T.C.
ERCİYES ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
BİYOLOJİ ANABİLİM DALI
TÜRKİYE' DE YAYILIŞ GÖSTEREN CROCIDURA
(SORICOMORPHA: MAMMALIA) CİNSİNİN MİTOKONDRİYAL SİTOKROM B DİZİ ANALİZİ KULLANARAK MOLEKÜLER
FİLOGENİSİ
Hazırlayan Metin KILIÇ
Danışman
Prof. Dr. Coşkun TEZ
Yüksek Lisans Tezi
Aralık 2011 KAYSERİ
Yü ksek L isan s Tez i Tezi Hazı rl ay an Metin K IL IÇ Biy o lo ji An ab ilim D alı 2011
T.C.
ERCİYES ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
BİYOLOJİ ANABİLİM DALI
TÜRKİYE' DE YAYILIŞ GÖSTEREN CROCİDURA
(SORICOMORPHA: MAMMALIA) CİNSİNİN MİTOKONDRİYAL SİTOKROM B DİZİ ANALİZİ KULLANARAK MOLEKÜLER
FİLOGENİSİ (Yüksek Lisans Tezi)
Hazırlayan Metin KILIÇ
Danışman
Prof. Dr. Coşkun TEZ
Bu çalışma; Erciyes Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından FBD-10-3255 kodlu proje ile desteklenmiştir.
Aralık 2011
KAYSERİ
v
TEŞEKKÜR
Her konuda yardımlarını, bilgilerini ve değerli zamanlarını benden esirgemeyen danışman hocam Prof. Dr. Coşkun TEZ ve doktora öğrencisi Uzm. Osman İBİŞ’ e, bana laboratuarını açarak çalışmama imkan sağlayan ve çalışmalarım sırasında bilgilerini benimle paylaşan sayın Yrd. Doç. Dr. Servet Özcan’ a en içten teşekkürlerimi sunarım.
Laboratuara geldiğim ilk günden beri bana olan içten gülümseyişlerinden dolayı ablalarım Güler TOPRAK ve DİLEK CEYLAN, değerli arkadaşlarım Murat TELCİOĞLU, Tuğba DİŞÇİ, Dilek DABANLI, Ebru KARADAŞ, Handan ŞAPÇI, ve Leyla KIRIM teşekkürlerimi sunarım.
Bu çalışmayı maddi olarak FBY-10-3255 kodlu proje ile destekleyen ErciyesÜniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimine teşekkür ederim.
Benim bugünlere gelmemde durumum ne olursa olsun, maddi manevi beni her şartta destekleyen dünyadaki tek varlıklarım olan canımdan değerli annem Sayime KILIÇ, babam Haydar KILIÇ ve kardeşlerim Murat Mert ve Perihan KILIÇ’ a sonsuz ve en değerli teşekkürlerimi sunarım.
Türkiye’ de Yayılış Gösteren Crocidura (Soricomorpha: Mammalia) Cinsinin Mitokondriyal Sitokrom b Dizi Analizi Kullanarak Moleküler Filogenisi
Metin KILIÇ
Erciyes Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü Yüksek Lisans Tezi, 2011
Tez Danışmanı: Prof. Dr. Coşkun TEZ Özet
Bu çalışmada, Türkiye’ deki sivri burunlu beyaz dişli fare benzeri böcekçillerin (Crocidura cinsi) filogenetik ilişkilerini ve genetik varyasyonlarını ortaya çıkarmak için Crocidura cinsine ait 80 örneğin mitokondriyal sitokrom b genine ait 381 bazlık kısmın başarılı bir şekilde dizi analizi yapıldı. Toplam 36 haplotip belirlendi ve bu haplotipler, maximum parsimony, neighbor joining ve maximum likelihood metotlarının kullanıldığı filogenetik analizlere göre iki ana soy hattına (C. suaveolens için 29 and C.
leucodon için yedi haplotip) ayrıldı. İki tür arasındaki genetik uzaklıklar (K2P) 0.144 ile 0.165 arasında değişirken ortalama genetik uzaklık ise 0.1545’ dir. Haplotip çeşitliliği (Hd), C. suaveolens için 0.8951 ve C. leucodon için 0.8901’ dir.
Türkiye ve yakın bölgelerine ait Gen Bankası’ ndan elde edilen ve bu çalışmada bulunan toplam 105 haplotipi içeren kapsamlı bir analizlerde, Türkiye’ deki sivri burunlu beyaz dişli fare benzeri böcekçillerin daha önceki karyolojik ve morfolojik verilerin önerdiği gibi güçlü bir şekilde iki ana soy hattına (C. suaveolens and C.
leucodon) ait olduğunu teyit etmektedir.
Anahtar Kelimeler: Crocidura, mtDNA, Sitokrom b, Türkiye
vii
Molecular Phylogeny of the Genus Crocidura (Soricomorpha: Mammalia) Distributed in Turkey Using Mitochondrial Cytochrome b Sequences
Metin KILIÇ
Erciyes University, Graduate School of Natural and Applied Sciences M.Sc. Thesis, 2011
Thesis Supervisor: Prof. Dr. Coşkun TEZ Abstract
In this study, to reveal genetic variations and phylogenetic relationships of Turkish white-toothed shrews (the genus Crocidura), 80 samples of the genus Crocidura were successfully sequenced for 381 bp of the mitochondrial DNA cytochrome b. In total, 36 haplotypes were identified and classified into two main clades (29 haplotypes for C.
suaveolens and seven haplotypes for C. leucodon) based on phylogenetic analysis using the maximum parsinomy, neighbor joining and the maximum likelihood methods. The genetic distances (K2P) among two species ranged from 0.144 to 0.165, with an average of 0.1545, in the partial cytochrome b sequences. Haplotype diversities (Hd), were 0.8951 and 0.8901 (respectively C. suaveolens, C. leucodon). Additionally, an extended analysis, including 105 haplotypes from this study and those from GenBank belonging to Turkey and its neighboring regions, was also confirming that Turkish white-toothed shrews strongly belong to the two main clades (C. suaveolens and C. leucodon), as previously noted by karyological and morphological data.
Keywords: Crocidura, mtDNA, Cytochrome b, Turkey
İÇİNDEKİLER
TÜRKİYE’ DE YAYILIŞ GÖSTEREN CROCIDURA (SORICOMORPHA:
MAMMALIA) CİNSİNİN MİTOKONDRİYAL SİTOKROM B DİZİ ANALİZİ KULLANARAK MOLEKÜLER FİLOGENİSİ
Sayfa
BİLİMSEL ETİĞE UYGUNLUK SAYFASI………...ii
YÖNERGEYE UYGUNLUK SAYFASI ………...iii
KABUL VE ONAY SAYFASI………iv
TEŞEKKÜR………...v
ÖZET………....vi
ABSTRACT………vii
İÇİNDEKİLER………...…viii
TABLOLAR LİSTESİ………..x
ŞEKİLLER LİSTESİ………....xi
KISALTMALAR………...xiii
GİRİŞ……….………...1
1. BÖLÜM GENEL BİLGİLER 1.1. Familya: Soricidae………4
1.2. Cins: Crocidura Wagler, 1832………...………...4
1.2.1. Tür: Crocidura leucodon (Hermann, 1780)…………...…...…………...5
1.2.2. Tür: Crocidura suaveolens (Palas, 1811)………..………...……….5
1.2.3. Tür: Crocidura arispa Spitzenberger, 1971………...……..5
1.3. Mitokondrial DNA (mtDNA)’ nın Moleküler Belirteç olarak Kullanımı…...…5
2. BÖLÜM MATERYAL VE METOT 2.1. Crocidura Örneklerinin Toplanması ve Saklanması…………..………….……..8
2.2. Mitokondrial DNA’ nın Sitokrom b (cyt b) Gen Bölgesinin Kısmi Dizi Analizi………..………..8
ix
2.2.1. Total DNA İzolasyonu İşlemleri………...8
2.2.2. Total DNA’ nın Agaroz Jelde Yürütülmesi ve Görüntülenmesi…….13
2.2.3. Mitokondrial DNA’ nın Sitokrom b Gen Bölgesinin PCR İle Çoğaltılması………..………14
2.2.4. Çoğaltılan PCR Ürünlerinin Agaroz Jelde Görüntülenmesi………...16
2.2.5. Kısmi Sitokrom b Gen Bölgesinin DNA Dizilerin Hizalanması ve Düzenlenmesi…………..………..17
2.2.6. Crocidura Örneklerinin Filogenetik Analizleri……….18
3. BÖLÜM BULGULAR 3.1. Crocidura Wagler, 1832 Cinsine Ait Örneklerin mtDNA Sitokrom b Geninin Kısmi Dizi Analizi………...………21
3.1.1. Crocidura suaveolens (Pallas, 1811)………...………….………21
3.1.2. Crocidura suaveolens’ e ait mtDNA Sitokrom b Haplotipleri…..……21
3.1.3. Crocidura leucodon (Hermann, 1780)………...………….……26
3.1.4. Crocidura leucodon’ a Ait mtDNA Sitokrom b Haplotipleri...……27
3.2. mtDNA Sitokrom b Geninin Kısmi Dizi Analizi………..30
3.2.1. Çalışılan Bölgeden Elde Edilen Dizinin Yapısı ve Varyasyonu……...30
3.2.2. Bu Çalışmada Tespit Edilen Crocidura Haplotiplerinin Filogenetik Analizleri……….30
3.3. Bu Çalışmada Tespit Edilen Haplotipler ile Türkiye ve Yakın Çevresinden Gen Bankası’ nda Bulunan Crocidura Cinsine Ait Haplotiplerin Filogenetik Analizi……….36
4. BÖLÜM TARTIŞMA – SONUÇ VE ÖNERİLER 4.1. Tartışma………..41
4.2. Sonuç ve Öneriler………...46
KAYNAKLAR………...49
ÖZGEÇMİŞ………...57
TABLOLAR LİSTESİ
Tablo 2.1. Tablo 2.1. Crocidura cinsine ait örneklerin toplandığı lokaliteler (E, erkek;
K, dişi)………...10 Tablo 3.1. C. suaveolens'e ait örneklerin lokalite bilgileri ve tespit edilen mtDNA
sitokrom b haplotipleri…..………..22 Tablo 3.2. Bu çalışmada mtDNA analizi yapılan 66 C. suaveolens örneğinden tespit
edilen 29 haplotipin konsensus baz dizisi..………26 Tablo 3.3. Bu çalışmada mtDNA analizi yapılan 14 C. leucodon örneğinden tespit
edilen 11 haplotipin konsensus baz dizisi……..………27 Tablo 3.4. C. leucodon’ a ait örneklerin lokalite bilgileri ve tespit edilen mtDNA
sitokrom b haplotipler……..………..28 Tablo 3.5. Türkiye’ nin farklı lokalitelerinden toplanmış C. suaveolens ve C.
