonunda rRNA ve mRNA fazlaca bulunur. Sonuç olarak, bitkilerden RNA lisans öğrencileri tarafından baĢarıyla saflaĢtırılmıĢtır. Metodun esnek ve güçlü olduğu ve basitce yapıldığı görülmektedir. Bu metod öğrencilerin RNA‟nın özelliklerini anlamalarını ve laboratuvarda cevap vermeleri gereken laboratuvar sorularını hesaplamalarını sağlamıĢtır. BaĢarılı kurslarda üç amaç belirlenmektedir: (1) deneyleri daha çok öğrenciye yaptırabilmek, (2) metodu pancar (Beta vulgaris) türüne geniĢletmek ki (3) böylelikle RNA‟nın yeĢil ya da yeĢil olmayan dokulardan kolaylıkla izole edildiği gösterilmelidir. Bu yüzden öğrenciler bantların varlığı veya yokluğuna göre kloroplasttan rRNA‟yı belirleyebilmektedirler. Morante-Carriel (2014) ‟in yaptığı araĢtırmaya göre; malta eriği; zor ayrıĢabilen odunsu bir meyvedir. Yaprakları ve çiçekleri içerisinde bol miktarda polisakkarit, protein ve polifenol gibi ikincil metabolik maddeler bulundurur. Bu maddeler total RNA izolasyonunda yüksek kalitede RNA eldesini bir hayli zorlaĢtırmaktadır. Yüksek su oranına sahip bitkilerde de aynı problem vardır. Bu gibi bitkilerde lityumklorid ve susuz alkol ile sonraki (ikincil) RNA çöktürülmesi gerçekleĢtirilebilir.

ġeftaliden yüksek kalitede RNA eldesinde LiCl, fenol ve CTAB‟ye bağlı protokoller geliĢtirilerek bu tarz bitki gruplarından yüksek kalitede RNA elde edilmiĢtir ve bu tarz bitkilerde önemli derecede iyi sonuçlar edilmiĢtir. Bu metodta LiCl ve NaOAc kullanılmaktadır ve çözeltilerin pH‟ının belli değerlerde olması gerekmektedir bu noktada bazı zorluklar yaĢanabilir. Fakat kitler etli ya da odunsu bitkilerden RNA izolasyonu için yeterli değildir.

Farnsworth, Keating, Mcauley ve Smith (2004) ‟in yaptığı araĢtırmada prokaryotik hücrelerden total RNA izole edebilmeyi içeren bir protokol geliĢtirilmiĢtir. Total RNA

Escherichia coli B23‟den izole edilmiĢtir ve Trizol® kullanılarak ürünler elde edilmiĢtir. Ġki protokol geliĢtirilmiĢtir. Bu iki protokolün karĢılaĢtırılmasında hava boĢluğunun sonuçlarından bağımsız olarak fazların ayrılması sırasında RNA‟nın saflığının ve miktarının arttığı gözlenmiĢtir. Aynı zamanda düĢük moleküler ağırlıklı RNA moleküllerinin poliakrilamid jelde ya da agaroz jelde ayrılmaları geliĢtirilmeye çalıĢılmıĢtır. Poliakrilamid jelde % 5.8S rRNA ve tRNA‟nın çözülmesi sağlanmıĢtır.

13

Prokaryotik RNA ekstraksiyonu için iç standart olarak bakterilerin kullanımı baĢarılı değildir. Fakat gelecek araĢtırmalar için umut vadedebilir. Metod1 ekstrakte RNA‟da daha az içerik vardır. Bunun sebebi hava boĢluğu olabilir. Metod2‟de hava boĢluğu yoktur ki bu da RNA miktarının artmasının gözlenmesine sebep olabilir. Dahası metod1 yüksek fenol kontaminasyonuna sebep olurken, sıvı fazdan daha fazla alınması yoluyla RNA‟ların arttırılması sağlanabilir. Son amaç ise bakteri hücrelerinde farklı RNA konsantrasyonunda antibiyotikle muamelenin etkilerinin paylaĢılmasıdır. Kültür ayrıldığında; 40µg/mL‟lik son konsantrasyona kloramfenikol, 100µg/mL‟ye ise kanamisin eklenir. Bu yaklaĢım sonuçlarla bağdaĢmadığı için yasaklanmıĢtır. Hücrede iç standartlar kullanıĢlı araçlardır. Bunlardan biri hücre farklılıkları nedeniyle RNA‟nın farklı seviyelerde bulunmasına olanak sağlar. Her örnek için protokolün uygulanmasında farklılıklar yoktur. Belli deneyler hedef için kullanılan potansiyel RNA‟yı gösterirler. Eklenen bazı parametreler baĢarı Ģansını arttırabilir. RNA degradasyonunu engelleme aĢamasında ise, özellikle RNA için numaralandırılmıĢ pipetlerin kullanımı önerilir. Jel tepsisi ve tarak % 0,5 sodyum dodesil sülfatla muamele edilmelidir. DEPC ile muamele edilmiĢ su ve etanolle çalkalanmıĢ olmalıdır. Örnekleri denatüre ederken formaldehitin pH‟ı 4‟den büyük olmalı, aksi halde düĢük pH degradasyona sebep olmaktadır. Formaldehit ya da gloksal yerine alternatif olarak üre de kullanılabilir. RNA‟nın -80°C saklanması önemlidir. Ġzolasyonla elektroforez arasındaki süre kısa olmalıdır.

