tarafından bitkilerde tümör oluşumunun moleküler mekanizması

(1)

Agrobacterium tumefaciens tarafından bitkilerde tümör oluşumunun moleküler

mekanizması

Sebahattin ÖZCAN

Bu bölümdeki tüm bilgiler Özcan vd. 2002’den alınmıştır^.

(2)

Bitkilere Gen Aktarım Teknikleri Bitkilere Gen Aktarım Teknikleri

 1. Agrobacterium 1. Agrobacterium

 2. Doğrudan Gen Aktarım 2. Doğrudan Gen Aktarım Teknikleri

Teknikleri



a. Biyolistik (Partikül Tabancası) a. Biyolistik (Partikül Tabancası)



b. Mikroenjeksiyon b. Mikroenjeksiyon



c. Protoplastlara Gen Aktarımı c. Protoplastlara Gen Aktarımı

 i. Kimyasal Yöntemleri. Kimyasal Yöntemler

 ii. Elektroparosyonii. Elektroparosyon

(3)

Agrobacterium Agrobacterium



Bitkilerde tümör oluşumuna Bitkilerde tümör oluşumuna Agrobacterium Agrobacterium

bakterisinin neden olduğuna ilk defa Amerikalı bakterisinin neden olduğuna ilk defa Amerikalı

bilim adamları Smith ve Towsend (1907) bilim adamları Smith ve Towsend (1907)

bildirmişlerdir.



Agrobacterium Agrobacterium , , Rhizobiaceae Rhizobiaceae familyasından, familyasından, toprakta yaşayan gram-negatif bir bakteridir.

toprakta yaşayan gram-negatif bir bakteridir.



İki çenekli (dikotiledon) bitkilerde İki çenekli (dikotiledon) bitkilerde A. tumefaciens A. tumefaciens kök boğazı uruna,

kök boğazı uruna, A. rhizogenes A. rhizogenes ise saçak kök ise saçak kök oluşumuna neden olmaktadır.

oluşumuna neden olmaktadır.



Ur (tümör) oluşumuna bazı tek çenekli bitkilerde Ur (tümör) oluşumuna bazı tek çenekli bitkilerde de rastlanmaktadır.

de rastlanmaktadır.

(4)

Agrobacterium Agrobacterium

 Hastalık önce, gövde ve köklerin bilhassa toprak Hastalık önce, gövde ve köklerin bilhassa toprak

yüzeyine yakın bölgelerinde küçük ve aşırı büyümeler yüzeyine yakın bölgelerinde küçük ve aşırı büyümeler

şeklinde görülür.

 Gelişmenin erken döneminde tümörler az çok küremsi, Gelişmenin erken döneminde tümörler az çok küremsi, beyaz ya da ten rengi ve oldukça yumuşaktır. Daha

beyaz ya da ten rengi ve oldukça yumuşaktır. Daha sonra, bu hücrelerin ölümü ve çürümesi sonucu dış sonra, bu hücrelerin ölümü ve çürümesi sonucu dış

dokular kahverengi veya siyaha döner.

 A. rhizogenesA. rhizogenes ile enfeksyion sonucunda da enfeksiyon ile enfeksyion sonucunda da enfeksiyon bölgesinden saçak kökler oluşmaktadır.

bölgesinden saçak kökler oluşmaktadır.

(5)

Agrobacterium tumefaciens tarafından tümör (ur) oluşumu

(6)

Agrobacterium rhizogenes tarafından tümör (ur) oluşumu

(7)

Tümör ve Saçak Kök Oluşumu Tümör ve Saçak Kök Oluşumu

 White ve Braun (1941) yılında bu hastalığın çok sıraWhite ve Braun (1941) yılında bu hastalığın çok sıra

 Oksin ve sitokinin grubu bitki hormonları, bitki hücrelerinin Oksin ve sitokinin grubu bitki hormonları, bitki hücrelerinin in vitro

in vitro şartlarda çoğalarak kallus oluşturabilmeleri için şartlarda çoğalarak kallus oluşturabilmeleri için mutlak gereklidirler.

mutlak gereklidirler.

 Oysa, Oysa, AgrobacteriumAgrobacterium tarafından bir kez tümör veya saçak tarafından bir kez tümör veya saçak kök oluşumu başlatıldıktan sonra, tümör veya saçak

kök oluşumu başlatıldıktan sonra, tümör veya saçak kökler izole edilerek steril kültür koşullarında, bakteri kökler izole edilerek steril kültür koşullarında, bakteri

olmadan ve yardımcı hormonlara ihtiyaç duymadan olmadan ve yardımcı hormonlara ihtiyaç duymadan

büyütülebilmektedir.

 Yapılan araştırmalarda, enfeksiyon sonucu oluşan Yapılan araştırmalarda, enfeksiyon sonucu oluşan

dokunun normal bitkide bulunmayan bazı aminoasitleri ve dokunun normal bitkide bulunmayan bazı aminoasitleri ve

opin’ler olarak bilinen şeker türevlerini sentezlediği opin’ler olarak bilinen şeker türevlerini sentezlediği

görülmüştür görülmüştür

(8)

Tümör ve Saçak Kök Tümör ve Saçak Kök

Oluşumu Oluşumu

Bu bileşikler bakteri tarafından karbon ve nitrojen Bu bileşikler bakteri tarafından karbon ve nitrojen

kaynağı olarak kullanılmaktadır.

