Bu Çalışmada Tespit Edilen Haplotipler ile Türkiye ve Yakın Çevresinden

Analizi

Bu çalışmada tespit edilen 36 adet haplotip ile Türkiye ve yakın çevresini kapsayan daha önceki çalışmalardan Gen Bankası’ nda depolanmış haplotiplerin bir araya getirilmesiyle iki DNA veri seti oluşturuldu.

Birinci DNA veri seti, bu çalışmada tespit edilen 29 C. suaveolens haplotipi ile Gen Bankası’ nda bulunan Türkiye’ den kaydedilmiş 12 C. suaveolens haplotipinin bir araya getirilmesiyle oluşturuldu. Dizi uzunluğu 351 bç olan 36 haplotip tespit edildi. 351 bç uzunluğuna göre haplotip çeşitliliği (haplotype diversity, Hd) 0.9939 iken nükleotid çeşitliliği (nucleotide diversity, Pi, ) 0.02266 olarak tespit edilmiştir. Yaygın olarak kullanılan K2P uzaklık metoduna göre haplotipler arası genetik uzaklık değerleri, en düşük 0.003, en yüksek 0.051 ve ortalama olarak 0.027 değerinde bulunmuştur. 351 bç uzunluğa göre bu çalışmada tespit edilen TR-Suv6 haplotipi, Gen Bankası’ ndan alınan İstanbul örnekleriyle; TR-Suv2 haplotipi, Karaman örnekleriyle; TR-Suv20 haplotipi, İstanbul ve Kırklareli örnekleriyle ve TR-Suv4 haplotipi ise Bilecik ve Bursa örnekleriyle aynı DNA dizisine sahip olduğu tespit edildi.

Kimura 2 Parametre baz değişim modeli kullanılarak oluşturulan NJ ağacı (Şekil 3.6) incelendiğinde haplotiplerin iki ana soy hattına (I, II ve III) ayrıldığı gözlenmektedir.

Bazal kısımda toplanan C. suaveolens haplotiplerinin (III) Anadolu’ nun batı kısmına ait olduğu belirlenirken diğer soy hattı ise kendi içerisinde dallanarak Trakya (II) ve Anadolu’ nun geri kalan kısımlarına (I) ait haplotipleri içermektedir.

İkinci veri seti ise, bu çalışmada tespit edilen haplotipler ile Türkiye ve yakın çevresini kapsayan daha önceki çalışmalarda bulunan ve Gen Bankası’ nda depolanmış C.

leucodon ve C. suaveolens’ e ait toplam 105 (80 adet C. suaveolens haplotipi, 25 adet C.

leucodon haplotipi) haplotipin bir araya getirilmesiyle oluşturuldu. 252 bç uzunluğuna göre 105 haplotip içerisinde, bazı haplotiplerin aynı olduğu tespit edildi. Aynı diziye sahip haplotipler, Tablo 3.7’ de gösterildi. 252 bç uzunluğuna göre oluşturulan ikinci veri setinin değerlendirilmesi sonucunda 58 haplotip belirlendi ve haplotip çeşitliliği (haplotype diversity, Hd) ise 0.9410 olarak bulundu. Tespit edilen 58 haplotipten oluşturulan veri setinde bazların oranı A % 26.8, G % 15.2, T (U) % 34.2 ve C % 23.8 olarak bulundu. Bu oranlara bakıldığında veri setindeki DNA dizileri, A - T bazları bakımından zengin olup (% 61). G - C bazları bakımından daha düşük (%39) olduğu gözlendi.

Bu çalışmada tespit edilenler ve Gen Bankası’ nda bulunan haplotipler arasındaki filogenetik ilişkileri göstermek için yaygın olarak kullanılan Kimura 2 Parametre baz değişim (K2P) modeli [49] seçilerek NJ ağacı (Şekil 3.7) üretildi. Dış grup olarak Sorex satunini türüne ait dizi kullanılarak üretilen Şekil 3.7’ deki NJ ağacı incelendiğinde, iki ana soy hattı (C. leucodonve C. suaveolens) görülmektedir. Bu soy hatları % 90 ve

% 100 gibi yüksek bootstrap değerleriyle desteklenmektedir. C. leucodon türünü ifade eden ana soy hattı % 67 ve % 94’ lik bootstrap değerleriyle desteklenen iki alt soy hattına ayrılırken, C. suaveolens türünü ifade eden ana soy hattının ise çok sayıda alt soy hattına ayrıldığı görülmektedir (Şekil 3.7).