leucodon’a ait toplam 36 haplotipin baz kompozisyon..……..………29 Tablo 3.6 C. suaveolens (TR-Suv) ve C. leucodon (TR-Leu)'a ait Kimura 2-Parametre (K2P) baz değişim metodu kullanılarak tahmin edilen genetik uzaklıklar (distance)...………..35 Tablo 3.7. Bu çalışmada tespit edilenler ve Gen Bankası’ndan elde edilen cyt b
haplotiplerinin 252 bç uzunluğuna göre yeniden düzenlenmesiyle oluşturulan 252 baz uzunluğunda aynı diziye ait haplotipler……...………….………...39
xi
ŞEKİLLER LİSTESİ
Şekil 1.1. Anaya ait kalıtım modelini gösteren bir soy ağacı…....…....………6 Şekil 1.2. Mitokondriyal DNA’ daki genler ve genlerin dizilimi ………….…..…...…6 Şekil 2.1. Crocidura örneklerinin toplandığı lokaliteler………...9 Şekil 2.2. Total DNA izolasyonu gerçekleştirilmiş Crocidura cinsine ait bazı örneklerin agaroz jel görüntüsü...……….14 Şekil 2.3. Crocidura örneklerinden sitokrom b genini amplifiye etmek için kullanılan
L14724 ve H15149 primerlerinin PCR stratejesi…...…...……….15 Şekil 2.4. Crocidura örneklerinden elde edilen total DNA’lar kullanılarak L14724 ve
H15149 primeleri yardımıyla çoğaltılan PCR ürünlerinin agaroz jelde görüntüsü………16 Şekil 2.5. 502 numaralı Crocidura örneğine ait L14724 no' lu primer ile elde edilmiş
DNA dizi diyagramı………17 Şekil 2.6. 502 numaralı Crocidura örneğine ait H15149 no' lu primer ile elde edilmiş
DNA dizi diyagramı...………17 Şekil 2.7. C. suaveolens türüne ait Gen Bankası’ ndan elde edilen haplotiplerin
toplandığı bölge……….………...………19 Şekil 2.8. C. leucodon türüne ait Gen Bankası’ ndan elde edilen haplotiplerin toplandığı
bölge……….……….20 Şekil 3.1. C. suaveolens örneklerinin toplandığı lokaliteler ve tespit edilen haplotiplerin dağılımı (Haplotip no/ Harita no)……..………26 Şekil 3.2. C. leucodon örneklerinin toplandığı lokaliteler ve tespit edilen haplotiplerin
dağılımı (Haplotip no/ Harita no)………...………29 Şekil 3.3. C. suaveolens ve C. leucodon’ a ait mtDNA cyt b dizileri (381 bç)
kullanılarak üretilen MP ağacı (Bootstrap değeleri: >50%) (C. suaveolens:
TR-Suv; C. leucodon: R-Leu)………..………..32 Şekil 3.4. C. suaveolens ve C. leucodon' a ait mtDNA cyt b dizileri (381 bç) kullanarak
Kimura 2 Parametre metodu ile üretilen Neighbor Joining ağacı (C.
suaveolens: TR-Suv; C. leucodon: TR-Leu)……….33 Şekil 3.5. Crocidura haplotiperi arasındaki filogenetik ilişkiyi gösteren en yüksek
bootstrap değerini veren Tajime–Nei baz değişim modeli kullanılarak üretilen NJ ağacı (C. suaveolens: TR-Suv; C. leucodon: TR-Leu)…..……...……….34
Şekil 3.6. Türkiye’ yi temsil eden 36 adet C. suaveolens haplotipi arasındaki filogenetik ilişkiyi gösteren K2P baz değişim modeli kullanılarak üretilen NJ ağacı….38 Şekil 3.7. Bu çalışmada tespit edilenler ve Gen Bankası’ndan toplanan Türkiye ve yakın
çevresine ait Crocidura haplotipleri arasındaki filogenetik ilişkiyi gösteren K2P modeli kullanılarak üretilen NJ ağacı………....40
xiii
KISALTMALAR bç: Baz çifti
cty b : Sitokrom b
dNTP : Di Nükleotid Tri-Fosfat dk: Dakika
kb: Kilobaz
K2P: Kimura 2 Parametre mg : Miligram
mM: Milimolar ml: Mililitre µl: Mikrolitre µM: Mikromolar
mtDNA : Mitokondrial DNA MP: Maksimum Parsimoni NJ: Neighbor Joninig
TAE: Trisma Base, Glacial Asetic Acid, EDTA UV: Ultraviyole
u: Ünite V: volt
GİRİŞ
Palaearktik bölge türlerinin çoğunun yayılışı, büyük oranda Pleistosen döneminin ağır iklim şartlarından etkilenmiştir. Bu ağır iklim şartları, türlerin ve popülasyonların genomunda değişiklikler meydana getirmek suretiyle defalarca birçok türü baskı altında tutmuştur [1, 2]. Palaearktik bölgeyi kapsayan filocoğrafik çalışmaların çoğu, Pleistosen dönemi boyunca İberya, Apenin, Balkanlar ve Anadolu’ nun potansiyel buzul sığınakları olduğunu göstermektedir [3 - 6]. İberya, Apenin ve Balkanlar’ da yayılış gösteren ılıman iklimi seven türlerin önemli bir kısmı için filocoğrafik çalışmalar mevcut olmasına rağmen Anadolu’ da yayılış gösteren türlerin ya da tür soy hatlarının buzul dönemi tarihleri üzerine şu anda pek fazla çalışma bulunmamaktadır [5 - 9].
Anadolu coğrafyası, iklimi, vejetasyonu, heterojen topografyası ve jeolojik tarihinden dolayı memeli biyocoğrafyası için gizemli ve ilginç bir alanı oluşturmaktadır [10].
Memeli türleri bakımından nispeten zengin olan Türkiye’ de 148 civarında tür yayılış göstermektedir [11].
Memeliler sınıfı içerisinde yer alan böcekçil memeliler (sivri burunlu fare benzeri böcekçil memeliler, köstebekler, kirpiler, v.b.) yakın zamana kadar Insectivora takımı içerisindeyken günümüzde Erinaceomorpha (kirpigiller), Soricomorpha (sivri burunlu fare benzeri böcekçil memeliler ve köstebekler) ve Afrosoricida (tenrekler) adı altında üç takıma ayrılmıştır. Ülkemizde yayılış gösteren böcekçil memeliler, Erinaceomorpha ve Soricomorpha takımları içerisinde yer almaktadır. Soricidae familyası içerisinde, üç alt familya (Crocidurinae, Myosoricinae ve Soricinae) ve bu alt familyalara dahil edilen 26 cins mevcuttur [12].
Sivri burunlu beyaz dişli fare benzeri böcekçil memeliler olarak bilinen Crocidura Wagler, 1832 cinsi, Soricidae familyasının Crocidurinae alt familyası içerisinde yer almaktadır. Crocidura cinsi dünyada Etiyopya (Afrika), Palaearktik ve Oriental zoocoğrafik bölgelerinde geniş yayılış göstermektedir. Bu cins, hem memeliler sınıfı hem de Soricidae familyası içerisinde en fazla türe sahip cinslerden biri olup,
2
günümüzde 172 türle temsil edilmektedir [12]. Son bilgilere göre ülkemizde Crocidura cinsine ait üç tür yayılış göstermektedir. Bu türler, Crocidura suavoelens (Pallas, 1811), C. leucodon (Hermann, 1780) ve C.arispa Spitzenberger, 1971’ dir [10 - 12].