Tümörlü dokunun sentezlediği opinlerin türleri Tümörlü dokunun sentezlediği opinlerin türleri (nopalin, oktopin, agrosinopin, agropin gibi) (nopalin, oktopin, agrosinopin, agropin gibi)

enfekte eden bakteri hatları tarafından belirlenir.

Böylece,

Böylece, Agrobacterium Agrobacterium hatları oktopin ve napolin hatları oktopin ve napolin olarak iki ana grup altında toplanmaktadır.

olarak iki ana grup altında toplanmaktadır.

(9)

(10)

(11)

(12)

T-DNA Aktarımında Gerekli T-DNA Aktarımında Gerekli

Olan Ögeler Olan Ögeler

 T-DNA (Transferred-DNA) bölgesi T-DNA (Transferred-DNA) bölgesi

 Virülens ( Virülens ( vir vir ) bölgesi ) bölgesi

 Bakteri kromozomlarında bulunan Bakteri kromozomlarında bulunan genler.

genler.

(13)

(14)

T-DNA Bölgesi T-DNA Bölgesi

 T-DNA bölgesi çift sarmal Ti veya Ri plazmidi üzerinde T-DNA bölgesi çift sarmal Ti veya Ri plazmidi üzerinde bulunan ve bakteriden bitki hücresine aktarılarak bitkinin bulunan ve bakteriden bitki hücresine aktarılarak bitkinin

genomuyla birleşen küçük bir DNA parçasıdır.

 Enfeksiyon sonucunda bitkinin genomik DNA'sına bir Enfeksiyon sonucunda bitkinin genomik DNA'sına bir veya birden fazla T-DNA aktarılabilmektedir.

veya birden fazla T-DNA aktarılabilmektedir.

 Oktopin ve nopalin tipi T-DNA’lar genelde birbirlerine Oktopin ve nopalin tipi T-DNA’lar genelde birbirlerine benzemekle birlikte, bazı özellikler bakımından önemli benzemekle birlikte, bazı özellikler bakımından önemli

farklılıklar gösterirler.

 Oktopin tipi plazmidler, bitkinin genomuyla bağımsız Oktopin tipi plazmidler, bitkinin genomuyla bağımsız olarak birleşebilen TL (left/sol), TC (center/merkez) ve olarak birleşebilen TL (left/sol), TC (center/merkez) ve

TR (right/sağ) olarak simgelenmiş T-DNA bölgelerine TR (right/sağ) olarak simgelenmiş T-DNA bölgelerine

sahiptir sahiptir

 Öte yandan, nopalin tipi plazmidlerde ise tek bir T–DNA Öte yandan, nopalin tipi plazmidlerde ise tek bir T–DNA bölgesi bulunmaktadır.

bölgesi bulunmaktadır.

(15)

T-DNA Bölgesi T-DNA Bölgesi

 Her iki plazmid tipinin 23 kb büyüklüğündeki T-Her iki plazmid tipinin 23 kb büyüklüğündeki T- DNA'larında 13 adet gen belirlenmiştir.

DNA'larında 13 adet gen belirlenmiştir.

 Oktopin tipi plazmidlerin, 13.2 kb uzunluğundaki TL-Oktopin tipi plazmidlerin, 13.2 kb uzunluğundaki TL-

DNA'ları üzerinde 8, 7.9 kb uzunluğundaki TR-DNA'larında DNA'ları üzerinde 8, 7.9 kb uzunluğundaki TR-DNA'larında ise 5 gen taşıdıkları ve TL-DNA bölgesi ile nopalin tipi

ise 5 gen taşıdıkları ve TL-DNA bölgesi ile nopalin tipi plazmidin T-DNA'sı arasında büyük benzerlikler olduğu plazmidin T-DNA'sı arasında büyük benzerlikler olduğu saptanmıştır.

saptanmıştır.

 Ayrıca, oktopin tipi plazmidlerde bulunan TR bölgesi Ayrıca, oktopin tipi plazmidlerde bulunan TR bölgesi tümör oluşumu için mutlak gerekli değilken, TL-DNA tümör oluşumu için mutlak gerekli değilken, TL-DNA kısmının oktopin sentezini kodlayan bir geni taşıdığı kısmının oktopin sentezini kodlayan bir geni taşıdığı bilinmektedir.

bilinmektedir.

 Diğer taraftan, nopalin türü plazmidlerdeki T-DNA Diğer taraftan, nopalin türü plazmidlerdeki T-DNA bölgesinin nopalin (

bölgesinin nopalin (nosnos) ile agrosinopin () ile agrosinopin (acsacs) sentezini ) sentezini sağlayan genleri taşıdığı, oktopin plazmidinin TR

sağlayan genleri taşıdığı, oktopin plazmidinin TR

bölgesindeki iki genin mannopin sentezi için gerekli bölgesindeki iki genin mannopin sentezi için gerekli olduğu ve diğer bir gen ürününün ise mannopinin olduğu ve diğer bir gen ürününün ise mannopinin agropine dönüşümünü sağladığı bildirilmektedir.

agropine dönüşümünü sağladığı bildirilmektedir.

(16)

T-DNA Bölgesi T-DNA Bölgesi



Bunların dışında, T-DNA bölgesinde bitkilerde Bunların dışında, T-DNA bölgesinde bitkilerde oksin ve sitokininlerin üretimini katalize eden oksin ve sitokininlerin üretimini katalize eden

enzimleri kodlayan

enzimleri kodlayan iaaM iaaM ( ( aux1 aux1 veya veya tms1 tms1 ), ), iaaH iaaH ( ( aux2 aux2 veya veya tms2 tms2 ) ve ) ve ipt ipt ( ( cyt cyt veya veya tmr tmr ) gibi ) gibi

genlerin de bulunduğu tespit edilmiştir.