Özgüç ve arkadaĢları (1996)‟nın yaptığı araĢtırmada lenfosit hücrelerinden total RNA izolasyonunda Chomczymski‟nin metodundan modifiye edilen iki ayrı metod kullanılmıĢtır. Guanidinyum tiyosiyanat (GTC); ribonükleaz inhibitörü (engelleyicisi) ve güçlü bir protein denaturantıdır (yapıyı bozan madde). Periferik kan hücreleri gibi endojen ribonükleaz bakımından zengin, fakat düĢük RNA miktarı bulunan dokulardan RNA izolasyonu zordur (Birnboim,1988). Chomczynski ve arkadaĢları asit guanidinyum-fenol-kloroform (AGPC) olarak isimlendirilen metod ile kültür hücrelerinden, çeĢitli yumuĢak dokulardan ve lenfosit hücrelerinden total RNA izolasyonu gerçekleĢtirmiĢlerdir. Chomczynski‟nin total RNA izolasyonu metodu mini metod olarak yeniden modifiye edilmiĢtir. DüĢük hacimde ve kısa sürede total RNA izolasyonu yapmak mümkün olmuĢ ve standardize edilmiĢtir. µL düzeyinde 1,5 mL ependorf tüpte yapılan izolasyonda hem solusyon kullanımı minimum düzeye indirilmiĢ hem de RNaz kontaminasyonu kolaylıkla engellenmiĢtir. 10 mL periferik kandan yaklaĢık 5-6 µL total RNA izole etmek mümkündür. Tüm metod yaklaĢık 5-6 saat sürmektedir. Trizol® solusyonu hücre ve

14

dokularda total RNA izolasyonunda kullanılan yeni bir solusyondur. Chomzynski‟nin RNA izolasyon metodundan uyarlanan ve tek fazlı guanidinyum tiyosiyanat- fenol karıĢımı ile çok kısa sürede RNA izole etmek mümkündür. Trizol® solusyonu Paris‟teki Hopital-Necker Enfants Malades Hastanesi Laboratoire de Biochimie Genetique bölümü tarafından hediye edilmiĢtir. ÇalıĢmalarımız sonucunda kendi uyarladığımız RNA izolasyon metodu Trizol® ile yapılan metoda göre daha uzun olmasına rağmen hem RNA kalitesi, hem de maliyet açısından daha uygun bulunmuĢtur (100 mL Trizol® solusyonunun fiyatı yaklaĢık 1000$‟dır.).

Chomcynski ve Sacchi‟nin (1986)‟da yaptığı diğer araĢtırmada, AGPC metodunun görülen sonuçlarının önceden tanımlanmıĢ RNA izolasyonu metodlarına alternatif olarak daha kullanıĢlı olduğu saptanmıĢtır. AGPC ekstraksiyonu yüksek hassasiyetli, saf ve degrade olmamıĢ RNA fragmentleri ekstrakte etmeyi(izole etmek) sağlar. BasitleĢtirmek ve ultrasantrifügasyon aĢamasını elemek amacıyla AGPC metod‟u bir çok örneğin de aynı anda sürece dahil edilmesine izin verir. Metod aynı zamanda çok az sayıda ( hücre gibi veya 3mg doku ya da insan hipofiz bezi tümörü gibi) dokularda da kullanıĢlıdır. Degradasyon ya da RNA kaybı en aza indirilmiĢtir. AGPC metodu bu yüzden klinik araĢtırmalarda daha kullanıĢlıdır. Protoonkogen gen ekspresyonları gibi ya da kötü tümör ilerlemesinin moleküler iĢaretlenmesinde kullanılır.