Türkiye’ de yayılış gösteren Crocidura cinsi ile ilgili son 30 yıl içerisinde yapılan çalışmalarda morfolojik çalışmaların yerini karyolojik ve moleküler tabanlı çalışmalar almaya başlamıştır. Şimşek [13]’ in kafatası ve post özelliklerine dayalı detaylı morfolojik çalışmasından sonra Türkiye’ den Crocidura örneklerinin de yer aldığı çalışmada Catzeflis et al. [14], dört lokaliteden elde edilen örneklerin morfolojik ve karyolojik analizini yapmış ve bu örneklerin bir kısmını 2n= 28, NF= 54 - 56 karyotipli C. leucodon - lasia olarak bir kısmını ise 2n= 40 ve NF= 50 karyotipli C. suaveolens olarak değerlendirmişlerdir. Vogel et al. [15],morfolojik ve karyolojik özelliklerin yanı sıra Türkiye’ den dört lokaliteden topladıkları örneklerden enzim elektroforezinden elde ettikleri verilere göre Crocidura örneklerini C. suaveolens olarak değerlendirmişler ve Türkiye örnekleri için moleküler metodlara dayalı ilk filogenetik ağacı da enzim elektroforezinden elde edilen verilerden oluşturmuşlardır. Kefelioğlu ve Tez [16], Tez ve Kefelioğlu [17] ve Tez [18], Crocidura cinsinin Türkiye’deki son taksonomik durumu üzerine detaylı morfolojik ve karyolojik çalışmalar yapmışlar ve Türkiye’ de 2n= 28 ve 2n= 40 karyotipli iki türün yayılış gösterdiğini belirtmişlerdir. Krystufek ve Vohralik [10]’ in, Türkiye ve Kıbrıs Memelileri isimli eserinde değişik araştırıcılara ait bilgiler ile kendi bilgilerine göre Türkiye’ de C. suavoelens, C. leucodon ve C. arispa türleri yayılış göstermektedir. Türkiye Crocidura örneklerini de kapsayan morfolojik çalışmada Jianga ve Hoffmann [19], Türkiye örneklerini C. suavoelens olarak rapor ettiler. İç Anadolu Bölgesi’ den Crocidura örneklerinin morfolojik ve allozim varyasyonlarını araştıran Haskılıç [20], her iki veriye göre çalıştığı örneklerinin C.
suavoelens’ e ait olduğunu belirtmiştir. Tez ve ark., [21] ise enzim elektroforezi yardımıyla Türkiye’ den Crocidura cinsine ait örneklerin esteraz varyasyonunu araştırdılar ve trimeric esteraz kaydı verdiler.
Türkiye’ den Crocidura cinsine ait örneklerin dahil olduğu mtDNA ve nuklear DNA belirteçlerinin kullanıldığı çalışmalar, yaklaşık son on yıla aittir [22-28]. Türkiye’ deki Crocidura cinsine ait örneklerin kullanıldığı DNA tabanlı ilk çalışma Vogel et al. [22]
tarafından yapılmıştır. Vogel et al. [22] ve Dubey et al. [23] mtDNA cyt b geninin, Dubey et al. [24 - 28] ise hem mtDNA (cyt b ve 16S) hem de nuklear DNA (BRCA1 ve
ApoB) genlerinin değişik uzunluktaki dizilerini filogenetik analizlerde kullandılar ve bu araştırıcılar Crocidura cinsine ait Türkiye örneklerinden elde edilen haplotiplerin filogenetik analizler sonucunda C. suaveolens ve C. leucodon türlerine ait olduğunu belirttiler.
Bu çalışmanın amacı, Türkiye’ de yayılış gösteren Crocidura cinsine ait örneklerin mtDNA sitokrom b geninin kısmi dizi analizi yardımıyla genetik varyasyonunu ortaya çıkarmak, mtDNA sitokrom b geninin kısmi dizi analizi yapılan Crocidura örneklerinin hangi türlere ait olduğunu ve birden fazla tür varsa ve bu türler arasındaki filogenetik ilişkiyi tespit etmektir.
1. BÖLÜM GENEL BİLGİLER
1.1. Familya: Soricidae
Soricidae familyası, böcekçil memelilerden oluşan, dünya üzerinde geniş yayılışa sahip olup en fazla türle temsil edilen familyalardan biridir. Soricidae familyası 300’ den fazla tanımlanmış türle dünya üzerinde temsil edilmektedir ve üç altfamilyaya ayrılmaktadır.
Soricinae (fare benzeri, kırmızı dişli - sivri burunlu böcekçil memeli) Holoarktik bölgede yayılış göstermekte olup 13 cins ve 146 tür; Crocidurinae (fare benzeri, beyaz dişli - sivri burun böcekçil memeli), 9 cins 210 türle Afrika ve Avrasya’ da yayılış göstermektedir; Myosoricinae sadece Afrika’ da tanımlanan 3 cins ve 18 türle temsil edilmektedir [12].
Avrasya’ da ortaya çıkan ilk sorisidler daha sonra Afrika ve Kuzey Amerika’ ya göç etmişlerdir. Sorisidlerin bir cinsi (Cryptotis) Güney Amerika’ ya kadar ulaşmışlardır.
Bu familyanın tüm bireyleri, beş adet parmağa kısa ama sık kürk yapısına uzun bir buruna, küçük dış kulaklara, nispeten uzun bir kuyruğa ve küçük gözlere sahiptir.
Kafatasında zygomatik yaylar bulunmamaktadır. Küçük üst köpek dişleri bulunmaktadır. Tüm bireyler terrestrial, fossorial ya da yarı sucul, gece ve gündüz aktif olabilmektedirler [29].
1.2. Cins: Crocidura Wagler, 1832
Crocidura (sivri burunlu beyaz dişli fare benzeri böcekçil memeliler), Soricidae familyasının en çok türe sahip olan cinsidir. Bu cinsin üyeleri, pigmentsiz dişleri, üç tane üst unicuspid dişlerinin varlığı, kuyruk üzerindeki uzun seyrek kılları ile karakterize edilir. Diş formülü 3/1, 1/1, 1/1, 3/3= 28 şeklindedir. Crocidura’ nın yayılış alanı güney Palaearktik, Oriental ve Afrika bölgeleriyle sınırlı olup günümüzde 172 türle temsil edilmektedir. Ülkemizde Crocidura cinsine ait üç tür yayılış göstermektedir [10].
1.2.1. Tür: Crocidura leucodon (Hermann, 1780)
Güneydoğu Anadolu hariç Türkiye’ nin diğer bölgelerinde yaygındır. Sırt kısmı kahverengi, kılların dip kısımları kurşuni gridir. Karın rengi ise, beyaz veya grimsi beyazdır. Vücudun üst ve alt taraf rengi, genellikle yanlarda keskin bir sınırla birbirinden ayrılır. Kuyruk iki renklidir. Üst taraf kahverengi, alt taraf beyazımsı gridir [10].
1.2.2. Tür: Crocidura suaveolens (Palas, 1811)
Türkiye’ de yaygın olarak yayılış göstermektedir. Sırt kısmı açık kahverengiden koyu kahverengiye kadar değişir. Kılların dip kısımları kurşuni gridir. Karın rengi açık grimsi, koyu grimsi ya da sarımsıdır. Vücudun üst ve alt taraf rengi C. leucodon’ da olduğu gibi keskin bir sınır oluşturmaz ve bu renkler, yanlarda birbirine karışır. Kuyruk bir renkli ya da iki renklidir. Kuyrukta uzun kıllar bulunur [10].
1.2.3. Tür: Crocidura arispa Spitzenberger, 1971
Türkiye' deki kayıtlar, Antalya - Elmalı - Çığlıkara ve Niğde - Ulukışla - Madenköy – Bolkar Dağ' ından olup günümüze kadar herhangi bir başka kayıt verilmemiştir[10].
1.3. Mitokondrial DNA(mtDNA)’ nın Moleküler Belirteç olarak Kullanımı
Primatlarda, toynaklılarda, kuşlarda, sürüngenlerde ve amfibilerde evrimsel ilişkilerin belirlenmesinde mtDNA dizi analizi önemli bir yer tutmaktadır [31]. Ayrıca mtDNA, populasyon genetiği, biyocoğrafya ve filocoğrafya çalışmalarında da yaygın olarak kullanılan önemli bir belirteçtir [28, 30, 32].
Genel olarak ökaryotik canlıların sahip oldukları toplam genetik materyal, çekirdek içinde yer alan ve genomik DNA yada çekirdek DNA (nDNA) olarak ifade edilen kromozomlara ilave olarak mitokondri (mtDNA) ve kloroplast (cpDNA) organellerinde yer alan DNA moleküllerinin tamamından meydana gelmektedir. Hayvan hücrelerinde sadece mitokondrial DNA, bitki hücrelerinde ise hem mitokondrial DNA ve hem de kloroplast DNA molekülleri, ekstra kromozomal yapılar olarak bulunmaktadır.
Sitoplazmik kalıtım materyali olarak da tanımlanan mtDNA molekülü, anaya ait kalıtım modeline sahip olup yumurtanın sitoplazması vasıtasıyla generasyonlar boyunca aktarılmaktadır [33].
6
Şekil 1.1. Anaya ait kalıtım modelini gösteren bir soy ağacı [33].
Hayvanlarda genellikle mitokondriyal genom büyüklüğü, 16.3 - 17.0 kb arasında değişirken bitkilerde mitokondriyal genom büyüklüğü 2500 kb’ a kadar olabilmektedir.
Hayvansal mtDNA, 37 gen bölgesi bulunan çift ipliçikli yapıdadır. Hayvansal mtDNA’
daki 37 gen şu şekilde dağılmaktadır: 13 gen bölgesi elektron transport zinciri ve oksidatif fosforilasyonda polipeptidleri kodlamada görevli; 22 adet gen bölgesi tRNA’
yı, iki tanesini mitokondriyal rRNA (12S ve 16S) kodlamada görevlidir. Sadece bir tane 1.1 kilobaz çifti büyüklüğünde kodlama yapmayan, mtDNA’ nın replikasyon ve transkripsiyonunun başlaması ve düzenlenmesinde görev alan kontrol bölgesi olarak adlandırılan (D - loop) bir bölge taşır [34 - 37].