İaaM İaaM geni, L-triptofanın indol-asetamide geni, L-triptofanın indol-asetamide

dönüşümünü katalize eden mono-oksijenaz dönüşümünü katalize eden mono-oksijenaz

enzimini kodlarken,

enzimini kodlarken, iaaH iaaH geni ise hidrolitik geni ise hidrolitik etkisiyle indol asetamidi indol-3-asetik asite etkisiyle indol asetamidi indol-3-asetik asite

çeviren indol asetamid hidrolazı kodlamaktadır.

(17)

T-DNA Bölgesi T-DNA Bölgesi

 İptİpt geninin ise sitokinin üretiminde görev alan dimetilalil geninin ise sitokinin üretiminde görev alan dimetilalil profosfat-AMP transferaz enziminin üretiminden sorumlu profosfat-AMP transferaz enziminin üretiminden sorumlu

olduğu bildirilmektedir.

 6b6b olarak isimlendirilen bir diğer genin ise yabani tütün olarak isimlendirilen bir diğer genin ise yabani tütün ((Nicotiana glaucaNicotiana glauca) ve ) ve Kalanchoe tubifloraKalanchoe tubiflora’da küçük ’da küçük

tümörler oluşturduğu ifade edilmektedir.

 İaaMİaaM, , iaaH,iaaH, iptipt ve ve 6b6b genlerinin bitki hücrelerine genlerinin bitki hücrelerine

aktarılmasıyla, hücrelerin hormon dengesi bozulmakta aktarılmasıyla, hücrelerin hormon dengesi bozulmakta

ve onkogenik (tümör oluşturan) fenotipler oluşmaktadır.

Bu nedenle de; sözkonusu genlere

Bu nedenle de; sözkonusu genlere onkogenleronkogenler ( (onconc) adı ) adı verilmektedir.

verilmektedir.

(18)

T-DNA Bölgesi T-DNA Bölgesi



Oktopin ve nopalin tipi plazmidlerin T-DNA Oktopin ve nopalin tipi plazmidlerin T-DNA

bölgeleri, sağ (RB/right border) ve soldan (LB/left bölgeleri, sağ (RB/right border) ve soldan (LB/left

border) 24 bp uzunluğundaki düzensiz nükleotid border) 24 bp uzunluğundaki düzensiz nükleotid

dizileri ile sınırlandırılmıştır.



Bu diziler sınır dizileri olarak isimlendirilmektedir. Bu diziler sınır dizileri olarak isimlendirilmektedir.



Genelde, bu diziler arasında bulunan DNA bitki Genelde, bu diziler arasında bulunan DNA bitki hücrelerine aktarılmaktadır.

hücrelerine aktarılmaktadır.



Ancak, bazı durumlarda T-DNA dışındaki Ancak, bazı durumlarda T-DNA dışındaki

bölgelerin de bitki kromozomlarıyla bütünleştiği bölgelerin de bitki kromozomlarıyla bütünleştiği

gözlenmektedir.



Sınır dizileri plazmid tipine göre farklılık Sınır dizileri plazmid tipine göre farklılık gösterebilmektedir.

gösterebilmektedir.

(19)

T-DNA Bölgesi T-DNA Bölgesi



Araştırmalar, iki T-DNA sınırı arasına Araştırmalar, iki T-DNA sınırı arasına

yerleştirilen herhangi bir DNA parçasının yerleştirilen herhangi bir DNA parçasının

kolayca bitki hücresine aktarılabildiğini kolayca bitki hücresine aktarılabildiğini

göstermiştir.



Üstelik, tümör oluşturan genlerin kesici Üstelik, tümör oluşturan genlerin kesici (restriksiyon) enzimler yardımıyla T-DNA (restriksiyon) enzimler yardımıyla T-DNA

bölgesinden çıkarılmasının da bitki bölgesinden çıkarılmasının da bitki

hücresine gen aktarımını hiçbir şekilde hücresine gen aktarımını hiçbir şekilde

engellemediği belirlenmiştir.

(20)

T-DNA Bölgesi T-DNA Bölgesi



Tümör oluşturan genlerin çıkartıldığı plazmidler, Tümör oluşturan genlerin çıkartıldığı plazmidler, non-onkogenik (tümör oluşturmayan) Ti-

non-onkogenik (tümör oluşturmayan) Ti- plazmidler olarak adlandırılmaktadır.

plazmidler olarak adlandırılmaktadır.



Araştırmalar, T-DNA’nın sağ sınır nükleotid Araştırmalar, T-DNA’nın sağ sınır nükleotid dizisinin gen aktarımında mutlak gerekli

dizisinin gen aktarımında mutlak gerekli

olduğunu ortaya koyarken, sol sınırdaki parça olduğunu ortaya koyarken, sol sınırdaki parça eksilmelerinin (delesyonların) bakteriden bitki eksilmelerinin (delesyonların) bakteriden bitki

hücresine genetik materyal aktarımını hücresine genetik materyal aktarımını

etkilemediğini göstermiştir.