Chomcynski ve Sacchi (2006)‟nin yaptığı „The Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction‟ adlı araĢtırmada, etkili bir Ģekilde endogenus ribonükleazları denature edebilecek en etkili protein denaturantlara sahip guanidinyum tiyosiyanatlara bağlı prosedürü barındırmaktadır. Bu metod degrade olmuĢ RNA‟yı DNA‟dan ayırmakta çok etkilidir. Fakat sezyum klorid (CsCl) tamponu yoluyla saatler süren ultrasantrifügasyona ihtiyaç vardır. Orijinal basit adımlarla metod küçük RNA‟ları da içeren 4S-5S gibi tüm RNA‟ların izolesinin yapılabileceği umudunu tanımlamıĢtır. RNA‟nın miktarı izolasyonda kullanılan dokuya da bağlıdır. Tipik olarak 100 mg kas dokudan 100-150 µg, 100mg karaciğerden 800µg izole edilebilir.

Van Dyck ve arkadaĢları(2013)‟ nın yaptığı araĢtırmada total RNA‟nın izolasyonu (RNeasy Plus Mini Kit, Qiagen) kitle yapılmıĢtır. Bu araĢtırmaya göre; düĢük kaliteli RNA, RT- PCR ve micro-array analizlerini negatif etkiler. Bu nedenle gen ekspresyonlarının ilk adımı RNA saflığıdır. RNA saflığını kontrol etmeye yardım eden yöntem otomatik mikro-kapiller elektroforez baz sistemidir; (2100Bioanalyzer gibi) RNA

15

bazlarının bilgisini sağlayan bu sistemlerle data oluĢturulur ve tüm RNA‟nın kontrol edilmesine olanak tanır ve ribozomal alt-üniteler arasındaki ağırlık oranlarının bilgisini de sağlar (Fleige and Pfaffl, 2006). Bu çalıĢmada RNA‟nın birçok konsantrasyonu iyi çıkmıĢtır. Hala iki grup arasında RNA saflığı bakımından önemli farklar vardır. Total RNA parçası yaralı aterosklerik damar segmentinde 369.8 ±36.6 ng/μl; aksine sağlıklı kan damarlarında 162.5 ±59.7 ng/μl (p = 0.005)miktarındadır. Arteriyal sakatlanma sonrasında neointimal dokunun çoğalmasına bağlı olarak yüksek oranda RNA parçası arterosklerotik tavĢandan gelmiĢtir. Sonuç olarak yaralı vasküler segmentlerden yüksek kalitede RNA elde edilmiĢtir. Bu Ģekilde RNA saflığını etkileyebilecek potansiyel doku hasarına bağlı durumlar elimine edilmiĢtir.

Miller ve arkadaĢları (2013)‟nın yaptığı çalıĢmada yumurtalıktan alınan kanser hücreleri (A2780 and A2780-C1R5) kullanıldı. RNA tripsinli hücrelerden Qiagen RNeasy AllPrep method (Qiagen Sciences,Valencia, CA 91355, kat. No. 80004)‟ un kullanıĢlı hale getirilmiĢ bir versiyonu ile izole edildi. Pelet 4 0

C, 1000 Rpm (129 g) 5 dk bir ependorfta santrifüj edildi. Angle rotor (Santrifüj cihazı) (Hauppauge, NY 11788, kat. No. F34-6-38) 15 mL konik bir falkon (ThermoFisher Scientific, Wilmington, MA 01887, kat. No.14-959-70C) kullanılarak bir ependorf içinde 5810 Rpm de 4 0C‟de santrifüj edildi. Hücreler 600 μL RNaz RLT tamponu (Qiagen Sciences, Valencia, CA91355, kat. No. 79216) % 1 BME (hacim/hacim) ile parçalandı. 20 kez mikrosantrifüj tüpünde ya da tüplüğünde vortekslendi. Hücreler Qiashredder spin kolonundadır (Qiagen Sciences, Valencia, CA 91355, kat. No. 79654). Santrifügasyonun tamamlandığı sırada 2 dk 13,300 Rpm (17,000 g) de AccuSpin Micro17 santrifüj cihazında (ThermoFisher Scientific, Wilmington, MA 01887, kat. No. 13-100-675) tamamen parçalandı. Sıvı kısım DNA‟dan kurtulmak için AP-DNA kolona alındı. (10,200 Rpm, 10,000 g) 20 s. döndürüldü. Etanol (900 μL) son konsantrasyonu %60 olmak üzere RNA/protein fraksiyonlarına RNaz kullanılmadan önce eklendi. 10,200 Rpm 20 s.de (hacim/hacim) kolon döndürüldü. AkıĢkan protein fraksiyon kısmı daha sonra kullanılmak üzere -80 0_{C‟ye kaldırıldı. RNaz kolonu Qiagen RWT}