Şekil 1.2. Mitokondriyal DNA’ daki genler ve genlerin dizilimi [38].
Her bir mitokondride 2 ile 10 arasında mtDNA molekülü vardır. Bu sebeple dokulardan kolay izole olabilmektedir. mtDNA molekülü, halkasal yapıda ve ikili sarmal tek bir DNA molekülünden oluştuğu için çekirdek DNA molekülünde homolog kromozomlar arasında gerçekleşen parça değişimi (cross - over) meydana gelmemektedir. Bu sebeple yavru döllerde yeni kombinasyonlar oluşmamaktadır. Meydana gelen nükleotid farklılıkları, yavru döllere eklemeli olarak aktarılmaktadır. mtDNA molekülü, memeli hayvanlarda anaya ait kalıtım modeliyle (maternal kalıtım) kalıtılır. Bu sayede geçmişe dönük takipler yapılabilmektedir. mtDNA molekülünün başka bir özelliği ise evrim hızının çekirdek DNA molekülünün evrim hızından daha yüksek olmasıdır.
Memelilerde bu oran çekirdek DNA’ sından 5 ile 10 kez daha fazladır ve ortalama değişme oranı bir milyon yılda % 2’ dir. Bunun sebebi mtDNA molekülünün oksijen radikallerine daha fazla maruz kalması, koruyucu ve tamir mekanizmalarının bulunmayışıdır. Bu yüzden mtDNA molekülü mutasyona daha açıktır. mtDNA üzerindeki her bir gen bölgesinin evrim hızı faklıdır [32, 37 – 39].
Sitokrom b (cyt b), 1140 baz çifti uzunluğunda ve oksidatif fosforilasyonda görevli olan bir proteini kodlayan gen bölgesidir. Sitokrom b gen bölgesinin filogenetik çalışmalarda kullanılmasının en önemli nedenlerinden biri, diğer gen bölgelerine oranla nispeten evrim hızının daha düşük olmasıdır. Bu nedenle familya, cins, tür ve tür altına dayalı filogenetik çalışmalarda, tür içi ve türler arası çalışmalarda da sıkça kullanılan bir mitokondrial gendir [40, 41].
2. BÖLÜM
MATERYAL VE METOT
2.1. Crocidura Örneklerinin Toplanması ve Saklanması
Bu çalışmada mtDNA dizi analizi için kullanılan dokular, Türkiye’ nin çeşitli lokalitelerinden toplanmış Crocidura cinsine ait örneklerden elde edildi (Şekil 2.1., Tablo 2.1). mtDNA sitokrom b (cyt b) geninin kismi dizi (381 bç) analizi için 80 Crocidura örneği kullanıldı. Çalışmada kullanılan doku (böbrek, kuyruk ve kalp) örnekleri, % 99.9’ luk etil alkol tüpleri içerisinde +4°C’ de, Erciyes Üniversitesi, Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü’ nde muhafaza edilmektedir. Bu çalışmanın yapılması, Erciyes Üniversitesi Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kurulu tarafından uygun bulunmuştur.
2.2. Mitokondrial DNA’ nın Sitokrom b (cyt b) Gen Bölgesinin Kısmi Dizi Analizi 2.2.1. Total DNA İzolasyonu İşlemleri
Total DNA, Crocidura cinsine ait 80 bireyden alınan ve çalışmaya kadar % 99.9' luk etil alkolde saklanan kuyruk, böbrek ve kalp dokularından elde edildi. Total DNA izolasyonu için ticari olarak satılmakta olan QIAGEN DNeasy® Blood &Tissue Kit (Katalog No: 69504) kullanıldı. Total DNA izolasyonunda kit ile birlikte gönderilmiş olan protokol takip edildi.
Total DNA izolasyonu işlemleri:
*Lizis işlemi için gerekli olan thermal block cihazı önceden 56 oC’ ye ayarlandı.
*DNA izolasyon kiti ile birlikte gelen DNeasy Mini spin column, 2 ml’ lik koleksiyon tüpleri ve 1.5 ml ve 2 ml’ lik steril eppendorf tüpleri, stok doku tüplerindeki numaralarla aynı olacak şekilde etiketlendi.
*Total DNA elde edilen doku örnekleri, böbrek ve kalp için 20 - 25 mg ve kuyruk için 10 - 15 mg olacak şekilde analitik terazide tartılarak daha önceden etiketlenen 1.5 ml’
lik eppendorf tüplerine konuldu.
Şekil 2.1. Crocidura örneklerinin toplandığı lokaliteler
10
Tablo 2.1. Crocidura cinsine ait örneklerin toplandığı lokaliteler (E, erkek; K, dişi).
Sıra No
Takson Adı Harita No Kullanılan Doku
Lokaliteler Koordinatlar
1 C. suaveolens 29 Kuyruk Aydınkent, Ereğli, Konya N 37o 25, 118’ E 34o 10, 468’
2 C. suaveolens 18 Kuyruk Seydişehir, Konya N 37o 30, 353’ E 31o 52, 243’
3 C. suaveolens 38 Kuyruk Musa Köy Ilgaz, Çankırı N 40o 57, 440’ E 33o 40, 300’
4 C. suaveolens 37 Kuyruk Seydiler, Kastamonu N 41o 37, 578’ E 33o 42, 733’
5 C. suaveolens 39 Kuyruk Bektaşağa, Sinop N 41o 56, 257’ E 34o 59, 230’
6 C. suaveolens 40 Kuyruk İncesu Köyü, Samsun N 41o 22, 536’ E 36o 12, 610’
7 C. suaveolens 8 Kuyruk Rüzgarlar, Bolu N 40o 44, 147’ E 31o 47, 930’
8 C. suaveolens 6 Kuyruk Söğütlü, Sakarya N 40o 53, 073’ E 30o 23, 139’
9 C. leucodon 5 Kuyruk Kefken, Kandıra, Kocaeli N 41o 09, 498’ E 30o 14, 047’
10 C. leucodon 7 Kuyruk Kefken, Kandıra, Kocaeli N 40o 46, 284’ E 31o 20, 753’
11 C. leucodon 7 Kuyruk Hasanbey köyü, Kaynaşlı, Düzce N 40o 46, 284’ E 31o 20, 753’
12 C. suaveolens 35 Kuyruk Çay, Eskipazar, Karabük N 41o 00, 832’ E 32o 37, 552’
13 C. suaveolens 36 Kuyruk Geriş, Çaycuma, Zonguldak N 41o 22, 130’ E 32o 05, 533’
14 C. suaveolens 28 Kuyruk Hasangazi, Ulukışla, Niğde N 37o 31, 286’ E 34o 38, 311’
15 C. suaveolens 12 Kuyruk Acıpayam, Denizli N 37o 17, 149’ E 29o 19, 611’
16 C. suaveolens 43 Böbrek İhsaniye Köyü, Tokat N 39o 59, 140’ E 36o 30, 552’
17 C. suaveolens 42 Böbrek Fındıklı Köyü, Amasya N 40o 43, 454’ E 35o 46, 696’
18 C. suaveolens 41 Böbrek Demirciler Mh. Erikli, Samsun N 41o 21, 385’ E 36o 04, 277’
19 C. leucodon 41 Kuyruk Demirciler Mh., Erikli, Samsun N 41o 21, 385’ E 36o 042, 277’
20 C. suaveolens 47 Böbrek Ordu, Persembe N 41o 03, 899’ E 37o 37, 173’
21 C. suaveolens 48 Böbrek Akköy, Giresun N 40o 51, 978’ E 38o 19, 041’
22 C. suaveolens 56 Böbrek Dernekpazarı, Trabzon N 40o 47, 683’ E 40o 15, 588’
23 C. leucodon 57 Böbrek Çaykara, Trabzon N 40o 46, 436’ E 40o 15, 408’
24 C. leucodon 57 Kuyruk Çaykara, Trabzon N 40o 46, 436’ E 40o 15, 408’
25 C. suaveolens 57 Böbrek Çaykara, Trabzon N 40o 46, 436’ E 40o 15, 408’
Tablo 2.1’ in devamı.