(21)

Farklı

Farklı Agrobacterium Agrobacterium

plazmidlerine ait 24 bp’lik T-DNA plazmidlerine ait 24 bp’lik T-DNA

sınır nükleotid dizileri sınır nükleotid dizileri

Ti plazmidi/

opin tipi

opin tipi SınıSını

rr Nükleotid DizisiNükleotid Dizisi KaynakKaynak pTiC58/nopali

pTiC58/nopali nn

pTiC58/nopali pTiC58/nopali nn

SolSol

SağSağ TGGCAGGATATATTGTGGTGTATGGCAGGATATATTGTGGTGTA AAAA

TGACAGGATATATTGGCGGGTA TGACAGGATATATTGGCGGGTA AAAA

Zyprain ve Zyprain ve Kado, 1990 Kado, 1990

pTiT37/nopali pTiT37/nopali nn

pTiT37/

nopalin nopalin

SolSol

SağSağ TGGCAGGATATATTGTGGTGTATGGCAGGATATATTGTGGTGTA AAAA

TGACAGGATATATTGGCGGGTA TGACAGGATATATTGGCGGGTA AAAA

Yadav Yadav ve ve ark., 1982ark., 1982

pTi15955/oct.

TLTL

pTi15955/oct.

TLTL

Sol Sol

SağSağ CGGCAGGATATATTCAATTGTACGGCAGGATATATTCAATTGTA AAAA

TGGCAGGATATATACCGTTGTA TGGCAGGATATATACCGTTGTA ATAT

Barker Barker ve ve ark., 1983ark., 1983

pTiAch5/oct.T pTiAch5/oct.T LL

Sol Sol

SağSağ CGGCAGGATATATTCAATTGTACGGCAGGATATATTCAATTGTA AAAA

GGCAGGATATATACCGTTGTAA GGCAGGATATATACCGTTGTAA TTTT

Gielen Gielen ve ve ark., 1984ark., 1984

pRiA4/agrop.

TLTL

pRiA4/agrop.

TLTL

SolSol

SağSağ TGGCAGGATATATTGTGATGTATGGCAGGATATATTGTGATGTA AAAA

TGACAGGATATATGTTCCTGTC TGACAGGATATATGTTCCTGTC ATAT

Slightom Slightom ve ve ark., 1986ark., 1986

(22)

(23)

Virülens (

Virülens ( vir vir ) bölgesi ) bölgesi



Vir Vir bölgesi, T-DNA aktarımında gerekli olan bölgesi, T-DNA aktarımında gerekli olan ürünlerin önemli bir kısmını sağlamaktadır.

ürünlerin önemli bir kısmını sağlamaktadır.



Bu bölgede meydana getirilen mutasyonların, Bu bölgede meydana getirilen mutasyonların, bitki hücrelerine gen aktarımını önemli ölçüde bitki hücrelerine gen aktarımını önemli ölçüde

engellediği bilinmektedir.



Bu bölgenin, aynı bakteri hücresinde, ancak Bu bölgenin, aynı bakteri hücresinde, ancak

başka bir plazmid üzerinde bulunduğu zaman da başka bir plazmid üzerinde bulunduğu zaman da

T-DNA aktarımının gerçekleşebilmesi onun T-DNA aktarımının gerçekleşebilmesi onun

“trans-hareket” bir yapıda olduğunu

“trans-hareket” bir yapıda olduğunu göstermektedir.

göstermektedir.

(24)

Virülens (

Virülens ( vir vir ) bölgesi ) bölgesi



T-DNA’nın dışında ve sol sınıra yakın olan, T-DNA’nın dışında ve sol sınıra yakın olan, yaklaşık 30-40 kb uzunluğundaki “virulens” (

yaklaşık 30-40 kb uzunluğundaki “virulens” ( vir vir ) ) bölgesi T-DNA aktarımında mutlak gerekli olan 6 bölgesi T-DNA aktarımında mutlak gerekli olan 6 ana operon (VirA, VirB, VirC, VirD, VirE ve VirG) ana operon (VirA, VirB, VirC, VirD, VirE ve VirG)

ve gerekli olmayan diğer 2 operon (VirF ve ve gerekli olmayan diğer 2 operon (VirF ve

VirH)’dan meydana gelmektedir.



VirA, VirG ve VirF operonları tek gene sahipken, VirA, VirG ve VirF operonları tek gene sahipken, VirE, VirC ve VirH operonları ikişer gen

VirE, VirC ve VirH operonları ikişer gen

taşımaktadır. Öte yandan, VirD dört, VirB ise 11 taşımaktadır. Öte yandan, VirD dört, VirB ise 11 gen içermektedir. VirA ve VirG konstitütif (daima gen içermektedir. VirA ve VirG konstitütif (daima

aktif) operonlardır.

(25)

Virülens (

Virülens ( vir vir ) bölgesi ) bölgesi



VirA ve VirG operonları VirA ve VirG operonları vir vir genlerinin genlerinin

aktivitelerini yönlendiren pozitif bir düzenleyici aktivitelerini yönlendiren pozitif bir düzenleyici

sistemini kodlamaktadır.



Vir Vir A geninin üretmiş olduğu hücre içi membran A geninin üretmiş olduğu hücre içi membran proteini yaralanmış bitki hücrelerinin salgıladığı proteini yaralanmış bitki hücrelerinin salgıladığı fenolik bileşikleri tanıyarak onlarla bağlantı kurar fenolik bileşikleri tanıyarak onlarla bağlantı kurar



Daha sonra Daha sonra Vir Vir A geni, muhtemelen protein A geni, muhtemelen protein fosforilasyonu ile bu bilgiyi

fosforilasyonu ile bu bilgiyi Vir Vir G lokusuna aktarır. G lokusuna aktarır.