tamponu Qiagen Sciences ile yıkandı. (Valencia, CA 91355, kat. No. 1067933, etanol içerir) 20 s. 10,200 Rpm de döndürülür. RNaz sütunu sonra 500 µL RPE tamponu ile 20 s. 10,200 Rpm de santrifüj edilir. RNaz sütunu 500 μL %80 (hacim/hacim) etanol ile de yıkanır ve santrifüj edilir (5dk 13,300 Rpm). Sütun temiz bir tüpe geçirilir ve ek olarak 5 dk 13,300 Rpm de kurutmak için döndürülür. Kitin içindeki 50 μL DIW ile sütun yapısı ıslatılır. Bir dk sonra 1 dk 13,300 Rpm‟de santrifüj edilir. Total RNA örnekleri -80 0_C‟de

16

daha sonra kullanılmak üzere saklanır. RNA fragmenti Bioanalyzer kullanılarak görüntülenir ve Agilent RNA 6000 Pico assay (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, 95051, kat. No. 5067-1513ile). Bir RNA fragmenti numarasının (RIN) tüm örnekler içinde sekizden büyük olması önerilir. Total RNA örneklerinin fragmentlerinin büyüklüğü 200 nt (baz çifti) civarında olmalıdır. Qiagen protokolüne göre; RNA dizisi preperatlarından rRNA‟nın çıkarılması için sayısız metodlar tanımlanmıĢtır. Fakat bazıları tüm transkriptomlar için açıklanmıĢtır. Burada tanımlanan protokolü kullanarak tüm transkriptom rRNA dizilerini ortamdan uzaklaĢtırmak için hibrit kinetiği ve dubleks özel nükleaz(DSN)lar kullanarak kütüphaneden yakalanır. mi RNA‟lar gibi küçük ncRNA ları yakalamak için protokoller; tipik olarak jel elektroforezlerde kontaminasyon muhakkak olur. Fakat bu makaledeki metod RNA‟nın tüm tiplerinin eldesine imkan tanır. Bizim DSN protokolümüz Illumina protokolünden birkaç kilit yolla daha farklıdır. Öncelikle RNA izolasyon protokolü kalan miRNA‟ların yıkandığı RWT tamponlu Qiagen AllPrep RNeasy kit ile modifiye edilmiĢtir. Büyük RNA‟lardan küçük RNA‟ları ayırmak için Qiagen faydalı hale getirilmiĢtir. Bu durum tüm transkriptomu inceleme olanağı tanır. Bu metod dubleks –özel- nükleaz (DSN)stratejisini geliĢtirerek ve kullanıĢlı hale getirerek diğer jenerasyon dizilerinden (NGS) rRNA‟nın okunmasını engeller. Yüksek kalitedeki bu metod kullanılarak veriler oluĢturulur. Aslında qRT-PCR‟ın doğruluğu artmıĢtır. Gen ekspresyonu sahasında bu durum büyük bir standardı oluĢturur. Bizim metodumuz, diğer RNA-dizi protokolleri gibi bütünlüğü korur. SNPs gibi splays çeĢitlerini belirler. Kütüphane barkodları ise esnektir. NGS ( gelecek jenerasyon dizileri)‟ne ulaĢımda Ģimdiki çoklama teknolojisi araĢtırmacılara tam avantaj sağlar.

Denovan-Wright, Gilby, Howlett ve Robertson (2001)‟nın yaptığı araĢtırmada beyin dokusundan Total RNA izolasyonu gerçekleĢtirilmiĢtir. Trizol® kullanılarak yapılan bu prosedüre 50 mg beyin dokusu ile baĢlanmıĢtır. Trizol®ün standart metodu uygulanmıĢtır. Total RNA ile ilgili birçok kit vardır. Fakat Trizol® beyin doku ve omurilikten RNA izolasyonu için çok güvenilir bir metodtur.