26 C. suaveolens 53 Böbrek Altındere, Maçka, Trabzon N 40o 45, 464’ E 39o 36, 870’
27 C. suaveolens 53 Böbrek Trabzon, Maçka, Altindere N 40o 45, 464’ E 39o 36, 870’
28 C. leucodon 64 Kuyruk Atalar Köyü, Şavşat, Artvin N 41o 20, 615’ E 42o 21, 125’
29 C. suaveolens 30 Böbrek Yaprakhisar, Aksaray N 38o 17, 821’ E 34o 16, 136’
30 C. suaveolens 31 Böbrek Ortaköy, Aksaray N 38o 43, 209’ E 34o 04, 581’
31 C. suaveolens 32 Böbrek Pınarbaşı, Kayseri N 38o 44, 178’ E 36o 30, 453’
32 C. suaveolens 27 Böbrek Göksun, Kahramanmaraş N 37o 58, 624’ E 36o 30, 000’
33 C. suaveolens 26 Böbrek Özbek, Türkoğlu,Kahramanmaraş N 37o 22, 132’ E 36o 57, 58’
34 C. suaveolens 25 Böbrek Dedeçınar Köyü, Kırıkhan, Hatay N 36o 37’,486’ E 36o 25, 847’
35 C. suaveolens 24 Böbrek Çukurova TIGEM, Ceyhan, Adana N 37o 08, 061’ E 35o 47, 004’
36 C. suaveolens 23 Böbrek Sağlıklı Köyü, Tarsus, Mersin N 37o 00, 730’ E 34o 57, 601’
37 C. suaveolens 22 Böbrek Alata, Mersin N 36o 34, 331’ E 34o 15, 590’
38 C. suaveolens 20 Böbrek Çarıklar, Anamur, Mersin N 36o 06, 968’ E 32o 51, 956’
39 C. suaveolens 21 Kuyruk Çavuş, Ermenek, Karaman N 36o 33, 177’ E 32o 56, 132’
40 C. suaveolens 51 Böbrek Ganiefendi Köyü, Erzincan N 39o 41, 514’ E 39o 36, 630’
41 C. suaveolens 65 Böbrek Dere içi (Melik Köy), Kars N 40o 37, 597’ E 43o 06, 004’
42 C. suaveolens 61 Böbrek Hopa, Artvin N 41o 29, 001’ E 41o 32, 463’
43 C. suaveolens 59 Böbrek Ayder, Çamlıhemşin, Rize N 40o 59, 972’ E 41o 03, 190’
44 C. suaveolens 58 Böbrek Çorapçilar Mh., Rize N 41o 01, 105’ E 40o 34, 307’
45 C. suaveolens 52 Böbrek Arzular Beldesi, Gümüşhane N 40o 25, 289’ E 39o 39, 906’
46 C. suaveolens 49 Böbrek Saraycık, Şebinkarahisar, Giresun N 40o 17, 038’ E 38o 19, 227’
47 C. suaveolens 50 Böbrek Ahmethacı Köyü, Zara, Sivas N 39o 54, 712’ E 37o 49, 124’
48 C. suaveolens 44 Böbrek 10. Km. Fadil ırmağı kenarı, Sivas N 39o 40, 933’ E 37o 05, 582’
49 C. suaveolens 63 Böbrek Kaleboynu, Şavşat, Artvin N 41o 15, 465’ E 42o 19, 653’
50 C. suaveolens 34 Böbrek Kalecik, Ankara N 40o 02, 102’ E 33o 16, 549’
51 C. suaveolens 10 Böbrek Sivrihisar, Eskişehir N 39o 31, 617’ E 31o 37, 819’
52 C. suaveolens 11 Böbrek Akşehir, Konya N 38o 23, 103’ E 31o 24, 194’
53 C. suaveolens 33 Böbrek Çoğun Köyü, Kırşehir N 39o 18, 729’ E 34o 07, 775’
12
Tablo 2.1’ in devamı.
54 C. suaveolens 17 Böbrek Beyşehir, Konya N 37o 42, 477’ E 31o 44, 533’
55 C. suaveolens 16 Böbrek Eğirdir, Isparta N 37o 41, 778’ E 30o 52, 620’
56 C. suaveolens 15 Böbrek Düzlerçamı, Antalya N 36o 59, 163’ E 30o 33, 802’
57 C. suaveolens 19 Böbrek Çolaklı, Manavgat, Antalya N 36o 50, 216’ E 31o 18, 803’
58 C. suaveolens 2 Kuyruk Kırık Köy, Lüleburgaz, Kırklareli N 41o 28, 239’ E 27o 14, 581’
59 C. leucodon 9 Kuyruk Dere Köy, Nallıhan, Ankara N 40o 16, 681’ E 31o 20, 526’
60 C. leucodon 9 Böbrek Nallihan, Dereköy, Ankara N 40o 16, 681’ E 31o 20, 526’
61 C. suaveolens 9 Böbrek Nallihan, Dereköy, Ankara N 40o 16, 681’ E 31o 20, 526’
62 C. suaveolens 4 Böbrek Kandıra yolu, Kocaeli N 40o 47, 496’ E 29o 58, 877’
63 C. suaveolens 7 Böbrek Kaynaşlı, Düzce N 40o 46, 284’ E 31o 20 753’
64 C. suaveolens 14 Böbrek Sahilkent, Finike, Antalya N 36o 18, 957’ E 30o 11, 402’
65 C. suaveolens 13 Böbrek İnlice, Fethiye, Muğla N 36o 44, 313’ E 28o 58, 273’
66 C. leucodon 53 Kuyruk Altındere,Maçka,Trabzon N 40o 45, 464’ E 39o 36, 870’
67 C. leucodon 55 Böbrek Yıldız Köyü, Araklı, Trabzon N 40o 53, 261’ E 40o 03, 386’
68 C. suaveolens 55 Böbrek Araklı, Yıldızlı Köyü, Trabzon N 40o 53, 261’ E 40o 03, 386’
69 C. suaveolens 60 Böbrek Arhavi, Artvin N 41o 22, 303’ E 41o 20, 505’
70 C. leucodon 60 Kuyruk Arhavi, Artvin N 41o 22, 303’ E 41o 20, 505’
71 C. suaveolens 46 Böbrek Orta Söğütlü Köyü, Terme Samsun N 41o 13, 379’ E 36o 53, 504’
72 C. leucodon 67 Kuyruk Dumlu, Erzurum N 40o 06, 015’ E 41o 23, 055’
73 C. suaveolens 66 Böbrek Okçular Köyü, Horasan, Erzurum N 40o 04, 786’ E 42o 18, 936’
74 C. suaveolens 62 Böbrek Ovacık, Artvin N 41o 09, 627’ E 41o 58, 210’
75 C. suaveolens 54 Böbrek Küçükdere, Vakfıkebir, Trabzon N 41o 04, 052’ E 39o 20, 717’
76 C. suaveolens 45 Böbrek Akkuş, Ordu N 40o 47, 160’ E 37o 01, 775’
77 C. suaveolens 1 Böbrek Gelibolu, Çanakkale N 40o 21’ E 26o 26’
78 C. leucodon 1 Kuyruk Gelibolu, Çanakkale N 40o 21’ E 26o 26’
79 C. suaveolens 2 Böbrek Kirikköy, Lüleburgaz, Kirklareli N 41o 28, 239’ E 27o 14, 581’
80 C. suaveolens 3 Kalp Bandırma, Balıkesir N 40o 21’ E 27o 55’
*Eppendorf tüplerine konulan dokuların üzerine 180 µl ATL tamponu ilave dilip vortekslendi. Daha sonra 20 µl Proteinaz K eklendikten sonra tekrar vorteks işlemi gerçekleştirildi. Bu işlemler her bir doku örneği için gerçekleştirildi ve dokular daha önceden 56 oC’ ye ayarlanmış thermal block cihazına yerleştirildi.
*Dokular tamamen lizis oluncaya kadar (3 - 4 saat yada tüm gece) belli aralıklarla vortekslenerek tekrar cihaza yerleştirildi.
*Tamamen lizis olan örnekler thermal block cihazından alınarak vortekslenip 200 µl AL tampon ilave edildi. AL tamponu eklenmiş örnekler hızlı bir şekilde vortekslenerek üzerine 200 µl % 99.9’ luk etil alkol ekleyerek tekrar vortekslendi.
*Elde edilen karışım daha önceden etiketlenen spin columnlara pipetlendi ve koleksiyon tüplerinin içine yerleştirildi.
*Hazırlanan spin columnlar santrifüj cihazına dengeli bir şekilde yerleştirildi ve 6000 rcf’ de 1 dk. santrifüj edildi. Santrifüj sonrası altta koleksiyon tüpünde biriken sıvı atılarak spin column’ lar yeni bir 2 ml’ lik koleksiyon tüplerine alındı.
*Sıradaki işlemde ise 500 µl AW1 tamponu eklenerek 6000 rcf’ de 1dk. santrifüj edildi.
*Koleksiyon tüpleri tekrar atılarak spin column’lar yeni bir koleksiyon tüplerine alınıp 500 µl AW2 tamponu eklendi. AW2 tamponu eklendikten sonra 20000 rcf de 3 dk.
santrifüj edildi.
*Spin column’ lar daha önceden etiketlenen 1.5 ml’ lik eppendorf tüplerine alındı ve spin column’lara 200 µl AE tamponu eklendi ve 1 dk. inkibasyona bırakıldı.
İnkübasyon sonrası 6000 rcf’ de 1 dk. santrifüj edildi. İstenildiği takdirde bu işlem tekrarlanabilmektedir.
*Spin column’ lar atılarak eppendorf tüplerindeki sıvı +4oC yada daha uzun süreli saklama için -20 oC’ de saklanabilir.
*Total DNA işlemleri sırasında santrifüj işlemleri oda sıcaklığında (15-25oC) gerçekleştirildi. Vorteks işlemleri 5 ile 10 saniye arasında yapıldı. DNeasy kit ile birlikte gelen AW1 ve AW2 tamponlarına % 99.9 etil alkol eklendi
2.2.2. Total DNA’ nın Agaroz Jelde Yürütülmesi ve Görüntülenmesi
Dokulardan total DNA elde edilip edilmediğini anlamak için agaroz jel elektroforez yöntemi kullanıldı.
*Elde edilen total DNA’ lar, % 0.8’ lik agaroz jelde yürütülerek görüntülendi. %0.8’ lik agaroz jel hazırlanması için bir erlende 1.2 gram agaroz ve üzerine 150 ml 1X TAE
14
(Trisma Base, Glacial Asetic Acid, EDTA) çözeltisi eklendi. Karışım mikrodalga fırında ısıtılarak manyetik karıştırıcıda balık yardımıyla karıştırılıp karışım sıcaklığının 40 – 42 oC’ ye düşmesi beklendi. Sıcaklığın uygun değerleri düşmesi beklenirken çözeltiye 1 mg/ml Etidyum Bromid’ den 8 µl eklendi.