Sonuçta, uyarılan VirG proteini ise kendi geni ve Sonuçta, uyarılan VirG proteini ise kendi geni ve diğer

diğer vir vir genleri için transkripsiyon işlemcisi genleri için transkripsiyon işlemcisi görevini üstlenmektedir.

görevini üstlenmektedir.

(26)

Virülens (

Virülens ( vir vir ) bölgesi ) bölgesi



VirD operonu, T-DNA iplikciğinin VirD operonu, T-DNA iplikciğinin rejenerasyonunu sağlarken;

rejenerasyonunu sağlarken;



VirC, bu bölgenin sınırlardan kesilmesinde, VirC, bu bölgenin sınırlardan kesilmesinde,



VirB ve VirE operonları ise T-DNA’nın bakteriden VirB ve VirE operonları ise T-DNA’nın bakteriden bitki hücresine hareketinde etkili olmaktadır.

bitki hücresine hareketinde etkili olmaktadır.



VirH operonunun T-DNA transferinde gerekli VirH operonunun T-DNA transferinde gerekli olmadığı bildirilmekle birlikte, bu lokusun

olmadığı bildirilmekle birlikte, bu lokusun kodladığı enzimlerin enfeksiyon sırasında kodladığı enzimlerin enfeksiyon sırasında

bitkinin salgılamış olduğu bakteriyosidal ve bitkinin salgılamış olduğu bakteriyosidal ve

bakteriyostatik bileşiklere karşı bakteriyi bakteriyostatik bileşiklere karşı bakteriyi

koruduğu belirtilmektedir.

(27)

Vir Vir A ve A ve Vir Vir G genlerinin moleküler G genlerinin moleküler karakterizasyonu

karakterizasyonu Vir Vir

geni geni Ti Ti

Plazmid Plazmid i i

Opin Opin

tipi tipi Nükleo Nükleo tid tid

dizisi dizisi (bp) (bp)

Protei Protei n (Da) n (Da)

VirVirAA pTi15955pTi15955 oktopinoktopin 24862486 91.639 91.639 pTiAg162

pTiAg162 oktopinoktopin 25052505 92.44392.443 pTiA6

pTiA6 oktopinoktopin 24872487 91.79791.797 pTiC58

pTiC58 nopalinnopalin 24992499 91.30091.300 VirVirGG pTi15955pTi15955 oktopinoktopin 801801 29.99529.995

pTiA6

pTiA6 oktopinoktopin 801801 30.08330.083 pTiC58

pTiC58 nopalinnopalin 759759 28.40028.400

(28)

(29)

Kromozomal genler Kromozomal genler



Agrobacterium Agrobacterium bakterisinin kendi kromozomu bakterisinin kendi kromozomu üzerinde bulunan dört adet lokus [

üzerinde bulunan dört adet lokus [ chv chv A, A, chv chv B, B, psc psc A ( A ( exo exo C) ve C) ve attR attR ]; bakterinin bitki hücrelerine ]; bakterinin bitki hücrelerine

tutunması, yaralanmış bitki dokularında tutunması, yaralanmış bitki dokularında

bakterinin çoğalması ve Ti plazmidi üzerinde bakterinin çoğalması ve Ti plazmidi üzerinde

bulunan

bulunan vir vir genlerinin düzenlenmesinde rol genlerinin düzenlenmesinde rol oynamaktadır.

oynamaktadır.



Bunlardan, büyüklügü 8.5 kb olan Bunlardan, büyüklügü 8.5 kb olan chv chv B geninin, B geninin, ß-1,2 glukanın oluşumunda etkili olan 235

ß-1,2 glukanın oluşumunda etkili olan 235 kDa’luk bir proteini şifrelediği,

kDa’luk bir proteini şifrelediği,

(30)

Kromozomal genler Kromozomal genler



7 kb büyüklügündeki 7 kb büyüklügündeki chv chv A lokusunun ise A lokusunun ise ß-1,2 glukanın periplazm içerisine

ß-1,2 glukanın periplazm içerisine taşınması için gerekli bileşikleri

taşınması için gerekli bileşikleri sentezlediği,

sentezlediği,



3.0 kb’lik 3.0 kb’lik psc psc A geninin ise nötr ve asidik A geninin ise nötr ve asidik yapıdaki önemli hücre dışı polisakkarid yapıdaki önemli hücre dışı polisakkarid

bileşiklerinin yapılmasında gerekli olduğu bileşiklerinin yapılmasında gerekli olduğu

anlaşılmıştır.

(31)

(32)

T-DNA Aktarımının Moleküler T-DNA Aktarımının Moleküler

Mekanizması Mekanizması



Agrobacterium Agrobacterium ’dan bitki hücrelerine T-DNA ’dan bitki hücrelerine T-DNA aktarımı 4 ana aşamada gerçekleşmektedir aktarımı 4 ana aşamada gerçekleşmektedir



1. 1. Agrobacterium Agrobacterium ’un bitki hücrelerine tutunması ’un bitki hücrelerine tutunması ve koloni oluşturması,

ve koloni oluşturması,



2. virülens genlerinin uyarılması, 2. virülens genlerinin uyarılması,



3. T-DNA transferi, 3. T-DNA transferi,



4. T-DNA’nın bitki genomuna entegrasyonudur. 4. T-DNA’nın bitki genomuna entegrasyonudur.

(33)

Agrobacterium

Agrobacterium ’un bitki hücrelerine ’un bitki hücrelerine tutunması ve koloni oluşturması tutunması ve koloni oluşturması

 AgrobacteriumAgrobacterium’un bitki hücrelerine tutunması ve koloni ’un bitki hücrelerine tutunması ve koloni oluşturması tümör oluşumu için gerekli olan ilk aşamadır.

oluşturması tümör oluşumu için gerekli olan ilk aşamadır.