38

Şekil 3.6. Türkiye’ yi temsil eden 36 C. suaveolens haplotipi arasındaki filogenetik ilişkiyi gösteren K2P baz değişim modeli kullanılarak üretilen NJ ağacı.

Tablo 3.7. Bu çalışmada tespit edilenler ve Gen Bankası’ ndan elde edilen cyt b

haplotiplerinin 252 bç uzunluğuna göre yeniden düzenlenmesiyle oluşturulan 252 baz uzunluğunda aynı diziye ait haplotipler.

252 baz uzunluğundaki cyt b haplotileri

Aynı diziye sahip olduğu tespit edilen cyt b haplotip örnekleri

MH-Leu1 TR-Leu1, DQ994791-92

MH-Leu2 TR-Leu2, TR-Leu7, DQ994751, DQ994786, DQ994796 MH-Leu3 TR-Leu4,DQ994752-53-54-55-56-57-58, DQ994760

MH-Suv5 TR-Suv20, EU271933, EU271923, AY843455, AY843449, AY843458

MH-Suv6 AY994371-72-73, AY843467, AY843475-76, DQ630063

MH-Suv7 AY843487-88

MH-Suv8 AY843496, DQ630084

MH-Suv9 DQ630100, DQ630105-06

40

Şekil 3.7. Bu çalışmada tespit edilenler ve Gen Bankası’ ndan toplanan Türkiye ve yakın çevresine ait Crocidura haplotipleri arasındaki filogenetik ilişkiyi gösteren K2P modeli kullanılarak üretilen NJ ağacı.

4.1. Tartışma

Bu çalışmada Türkiye’ de yayılış gösteren Crocidura cinsine ait 80 örneğin mtDNA cyt b geninin kismi dizi (381 bç) analizine dayanarak genetik varyasyonu araştırıldı ve filogenetik analizi yapıldı. mtDNA cyt b geninin dizi analiz sonuçları, Türkiye’ de Crocidura cinsinin iki türünün (C. suaveolens ve C. leucodon) varlığını desteklemektedir.

Crocidura cinsi, Soricidae familyası ve diğer memeli familyaları içerisinde en çok türe ve dünyada geniş yayılışa sahip cinslerden biri olup [12] farklı coğrafyalarda yayılış gösteren türleri ile ilgili çok sayıda morfolojik, karyolojik, biyokimyasal ve moleküler çalışma mevcuttur [13-28, 30, 45, 51-63]. Bu çalışmalar arasında Türkiye’ de ve yakın coğrafyalarda yayılış gösteren Crocidura cinsine ait taksonlar ile ilgili detaylı morfolojik, karyolojik ve moleküler tabanlı çalışmalar da bulunmaktadır [10, 13-28, 45, 62, 63].

Türkiye genelinden elde ettiği çok sayıda Crocidura örneğini kafatası ve post özelliklerine göre inceleyen Şimşek [13], incelediği örneklerin morfolojik özelliklere göre C. suaveolens, C. leucodon, C. russula, ve C. lasiura türlerine ait olduğunu, bununla beraber C. pergrisea arispa’ ya ait örnek elde edemediğini belirtmiştir.

Akdeniz ve Orta Doğu bölgesinde yayılış gösteren Crocidura cinsine ait örnekleri karyolojik, morfolojik ve biyokimyasal olarak inceleyen Catzeflis et al. [14], Türkiye’

deki dört lokaliteden (Rize, Maçka (Scalita) - Trabzon, Kavak - Samsun ve İzmir) elde edilen örnekleri ise morfolojik ve karyolojik özeliklere göre C. suavelens ile C.

leucodon türlerine ait olduğunu belirttiler. Kısa bir süre sonra allozim

42

elektroforezinin de kullanıldığı çalışmada Türkiye örneklerini de kullanan Vogel et al.