*Elektroforez tepsisine taraklar yerleştirilerek çözelti kabarcık oluşmayacak şekilde döküldü ve donması beklendi. Donduğu anlaşılan jelden taraklar dikkatli bir şekilde çıkarılarak elektorforez tepsisi, elektroforez tankına yerleştirildi. Jelin üzerini tamamen kaplayacak şekilde 1X’ lik TAE tamponu tanka dolduruldu.
*Kuyucuklara 10 µl total DNA ve 2 µl 6X Loading Dye (% 40’ lık sükroz, xylene cyanol FF ve Bromophenol Blue) karıştırılarak kuyucuklara yüklendi.
*Kuyucuklara yüklenen karışım 80 V doğrusal akımda 1 saat yürütüldü. Yürütülmesi tamamlanan jelin görüntüsü, jel görüntüleme cihazında (KODAK Gel Logic 1500 jel görüntüleme sistemi) UV yardımıyla alındı.
Şekil 2.2. Total DNA izolasyonu gerçekleştirilmiş Crocidura cinsine ait bazı örneklerin agaroz jel görüntüsü.
2.2.3. Mitokondrial DNA’ nın Sitokrom b Gen Bölgesinin PCR ile Çoğaltılması Tüm örneklerden elde edilen total DNA’ lar, mtDNA sitokrom b gen bölgesi için kalıp DNA olarak kullanıldı.
Bu sitokrom b gen bölgesinin çoğaltılması için;
L14724 (5’-GATATGAAAAACCATCGTTG-3’) ve H15149 (5’-
CAGAATTGATATTTGTCCTCA-3’) primer çifti kullanıldı [41 - 43].
Şekil 2.3. Crocidura örneklerinden sitokrom b genini amplifiye etmek için kullanılan L14724 ve H15149 primerlerinin PCR stratejisi [41].
Yapılan çalışmalarda kullanılan PCR bileşenleri ve miktarları:
Bileşenler Kullanılan miktar Son konsantrasyon
10X Taq Buffer 5 µl 1X
10 uM L14724 Primer 5 µl 1 µM
10 uM H15149 Primer 5 µl 1 µM
10 mM dNTP mix 1 µl 200 µM
Taq DNA Polimeraz 5 ü/µl 0.4 µl 2 ü
25 mM MgCl2 4 µl 2 mM
DNA (1/5 oranında seyreltiliş) 5 µl ----
dH2O 24.6 µl ----
Total hacim 50 µl
İstenilen bölgenin çoğaltılması için gradient özelliğine sahip thermocycler (SENSOQEST) kullanıldı.
Çoğaltılan cyt b gen bölgesinin PCR döngü şartları:
Basamak Sıcaklık (oC) Süre Döngü Sayısı Ön Denatürasyon 95 3 dk. 1
Denatürasyon 94 1 dk. 30 Bağlanma 50 1 dk. 30 Uzama 72 1.5 dk. 30 Sonlandırma 72 7 dk. 1
16
2.2.4. Çoğaltılan PCR Ürünlerinin Agaroz Jelde Görüntülenmesi
Çoğaltılan PCR ürünleri, % 2’ lik agaroz jelde yürütülerek dizi analizi yapılacak olan gen bölgesinin çoğaltılıp çoğaltılmadığı gözlendi. PCR ürünlerinin yürütülmesi için jel, 3 mg agaroz, 150 ml 1X TAE’ lik tamponunda çözdürülerek hazırlandı. Agaroz, tamponda çözdürüldükten sonra mikrodalga fırında ısıtılıp 8 µl Etidyum Bromid eklenerek sıcaklık 40 - 42o C’ye düşene kadar manyetik karıştırıcıda karıştırıldı.
Elektroforez tepsisine taraklar yerleştirilerek çözelti kabarcık oluşmayacak şekilde tepsiye döküldü ve donması beklendi. Donduğu anlaşılan jelden taraklar dikkatli bir şekilde çıkarılarak elektroforez tepsisi, elektroforez tankına yerleştirildi. Jelin üzerini tamamen kaplayacak şekilde 1X’ lik TAE tamponu tanka dolduruldu.
10 µl total DNA ve 2 µl 6X’ lik Loading Dye karıştırılarak kuyucukların biri boş bırakılacak şekilde yüklendi. Bu boş kuyucuğa 6 µl 1000 bç’ lik DNA Ladder yüklendi.
80 V doğrusal akımda 1 saat yürütüldü. Yürütülmesi tamamlanan jel, jel görüntüleme cihazında (KODAK Gel Logic 1500 jel görüntüleme sistemi) UV yardımıyla görüntüsü alındı.
Şekil 2.4. Crocidura örneklerinden elde edilen total DNA’ lar kullanılarak L14724 ve H15149 primeleri yardımıyla çoğaltılan PCR ürünlerinin agaroz jelde görüntüsü.
Her bir örnek için hedef bölge DNA dizisi, ileri ve geri olmak üzere iki yönde elde edildi. İleri primer olarak L14724 (5’-GATATGAAAAACCATCGTTG -3’) ve geri primer olarak H15149 (5’-CAGAATTGATATTTGTCCTCA-3’) kullanıldı [41 - 43].
mtDNA dizi analizi, otomatik DNA dizi analiz sistemi (ABI PRISM 310 Genetic Analyzer) kullanılarak RefGen (ODTÜ-Teknopark/Ankara) Gen Araştırmaları ve Biyoteknoloji Laboratuar’ ından hizmet alımı şeklinde yapıldı.
Şekil 2.5. Crocidura örneğine ait L14724 no’ lu primer (İleri, Forward) ile elde edilmiş DNA dizi diyagramı.
Şekil 2.6. Crocidura örneğine ait H15149 no’ lu primer (Geri, Revers) ile elde edilmiş DNA dizi diyagramı.
2.2.5. Kısmi Sitokrom b Gen Bölgesinin DNA Dizilerinin Hizalanması ve Düzenlenmesi
mtDNA cyt b geninin ham dizileri, BioEdit version 7.0.9.0 [44] programı kullanılarak düzenlendi. Her bir birey için aynı bölgeye ait ileri ve geri (Forward ve Revers) primerler ile elde edilen dizilerin kromatogramları, tek tek gözden geçirildi ve her bir birey için ilgili bölgenin en ortak (consensus) dizileri oluşturuldu. Hizalanan ve
18
çakışmayan DNA dizi kısımları kesilip (trim edilip) aynı uzunluğa getirildi. Aynı uzunluğa getirilen bu diziler, diğer programlar tarafından okunabilmesi ve değişik formatlara dönüştürülebilmesi için fasta formatında kaydedildi.
2.2.6. Crocidura Örneklerinin Filogenetik Analizleri
Filogenetik analizler için bu çalışmada tespit edilen haplotipler ile Türkiye ve yakın çevresini kapsayan daha önceki çalışmalarda bulunan ve Gen Bankası’ nda depolanmış haplotiplerden oluşturulan üç farklı DNA veri seti oluşturuldu.
Birincisi bu çalışmada analizi yapılan mtDNA cyt b genine ait 381 bç uzunluğundaki dizilerin bir araya getirilmesiyle 80 diziden ibaret veri setidir.
İkincisi 351 bç uzunluğundaki bu çalışmada tespit edilen 29 C. suaveolens haplotipi ile Gen Bankası’ nda bulunan Türkiye’ den kaydedilmiş 12 C. suaveolens haplotipinin [28]
bir araya getirilmesiyle oluşturulan veri setidir.
Üçüncüsü ise bu çalışmada tespit edilen haplotipler ile Türkiye ve yakın çevresini kapsayan daha önceki çalışmalarda bulunan ve Gen Bankası’ nda depolanmış C.
leucodon ve C. suaveolens’ e ait toplam 105 (80 adet C. suaveolens haplotipi, 25 adet C.
leucodon haplotipi) haplotipin [24, 27, 28, 45] bir araya getirilmesiyle oluşturulan 252 bç uzunluğundaki 58 haplotipten oluşan veri setidir.
Bu üç veri setinin her biri kendi içerisinde hizalandı ve çakışmayan bölgeler trim (çakışmayan bölgelerin kesilme işlemi) edildi. DnaSP Version 5.10.01 [46] programına aktarılan üç ayrı veri setinin ayrı ayrı yeni haplotipleri ile birlikte genetik varyasyonlar belirlendi.
Filogenetik ilişkileri gösterebilmek için üç ayrı veri setindeki haplotipler, MEGA5 v5.05 [47] programına aktarıldı. Neighbor Joining (NJ), Maximum Parsinmony (MP) ve Maximum Likelihood (ML) metodları kullanılarak filogenetik analizleri yapıldı.
Filogenetik analizlerde dış grup olarak Gen Bankası’ na (NCBI, The National Center for Biotechnology) HM036166 erişim numarasıyla depolanmış Sorex satunini ye ait DNA dizisi [48] kullanıldı.
MEGA5 v5.05 [47]’ a aktarılan 252 bç, 351 bç ve 381 uzunluğundaki üç veri seti için filogenetik analizlerde yaygın olarak kullanılan Kimura 2-parametre (K2P) [49] baz değişim modeli kullanılmıştır. Ayrıca 381 bç uzunluğudaki veri seti için MEGA5 v5.05
[47] programı yardımıyla en iyi baz değişim modeli, Akaike Information Criterion (AIC) ve Bayesian Information criterion (BIC) değerleri baz alınarak belirlendi. En iyi baz değişim modeli olarak gamma değerliğiyle birlikte Tamura - Nei (TN93+G) modeli [50] belirlendi.