 AgrobacteriumAgrobacterium hücrelerinin yüzeylerindeki hücrelerinin yüzeylerindeki

polisakkaritlerin bitki hücrelerine tutunmada önemli rol polisakkaritlerin bitki hücrelerine tutunmada önemli rol oynadığı bildirilmektedir.

oynadığı bildirilmektedir.

 Polisakkarit sentezi için 20 kb büyüklüğündeki Polisakkarit sentezi için 20 kb büyüklüğündeki kromozomal

kromozomal attRattR lokusuna ihtiyaç duyulmaktadır. Bu lokusuna ihtiyaç duyulmaktadır. Bu lokus bakterinin bitki hücresine tutunması için gerekli lokus bakterinin bitki hücresine tutunması için gerekli olan genleri taşımaktadır.

olan genleri taşımaktadır.

 Bakteri hücre duvarına tutunduktan sonra bakteri Bakteri hücre duvarına tutunduktan sonra bakteri

tarafından selüloz lifleri sentezlenmekte ve böylece bitki tarafından selüloz lifleri sentezlenmekte ve böylece bitki hücre duvarında çok sayıda bakteri yığılması

hücre duvarında çok sayıda bakteri yığılması gözlenmektedir.

gözlenmektedir.

(34)

Agrobacterium

Agrobacterium ’un bitki hücrelerine ’un bitki hücrelerine tutunması ve koloni oluşturması tutunması ve koloni oluşturması

 Kromozomal Kromozomal chvAchvA, _,chvBchvB ve _vepscApscA virülens genlerinin ß-1,2 virülens genlerinin ß-1,2

glukan ve diğer şekerlerin sentezlenmesinde ve dolaylı olarak glukan ve diğer şekerlerin sentezlenmesinde ve dolaylı olarak

bakterinin tutunmasında rol aldığı belirtilmektedir bakterinin tutunmasında rol aldığı belirtilmektedir

 AgrobacteriumAgrobacterium enfeksiyonunun sadece düşük molekül ağırlıklı enfeksiyonunun sadece düşük molekül ağırlıklı fenolik bileşikleri salgılayan, yaralanmış veya hızlı bölünen

fenolik bileşikleri salgılayan, yaralanmış veya hızlı bölünen süspansiyon hücreleri ile

süspansiyon hücreleri ile AgrobacteriumAgrobacterium enfeksiyonuna karşı enfeksiyonuna karşı duyarlı bitki hücrelerinin bulunması durumunda

duyarlı bitki hücrelerinin bulunması durumunda gerçekleşebildiği bilinmektedir.

gerçekleşebildiği bilinmektedir.

 Bakteri yaralanmış bitki dokularının hücre duvarlarına Bakteri yaralanmış bitki dokularının hücre duvarlarına

tutunmakta ve bu olayda bitki hücre yüzeylerinde bulunan tutunmakta ve bu olayda bitki hücre yüzeylerinde bulunan

proteaz-duyarlı moleküllerin etkili olduğu belirtilmektedir proteaz-duyarlı moleküllerin etkili olduğu belirtilmektedir

(35)

Virülens genlerinin uyarılması Virülens genlerinin uyarılması

 Bakteri bitki hücre duvarına tutunduktan Bakteri bitki hücre duvarına tutunduktan sonra, yaralanmış bitki hücrelerinden

sonra, yaralanmış bitki hücrelerinden salgılanan fenolik bileşikleri,

salgılanan fenolik bileşikleri, AgrobacteriumAgrobacterium’un ’un algılamasıyla T-DNA aktarım işlemi başlatılır.

algılamasıyla T-DNA aktarım işlemi başlatılır.

 Normalde bitkilerde fitoaleksin ve lignin Normalde bitkilerde fitoaleksin ve lignin biyosentezinde rol aldığı tahmin edilen biyosentezinde rol aldığı tahmin edilen

asetosringon (AS) gibi fenolik bileşikler, asetosringon (AS) gibi fenolik bileşikler,

bakteri hücresine girerek

bakteri hücresine girerek virvir genlerini genlerini uyarmaktadır.

uyarmaktadır.

(36)

Virülens genlerinin uyarılması Virülens genlerinin uyarılması



Fenolik bileşiklerle birlikte bu uyarılma Fenolik bileşiklerle birlikte bu uyarılma işleminde belirli monosakkaritler de rol işleminde belirli monosakkaritler de rol

oynamaktadır.



Optimum T-DNA aktarımı için, sıcaklık Optimum T-DNA aktarımı için, sıcaklık 20-30 ˚C arasında olmalıdır. 32 ˚C’den 20-30 ˚C arasında olmalıdır. 32 ˚C’den

daha yüksek sıcaklıklar

daha yüksek sıcaklıklar vir vir genlerinin genlerinin ifadelerini engellemektedir.

ifadelerini engellemektedir.

(37)

Virülens genlerinin uyarılması Virülens genlerinin uyarılması

 AgrobacteriumAgrobacterium bakterisinin hücre zarı içerisinde bakterisinin hücre zarı içerisinde lokalize olan algılayıcı/sensör VirA proteini (91.6 lokalize olan algılayıcı/sensör VirA proteini (91.6

kDa) yaralanmış hücre tarafından salgılanan kDa) yaralanmış hücre tarafından salgılanan

sinyal proteinlerini, yani fenolik bileşikleri yakalar sinyal proteinlerini, yani fenolik bileşikleri yakalar

ve uyarılır.