Yu ve arkadaĢları (2011)‟nın yaptığı araĢtırmaya göre polisakkarit içeren hidrojellerden, RNA izolasyonunun hayli zor olduğu tespit edilmiĢtir. Geleneksel olarak hücre ve doku için tasarlanmıĢ RNA izolasyon tekniklerinin, nükleikasit ve biyolojik maddeler arasındaki fiziksel kimyasal etkileĢimden dolayı saflıkları ve RNA ürün miktarları sınırlı olabilmektedir. Bu çalıĢmada metakrilat glikol kitosan hidrojellerle kapsüllenmiĢ insan yağ

17

dokusundan çıkarılmıĢ sap hücrelerinde farklı RNA izolasyon tekniklerinin karĢılaĢtırılmalı analizleri yapılmıĢtır. Sonuçları göstermiĢtir ki; RNaz mini kit saflaĢtırmasını takip eden setiltrimetilamonyum bromid (CTAB) tamponu ile kullanılan RNA izolasyon metodu RNA‟nın düĢük miktarda izole edilmesine sebep olur. Yağ doku örneklerinin direkt olarak tamponla ezildiği durum hariçtir. Ek olarak reverse RT-PCR sırasındaki CTAB bazlı metodların sürecindeki hidrojellerde genomik DNA kontaminasyonu analizleri gözlenir. Ġzolasyon metodu Trizol® ve Qiaexjel ekstraksiyon kiti ile kombine Ģekilde kullanılır veya geniĢletilmiĢ çözücü saflaĢtırma metodu ile ekstrakte edilmiĢ RNA gen amplifikasyonu ile uyumludur. Genomik kontaminasyon izine de rastlanmamıĢtır. Son iki metod amplifikasyon ve ürün yeterliliği süresinde en iyi sonuçları vermiĢtir. Doku iskelesinin lizozimle sindirimi öncesinde polisakkarit jellerden RNA ekstraksiyonunun çoğaltılmasının mümkün olduğunu araĢtırmıĢlardır. SaflaĢtırmanın, ürünün ve amplifikasyonların süreci geliĢtirme olmadan gözlenmiĢtir. Genel anlamda bu iĢin en önemli noktası Trizol® ve geniĢletilmiĢ çözücü saflaĢtırma metodunu RNA ekstraksiyonu için uyumlu bir hale getirmiĢ olmaktır. Bu ekstraksiyon metodu tohumlanmıĢ kitosan bazlı iskelette araĢtırma yapılan hücrelerde çalıĢılmıĢtır. Gen ekspresyonunda güvenli sonuçlar alınmıĢtır.

Cirera (2013)‟nın yağlı doku üzerinde yaptığı araĢtırmaya göre; yağlı doku genellikle vücutta enerjinin pasif olarak saklandığı yer olarak görülür. Fakat son zamanlarda kompleks ve yüksek metabolik aktiviteye sahip bir endokrin organ olduğu farkedildi. Birçok bilim insanının dünya genelinde yayılıĢını takip ettiği, ilgilendiği diyabet, metabolik sendromlar ve obezitenin önemli kilit noktalarındandır. Yüksek yağ asidi içerdiği için ve bazı örnekler düĢük sayıda hücresi olduğunu belirttiği için, yağlı doku; gen ekspresyon uygulamalarında, izolasyonuna ihtiyaç duyulan RNA‟nın yüksek saflıkta eldesi için bazı zorluklar çıkarabilir. Yağlı dokudan elde edilmiĢ birçok rutin RNA izolasyon protokolünden düĢük kalitede RNA, degrade olmuĢ RNA ve süreçte küçük RNA‟sı kaybolmuĢ RNA‟lara rastlanabiliyor. Bu durumlar sonuçları yanlıĢ yönlendirebilir ve az miktar yağ doku ile çalıĢılırken büyük zorluklara sebep olur(Ör: Ġnsan biopsileri). Bu nedenle bu tip dokulardan yeterli ve yüksek kalitede RNA‟lar elde etmek için etkili protokoller kullanılmalıdır. Burada basit ve yağlı dokuya uyarlanmıĢ dünya genelinde bir arada kullanılan metodların protokolü kullanılmıĢtır. Yeni protokolün performansı standart metodların performansı ile karĢılaĢtırılmıĢtır. Dört örnek (2 cılız hayvan ve 2 ĢiĢman hayvan) TRI Reagent® (MRC Inc.,US) ve miRNaz (Qiagen, Germany) metodlar