Bu çalışmada DNA dizi analizi yapılan Türkiye örneklerine ait 381 bç uzunluğundaki veri setinin ML analizi Tamura - Nei (TN93+G) [50] baz değişim modeli kullanılarak yapıldı. Filogenetik analizlerde NJ metodu için ise en yüksek bootstrap değerlerini verdiğinden TN93+G baz değişim modeli yerine aynı ağaç topolojisi veren gamma değerliğiyle birlikte Tajime - Nei (Tajime - Nei+G) baz değişim modeli kullanıldı.
Parsimoni analizi için MP metodu (Heuristik + Close Neighbor Interchange) kullanıldı.
Parsimoni analizi ile ağaç uzunluğu (tree lenght, TL), tutarlılık indeksi (consistency index, CI) ve koruma indeksi (retention index, RI) elde edildi. ML, MP ve NJ metodlarıyla üretilen ağaçlardaki soy hatlarının ne kadar oranda desteklendiğini saptamak için 1000 tekrarlı (replikasyon) bootstrap analizi yapıldı.
Şekil 2.7. C. suaveolens türüne ait Gen Bankası’ ndan elde edilen haplotiplerin toplandığı bölge.
20
Şekil 2.8. C. leucodon türüne ait Gen Bankası’ ndan elde edilen haplotiplerin toplandığı bölge.
3. BÖLÜM BULGULAR
3.1. Crocidura Wagler, 1832 Cinsine ait Örneklerin mtDNA Sitokrom b Geninin Kısmi Dizi Analizi
Bu çalışmada mitokondriyal cyt b geninin kısmi dizi (381 bç) analizi yapılan 80 Crocidura örneğinin Crocidura suaveolens (Pallas, 1811) (66 örnek) ve Crocidura leucodon (Hermann, 1780) (14 örnek) türlerine ait olduğu belirlendi. DNA analizi yapılan Crocidura örnekleri, daha önce yayınlanmış çalışmalarla [10, 18]
karşılaştırıldığında morfolojik özelliklere göre de bu iki türe ait olduğu gözlendi.
3.1.1. Crocidura suaveolens (Pallas, 1811)
1811. Sorex suaveolens Pallas, Zoogr. Rosso-Asiat., 1: 133.
Tip yeri: Khersones, Sevastopol yakını, Kırım, Rusya.
3.1.2. Crocidura suaveolens’ e ait mtDNA Sitokrom b Haplotipleri
Türkiye’ deki 64 değişik lokaliteden toplanan C. suaveolens türüne ait 66 örnekte çalışılan mitokondrial cyt b geninin dizi analizi sonucunda 381 bç uzunluğunda 29 adet haplotip tespit edildi (Tablo 3.1; Şekil 3.1). Tespit edilen 29 haplotip için oluşturulan ortak baz dizisi Şekil 3.2’ de verildi. C. suaveolens türüne ait haplotip çeşitliliği (haplotype diversity, Hd) 0.8951, nükleotid çeşitliliği (nucleotide diversity, Pi, ) 0.01049 olarak bulundu. C. suaveolens için haplotip çeşitlilik değerinin 1’ e yakın çıkması, genetik çeşitliliğin nispeten yüksek olduğunu ifade etmektedir.
22
Tablo 3.1. C. suaveolens'e ait örneklerin lokalite bilgileri ve tespit edilen mtDNA sitokrom b haplotipleri.
Sıra No Cyt b Haplotipleri
Örnek No / Cinsiyet
Haplotip/Harita No
Lokaliteler Koordinatlar
1 TR-Suv1 502 / E 1 / 22 Aydınkent, Ereğli, Konya N 37o 25, 118’ E 34o 10, 468’
2 TR-Suv1 583 / D 1 / 34 İncesu Köyü, Samsun N 41o 22, 536’ E 36o 12, 610’
3 TR-Suv1 764 / E 1 / 37 Çamlıbel geçidi yakını İhsaniye Köyü, Tokat N 39o 59, 140’ E 36o 30, 552’
4 TR-Suv1 935 / D 1 / 24 Yaprakhisar, Aksaray N 38o 17, 821’ E 34o 16, 136’
5 TR-Suv1 1047 / D 1 / 62 Dere içi (Melik Köy), Kars N 40o 37, 597’ E 43o 06, 004’
6 TR-Suv1 1072 / E 1 / 51 Arzular Beldesi, Gümüşhane N 40o 25, 289’ E 39o 39, 906’
7 TR-Suv1 1089 / D 1 / 60 Kaleboynu, Şavşat, Artvin N 41o 15, 465’ E 42o 19, 653’
8 TR-Suv1 1290 / D 1 / 61 Okçular Köyü, Horasan, Erzurum N 40o 04, 786’ E 42o 18, 936’
9 TR-Suv1 1292 / D 1 / 59 Ovacık, Artvin N 41o 09, 627’ E 41o 58, 210’
10 TR-Suv2 524 / E 2 / 64 Seydişehir, Konya N 37o 30, 353’ E 31o 52, 243’
11 TR-Suv2 642 / D 2 / 30 Geriş, Çaycuma, Zonguldak N 41o 22, 130’ E 32o 05, 533’
12 TR-Suv2 911 / D 2 / 54 Dernekpazarı, Trabzon N 40o 47, 683’ E 40o 15, 588’
13 TR-Suv2 916 / E 2 / 54 Çaykara, Trabzon N 40o 46,436’ E 40o 15, 408’
14 TR-Suv2 918 / E 2 / 52 Maçka, Altındere, Trabzon N 40o 45, 464’ E 39o 36, 870’
15 TR-Suv2 920 / D 2 / 52 Maçka, Altindere, Trabzon N 40o 45, 464’ E 39o 36, 870’
16 TR-Suv2 991 / E 2 / 42 Özbek, Türkoğlu, Kahramanmaraş N 37o 22, 132’ E 36o 57, 58’
Tablo 3.1’ in devamı.
17 TR-Suv2 997 / D 2 / 43 Dedeçınar Köyü, Kırıkhan, Hatay N 36o 37, 486’ E 36o 25, 847’
18 TR-Suv2 1013/ E 2 / 17 Çarıklar, Anamur, Mersin N 36o 06, 968’ E 32o 51, 956’
19 TR-Suv2 1058 / D 2 / 55 Çorapçilar Mh., Rize N 41o 01, 105’ E 40o 34, 307’
20 TR-Suv2 1098 / E 2 / 27 Kalecik, Ankara N 40o 02, 102’ E 33o 16, 549’
21 TR-Suv2 1280 / E 2 / 64 Arakli, Yildizli Köyü, Trabzon N 40o 53, 261’ E 40o 03, 386’
22 TR-Suv3 542 / D 3 / 31 Musa Köy, Ilgaz, Çankırı N 40o 57’ 440” E 33o 40’ 300’
23 TR-Suv3 551 / E 3 / 32 Seydiler, Kastamonu N 41o 37’ 578’’ E 33o 42’ 733’
24 TR-Suv4 569 / D 4 / 33 Bektaşağa göleti, Bektaşağa, Sinop N 41o 56, 257’ E 34o 59, 230’
25 TR-Suv4 594 / E 4 / 28 Rüzgarlar, Bolu N 40o 44, 147’ E 31o 47, 930’
26 TR-Suv4 605 / E 4 / 6 Söğütlü, Sakarya N 40o 53’ 073’ E 30o 23, 139’
27 TR-Suv4 632 / D 4 / 29 Çay, Eskipazar, Karabük N 41o 00, 832’ E 32o 37, 552’
28 TR-Suv4 781 / E 4 / 36 Fındıklı Köyü, Amasya N 40o 43, 454’ E 35o 46 696’
29 TR-Suv4 944 / D 4 / 25 Ortaköy, Aksaray N 38o 43, 209’ E 34o 04, 581’
30 TR-Suv4 955 / E 4 / 39 Pınarbaşı, Kayseri N 38o 44, 178’ E 36o 30, 453’
31 TR-Suv4 1079 / E 4 / 48 Şebinkarahisar, Giresun N 40o 17, 038’ E 38o 19, 227’
32 TR-Suv4 1087 / E 4 / 38 10. Km. Fadil irmagi kenari, Sivas N 39o 40, 933’ E 37o 05, 582’
33 TR-Suv4 1101 / D 4 / 9 Sivrihisar, Eskişehir N 39o 31, 617’ E 31o 37, 819’
34 TR-Suv4 1105 / E 4 / 10 Akşehir, Konya N 38o 23, 103’ E 31o 24, 194’
24
Tablo 3.1’ in devamı.