 Uyarılan VirA kendi fosfatını sitoplazmik bir DNA Uyarılan VirA kendi fosfatını sitoplazmik bir DNA bağlanma proteini (binding protein) olan VirG bağlanma proteini (binding protein) olan VirG proteinine aktarma kapasitesine sahiptir. VirA proteinine aktarma kapasitesine sahiptir. VirA tarafından fosforilizasyona uğrayan VirG daha tarafından fosforilizasyona uğrayan VirG daha

sonra diger

sonra diger virvir genlerinin ifadelerinin genlerinin ifadelerinin

düzenlenmesinde transkripsiyonal faktör olarak düzenlenmesinde transkripsiyonal faktör olarak

görev yapar görev yapar

(38)

T-DNA transferi T-DNA transferi



Vir Vir genlerinin uyarılmasının sonucunda, T- genlerinin uyarılmasının sonucunda, T-

DNA’nın alt sarmalının her iki 24 bp sınırının 3.

ve 4. nükleotid dizileri arasındaki belirli bir ve 4. nükleotid dizileri arasındaki belirli bir

noktada çentik oluşmasıyla başlar.



Bu işlem, VirD1 ve VirD2 proteinlerinin T-DNA Bu işlem, VirD1 ve VirD2 proteinlerinin T-DNA sınır bölgelerindeki nükleotid dizilerini belirli sınır bölgelerindeki nükleotid dizilerini belirli

noktalardan tanıyan endonükleaz etkisi noktalardan tanıyan endonükleaz etkisi

tarafından gerçekleştirilmektedir.



VirD1 proteininin 24 bp sınır dizilerinde DNA’yı VirD1 proteininin 24 bp sınır dizilerinde DNA’yı gevşettiği, VirD2’nin ise çentik oluşturduğu

gevşettiği, VirD2’nin ise çentik oluşturduğu bildirilmektedir.

bildirilmektedir.

(39)

T-DNA transferi T-DNA transferi



VirC operon ürünlerinin ise T-DNA sınır kesimini VirC operon ürünlerinin ise T-DNA sınır kesimini hızlandırdığı gösterilmiştir.

hızlandırdığı gösterilmiştir.



Kesilen noktalar, tek sarmal T-DNA bölgesi için Kesilen noktalar, tek sarmal T-DNA bölgesi için başlama ve bitiş yerleri olarak kullanılmaktadır.

başlama ve bitiş yerleri olarak kullanılmaktadır.

T-iplikcik sentezinin sağ sınırdan başladığını, T-iplikcik sentezinin sağ sınırdan başladığını, 5’ 5’   3’ yönünde devam ettiğini ve sol sınırın 3’ yönünde devam ettiğini ve sol sınırın

yokluğunda dahi sentezin sonuçlandığını yokluğunda dahi sentezin sonuçlandığını

göstermektedir.

(40)

T-DNA transferi T-DNA transferi

 Nopalin tipi plazmidler sadece bir T-DNA bölgesi Nopalin tipi plazmidler sadece bir T-DNA bölgesi taşıdığından dolayı tek T-iplikciği sentezlenir. Öte taşıdığından dolayı tek T-iplikciği sentezlenir. Öte

yandan, daha karmaşık oktopin Ti plazmidler, dört ayrı yandan, daha karmaşık oktopin Ti plazmidler, dört ayrı T-DNA sınır dizileri tarafından çevrelenen üç ayrı T-DNA T-DNA sınır dizileri tarafından çevrelenen üç ayrı T-DNA bölgesi taşıdığından, altı olası T-iplikciği üretirler.

bölgesi taşıdığından, altı olası T-iplikciği üretirler.

 VirD2 proteini, alt sarmalı sağ sınır bölgesinden kestikten VirD2 proteini, alt sarmalı sağ sınır bölgesinden kestikten sonra tek sarmalın 5’ ucunda bağlı kalarak T-iplikciğinin sonra tek sarmalın 5’ ucunda bağlı kalarak T-iplikciğinin serbest kalmasını ve 5’

serbest kalmasını ve 5’3’ yönünde oluşan 3’ yönünde oluşan ekzonukleolitik degredasyonu engellemektedir.

ekzonukleolitik degredasyonu engellemektedir.

 Serbest kalan T-iplikciği, VirE operonununca kodlanan 69 Serbest kalan T-iplikciği, VirE operonununca kodlanan 69 kDa’luk tek sarmal DNA-bağlanma proteini VirE2 ile

kDa’luk tek sarmal DNA-bağlanma proteini VirE2 ile kaplanarak nükleaz enzimlerinin olumsuz etkilerinden kaplanarak nükleaz enzimlerinin olumsuz etkilerinden korunur.

korunur.

(41)

T-DNA transferi T-DNA transferi

 Ayrıca, VirE2 proteini T-iplikciğini sararak, Ayrıca, VirE2 proteini T-iplikciğini sararak,

kompleksin çapını 2 nm’ye kadar düşürmekte ve kompleksin çapını 2 nm’ye kadar düşürmekte ve

bu da hücre zarı açıklıklarından geçişini bu da hücre zarı açıklıklarından geçişini

kolaylaştırmaktadır.

 T-iplikciğinin bitki hücrelerine aktarılmasında, T-iplikciğinin bitki hücrelerine aktarılmasında, VirD2 proteininin pilot görevi yapmaktadır.

VirD2 proteininin pilot görevi yapmaktadır.

 VirB proteinlerinin önemli bir kısmı bakteri ve VirB proteinlerinin önemli bir kısmı bakteri ve bitki hücre zarında T-kompleksinin geçebileceği bitki hücre zarında T-kompleksinin geçebileceği

büyüklükte açıklık oluştururken, T-DNA büyüklükte açıklık oluştururken, T-DNA

transferinde gerekli olan temel elementleri de transferinde gerekli olan temel elementleri de

oluşturmaktadırlar.

(42)

T-DNA’nın bitki genomuna entegrasyonu



Agrobacterium’dan bitki hücrelerine T-DNA transferinin en az anlaşılan kısmı belki de T- DNA’nın bitki genomuna entegrasyonudur.



T-DNA çekirdeğe girdikten sonra, bir veya birkaç kopya halinde rastgele, bitki kromozomlarıyla

birleşmekte ve bu birleşmede kromozomların aktif

kısımları tercih edilmektedir.

(43)

T-DNA’nın bitki genomuna entegrasyonu



Bitki hücresi içerisinde tek sarmal T-DNA kompleksinin çekirdek zarını geçerek

kromozomlara yönelmesinde en önemli görevi VirD2 ve VirE2 proteinleri üstlenmektedir.



T-DNA’nın kromozomlarla birleşme işlemini sağ

sınırdan başlamakta ve karmaşık birkaç aşamada

tamamlanmaktadır.

(44)

T-DNA’nın bitki genomuna entegrasyonu

 VirD2’nin bağlı bulunduğu T-iplikciği ile bitki DNA’sında

mikro-homolog bölgeler açılmakta ve T-DNA’nın 3’ ucu veya bu uca yakın bölgeler bitki DNA’sında buldukları homolog bölgelerle ilk teması (sinapsis) kurmaktadır.

 Bitki DNA’sında 3’5’ yönünde yapısal açıklık oluşmakta ve bu açıklığın 3’ ucu endonükleaz enzimleri tarafından

kesilerek, T-iplikciğinin VirD2 proteinine bağlanan 5’ ucundaki ilk nükleotid üst sarmal bitki DNA’sıyla 5’3’ yönünde

eşleşmektedir.

 T-iplikciğinin 3’ ucundaki fazla bölgeler ve açılan bitki DNA parçası endonükleaz veya 3’5’ ekzonükleaz enzimleri tarafından parçalanmaktadır.

(45)

T-DNA’nın bitki genomuna entegrasyonu

 T-iplikciğinin VirD2’ye bağlanan 5’ ucu ve diğer 3’ ucu,

kesilen bölgeden bitkinin alt sarmal DNA’sı ile birleşmektedir.

 T-iplikciğinin 3’5’ yönündeki bitki DNA sarmalına entegrasyonu tamamlandıktan sonra, bitki DNA’sı

onarılmakta ve T-iplikciği replikasyonla çift sarmal DNA’ya dönüşmektedir.

 T-DNA, köken olarak prokaryotik yapıda olmasına karşın, bitkinin kromozomuyla bütünleşmesinden sonra ökaryotik kromatin yapı özelliklerine uyum sağlamaktadır. T-DNA’nın opin sentezi ve onc genlerinin transkripsiyonları neticesinde opin üretimi ve tümör oluşumu meydana gelmektedir.

(46)

(47)

(48)

“ “ T-pilus” Teorisi T-pilus” Teorisi



Son yıllarda yapılan araştırmalarda, Son yıllarda yapılan araştırmalarda, Agrobacterium

Agrobacterium ’dan bitki hücrelerine T- ’dan bitki hücrelerine T-

kompleksinin aktarılmasında yukarıda belirtilen kompleksinin aktarılmasında yukarıda belirtilen

mekanizma haricinde degişik teoriler ortaya mekanizma haricinde degişik teoriler ortaya

atılmıştır.



Bunlardan ilkinde; “T-pilus” olarak adlandırılan Bunlardan ilkinde; “T-pilus” olarak adlandırılan bir nükleoprotein kompleksinin T-DNA

bir nükleoprotein kompleksinin T-DNA

aktarımında köprü görevi yaptığı belirtilmektedir.



T-pilus 10 nm çapında olup, ortasında yaklaşık 2 T-pilus 10 nm çapında olup, ortasında yaklaşık 2 nm çapında bir lumen (boşluk) bulunmaktadır.

nm çapında bir lumen (boşluk) bulunmaktadır.

(49)

“ “ T-pilus” Teorisi T-pilus” Teorisi

 T-pilus’unun moleküler bir şırınga görevi yaparak T-T-pilus’unun moleküler bir şırınga görevi yaparak T- kompleksini bitki hücre sitoplazmasına enjekte ettiği kompleksini bitki hücre sitoplazmasına enjekte ettiği bildirilmektedir.

bildirilmektedir.

 Diğer bir teoriye göre de; T-pilus kompakt bir yapıya Diğer bir teoriye göre de; T-pilus kompakt bir yapıya dönüşerek, bakteri hücresini bitki hücresine doğru dönüşerek, bakteri hücresini bitki hücresine doğru çekmekte ve bakteri ile bitki hücre zarı arasında çekmekte ve bakteri ile bitki hücre zarı arasında

gerçekleşen füzyondan sonra, VirB proteinleri tarafından gerçekleşen füzyondan sonra, VirB proteinleri tarafından oluşturulan gözenekten T-kompleksi bitki hücresine

oluşturulan gözenekten T-kompleksi bitki hücresine aktarılmaktadır.

aktarılmaktadır.

(50)

(51)

Kado 2000