35 TR-Suv4 1109 / D 4 / 26 Çoğun Köyü, Kırşehir N 39o 18, 729’ E 34o 07, 775’
36 TR-Suv4 1115 / E 4 / 15 Eğirdir, Isparta N 37o 41, 778’ E 30o 52, 620’
37 TR-Suv4 1235 / E 4 / 8 Nallihan, Dereköy, Ankara N 40o 16, 681’ E 31o 20, 526’
38 TR-Suv4 1239 / E 4 / 7 D.Y. Hasanbey Köyü,Kaynaşlı, Düzce N 40o 46, 284’ E 31o 20, 753’
39 TR-Suv4 1288 / D 4 / 48 Orta Söğütlü Köyü, Terme, Samsun N 41o 13, 379’ E 36o 53, 504’
40 TR-Suv5 655 / E 5 / 23 Hasangazi, Ulukışla, Niğde N 37o 31, 286’ E 34o 38, 311’
41 TR-Suv5 985 / E 5 / 40 Göksun, Kahramanmaraş N 37o 58, 624’ E 36o 30, 000’
42 TR-Suv6 693 / E 6 / 12 Çakırköy, Acıpayam, Denizli N 37o 17, 149’ E 29o 19, 611’
43 TR-Suv6 1119 / E 6 / 14 Düzlerçamı, Antalya N 36o 59, 163’ E 30o 33, 802’
44 TR-Suv7 832 / E 7 / 35 Erikli, Samsun N 41o 21, 385’ E 36o 04, 277’
45 TR-Suv8 843 / D 8 / 46 Perşembe, Ordu N 41o 03, 899’ E 37o 37, 173’
46 TR-Suv9 848 / E 9 / 47 Akköy, Giresun N 40o 51, 978’ E 38o 19, 041’
47 TR-Suv10 1002 / E 10 / 41 Çukurova TIGEM, Ceyhan, Adana N 37o 08, 061’ E 35o 47, 004’
48 TR-Suv11 1005 / E 11 / 21 Sağlıklı Köyü, Tarsus, Mersin N 37o 00, 730’ E 34o 57, 601’
49 TR-Suv12 1010 / D 12 / 20 Alata, Erdemli, Mersin N 36o 34, 331’ E 34o 15, 590'’
50 TR-Suv13 1022 / E 13 / 18 Çavuş, Ermenek, Karaman N 36o 33, 177’ E 32o 56, 132’
51 TR-Suv14 1041 / E 14 / 50 Ganiefendi Köyü, Erzincan N 39o 41, 514’ E 39o 36, 630’
Tablo 3.1’ in devamı.
52 TR-Suv15 1054 / D 15 / 57 Uzunyalı, Kemalpaşa Hopa, Artvin N 41o 29, 001’ E 41o 32, 463’
53 TR-Suv16 1057 / D 16 / 56 Ayder, Çamlıhemşin, Rize N 40o 59, 972’ E 41o 03, 190’
54 TR-Suv17 1082 / E 17 / 49 Ahmethacı Köyü, Zara, Sivas N 39o 54, 712’ E 37o 49, 124’
55 TR-Suv18 1112 / E 18 / 19 Beyşehir, Konya N 37o 42, 477’ E 31o 44, 533’
56 TR-Suv19 1123 / E 19 / 16 Çolaklı, Manavgat, Antalya N 36o 50, 216’ E 31o 18, 803’
57 TR-Suv20 1224 / D 20 / 1 Kırıkköy, Lüleburgaz, Kırklareli N 41o 28, 239’ E 27o 14, 581’
58 TR-Suv21 1236 / E 21 / 5 Kandıra yolu, Kocaeli N 40o 47, 496’ E 29o 58, 877’
59 TR-Suv22 1263 / D 22 / 13 Sahilkent, Finike, Antalya N 36o 18, 957’ E 30o 11, 402’
60 TR-Suv23 1264 / E 23 / 11 İnlice, Fethiye, Muğla N 36o 44, 313’ E 28o 58, 273’
61 TR-Suv24 1286 / D 24 / 58 Arhavi, Artvin N 41o 22, 303’ E 41o 20, 505’
62 TR-Suv25 1295 / E 25 / 53 Küçükdere, Vakfıkebir, Trabzon N 41o 04, 052’ E 39o 20, 717’
63 TR-Suv26 1303 / E 26 / 45 Akkuş, Ordu N 40o 47, 160’ E 37o 01, 775’
64 TR-Suv27 1305 / E 27 / 3 Gelibolu, Çanakkale N 40o 21’ E 26o 26’
65 TR-Suv28 1309 / E 28 / 2 Kirikköy,Lüleburgaz, Kirklareli N 41o 28, 239’ E 27o 14, 581’
66 TR-Suv29 1354 / ? 29 / 4 Bandırma, Balıkesir N 40o 21’ E 27o 55’
26
Şekil 3.1. C. suaveolens örneklerinin toplandığı lokaliteler ve tespit edilen haplotiplerin dağılımı (Haplotip no / Harita no).
Tablo 3.2. Bu çalışmada mtDNA analizi yapılan 66 C. suaveolens örneğinden tespit edilen 29 haplotipin ortak baz dizisi.
---
“ATGACCAACATCCGAAAAACACACCCACTAATAAAAATTATTAATAGCTCT TTTATTGACTTACCAGCACCTTCAAACATTTCATCATGATGAAACTTCGGCT CCTTACTAGGAATTTGCCTAATTACCCAAATCTTAACCGGATTATTTTTAGC CATACACTACACATCAGATACTATAACGGCCTTTTCCTCCGTCACACATATC TGCCGAGACGTAAATTATGGTTGACTAATTCGGTATCTTCACGCTAATGGTG CTTCCATATTTTTCATTTGCCTATTCCTCCATGTAGGACGAGGACTTTATTAT GGCTCTTATATATATCTTGAAACATGAAACGTTGGTGTTCTACTCTTATTCGC AGTAATAGCAACAGCC"
--- 3.1.3. Crocidura leucodon (Hermann, 1780)
1780. Sorex leucodon Hermann, In Zimmermann, Geogr. Gesch. Mensch. Vierf.
Thiere, 2: 382.
Tip yeri: Strasbourg çevresi, Bas Rhin, Fransa.
3.1.4. Crocidura leucodon’ a Ait mtDNA Sitokrom b Haplotipleri
Türkiye’ deki 11 değişik lokaliteden toplanan C. leucodon türüne ait 14 örneğin mtDNA cyt b geninin kısmi dizi (381 bç) analizine göre, yedi haplotip tespit edildi (Tablo 3.4 ve Şekil 3.2). Haplotip çeşitliliği (Haplotype Diversity, Hd) 0.8901, nükleotid çeşitliliği (Nucleotide Diversity, Pi, ) 0.00756 olarak bulundu. C. leucodon için haplotip çeşitlilik değerinin 1’ e yakın değerde çıkması, genetik çeşitliliğin nispeten yüksek olduğunu ifade etmektedir. Tespit edilen yedi haplotip için oluşturulan ortak baz dizisi Şekil 3.3’ de verildi.
Tablo 3.3. Bu çalışmada mtDNA analizi yapılan 14 C. leucodon örneğinden tespit edilen 11 haplotipin ortak baz dizisi.
---
"ATGACTAACATCCGAAAAACTCACCCACTAATAAAAATTGTTAATAGTTCT TTTATTGATCTACCAGCCCCCTCCAACATCTCATCATGATGAAATTTTGGCTC CTTACTAGGAATCTGCTTAATTGCACAAATCTTAACAGGACTATTCTTAGCC ATACACTATACATCAGATACTACAACAGCTTTCTCCTCCGTAACACATATTT GCCGAGATGTAAATTACGGCTGACTAATTCGTTACCTCCACGCCAATGGCGC CTCCATATTTTTCATTTGCTTATTTCTTCATGTAGGTCGAGGATTCTACTATG GCTCCTATATATTCCTTGAAACATGAAACATCGGTGTCCTGCTCTTATTTGC AGTTATAGCTACCGCC"
---
28
Tablo 3.4. C. leucodon’ a ait örneklerin lokalite bilgileri ve tespit edilen mtDNA sitokrom b haplotipler.
Sıra No
Cyt b Haplotipleri
Örnek No / Cinsiyet
Haplotip / Harita No Lokaliteler Koordinatlar
1 TR-Leu1 1306 / E 1 / 1 Gelibolu, Çanakkale N 40o 21’ E 26o 26’
2 TR-Leu1 614 / E 1 / 2 Kefken, Kandıra, Kocaeli N 41o 09, 498’ E 30o 14, 047’
3 TR-Leu2 615 / E 2 / 3 D.Y. Hasanbey Köyü, Kaynaşlı, Düzce N 40o 46, 284’ E 31o 20, 753’
4 TR-Leu2 833 / E 2 / 6 Demirciler Mh., Erikli, Samsun N 41o 21, 385’ E 36o 42, 277’
5 TR-Leu3 616 / E 3 / 4 D.Y. Hasanbey Köyü, Kaynaşlı, Düzce N 40o 46, 284’ E 31o 20, 753’
6 TR-Leu4 913 / D 4 / 9 Çaykara, Trabzon N 40o 46, 436’ E 40o 15, 408’
7 TR-Leu4 1287 / E 4 / 11 Arhavi, Artvin N 41o 22, 303’ E 41o 20, 505’
8 TR-Leu5 915 / E 5 / 8 Çaykara, Trabzon N 40o 46, 436’ E 40o 15, 408’
9 TR-Leu6 921 / E 6 / 12 Atalar Köyü, Şavşat, Artvin N 41o 20, 615’ E 42o 21, 125’
10 TR-Leu6 1274 / E 6 / 7 Altındere, Maçka, Trabzon N 40o 45, 464’ E 39o 36, 870’
11 TR-Leu6 1276 / E 6 / 10 Yıldız Köyü, Araklı, Trabzon N 40o 53, 261’ E 40o 03, 386’
12 TR-Leu6 1289 / E 6 / 13 Dumlu, Erzurum N 40o 06, 015’ E 41o 23, 055’
13 TR-Leu7 1228 / E 7 / 5 Dereköy, Nallıhan, Ankara N 40o 16, 681’ E 31o 20, 526’
14 TR-Leu7 1229 / E 7 / 5 Dereköy, Nallihan, Ankara N 40o 16, 681’ E 31o 20, 526’
Şekil 3.2. C. leucodon örneklerinin toplandığı lokaliteler ve tespit edilen haplotiplerin dağılımı (Haplotip no/ Harita no).
Tablo 3.5. Türkiye’ nin farklı lokalitelerinden toplanmış C. suaveolens ve C. leucodon’
a ait toplam 36 haplotipin baz kompozisyonu.
---