[15], 26 lokus çalışmışlar ve yedi lokusu polimorfik, geriye kalan lokusları ise monomorfik olduğunu belirtmişlerdir. Türkiye’ den dört lokaliteye (Rize, Maçka -Trabzon, Kavak - Samsun ve İzmir) ait Crocidura örneklerini C. suaveolens olarak değerlendirilmiş ve sekiz lokalite (Kavak - Samsun, Maçka - Trabzon, İzmir, Rize, Girit - Yunanistan, Mendrisio - İsviçre, Selanik - Yunanistan, Laxla - Kıbrıs) arasındaki genetik uzaklık değerleri, 0.000 ile 0.187 arasında değişirken ortalama genetik uzaklık ise 0.077’ dir. Türkiye populasyonları arasında genetik uzaklık değerleri ise 0.000 ile 0.009 arasında değişirken ortalama genetik uzaklık yaklaşık olarak 0.004 olarak belirlenmiştir. Standart genetik uzaklık değerleri kullanılarak üretilen UPGMA (The unweighted pair group method with arithmetic averages) dendrogramına göre Türkiye’

den çalışmaya dahil edilen dört populasyon, Girit populasyonu ile birlikte gruplanmıştır.

Vogel et al. [15]’ nın allozim elekroforezinden elde ettiği veriye göre C. suaveolens ve C. leucodon arasındaki ortalama genetik uzaklık 0.270 olup Türkiye populasyonları ile Türkiye dışından C. suaveolens populasyonları arasındaki genetik uzaklık değerleri 0.000 ile 0.140 arasında değişirken ortalama genetik uzaklık ise 0.0838’ dir.

Bu çalışmada kullanılandan farklı bir belirteç kullanan Vogel et al. [15]’ nın sonuçlarıyla mtDNA cyt b geni kısmi dizi (381 bp) analiz sonuçları karşılaştırılırsa;

mtDNA cyt b geni kısmi dizi (381 bp) analizine göre Türkiye C. suaveolens haplotipleri arasındaki genetik uzaklık (K2P - Pairwise Distance) değerleri 0.003 ile 0.044 arasında değişirken ortalama genetik uzaklık ise 0.0235’ dir. Vogel et al. [15]’ nın Türkiye’ den dört populasyon arasındaki genetik uzaklık değerlerinin oldukça düşük olmasının nedeni, az sayıda ve üçü nispeten yakın lokalitelerden örneklerle çalışılmasından kaynaklanmış olabilir. Bu çalışmadaki C. suaveolens ve C. leucodon arasındaki genetik uzaklık değerleri, 0.144 ile 0.165 arasında değişirken ortalama genetik uzaklık ise 0.1545’ dir. C. suaveolens ve C. leucodon arasında gözlenen genetik uzaklık değerinin bu çalışmada daha düşük çıkması Vogel et al. [15]’ nın örnekleri geniş bir coğrafyadan örnekleri elde etmiş olmasından kaynaklanabilir.

Türkiye’ den çok sayıda Crocidura örneğini inceleyen Kefelioğlu ve Tez [16], Tez ve Kefelioğlu [17] ve Tez [18], çalışılan örneklerin hem karyolojik hem de kafatası ve post özelliklerine göre C. suaveolens (2n= 40) ve C. leucodon (2n= 28)’ a ait olduklarını rapor ettiler. Jiang ve Hoffmann [19], revizyon çalışmasında Güney Çin Crocidura

populasyonları ile birlikte Türkiye’ nin İç Anadolu Bölgesi’nden Crocidura cinsine ait müze örneklerini morfolojik olarak karşılaştırmışlar ve Türkiye örneklerini C.

suaveolens olarak kaydetmişlerdir.

Türkiye ve Kıbrıs memelilerinin tür listesini hazırlayan Krystufek ve Vohralik [10], hem kendi verilerini hem de Türkiye’ de yayılış gösteren Crocidura cinsine ait örneklerin yer aldığı başka yazarların çalışmalarını değerlendirerek Türkiye’ de üç türün (C. suaveolens, C. leucodon ve C. arispa) yayılış gösterdiğini belirtmilerdir.

Genetik varyasyonun belirlenmesinde kullanılan DNA belirteçlerinin birçoğu dolaylı yollardan farklılığı belirlemeye yönelik çalışmaları kapsar. Bununla birlikte son yıllarda DNA dizi analizinin yaygınlaşması ve bu amaç için cihazlar geliştirilmesi daha fazla örnekle çalışma fırsatı da vermektedir [64]. DNA belirteçlerinden biri olan mtDNA, filogenetik ve popülasyon çalışmalarında yaygın olarak kullanılmaya başlanmıştır [28, 30, 32]. Bu bağlamda son yıllarda Türkiye ve yakın coğrafyasında yayılış gösteren Crocidura türlerini kapsayan mtDNA’ ya dayalı çalışmalarda bir artış sözkonusudur [15, 20 - 28, 45, 62, 63].

mtDNA cyt b dizilerinin kullanıldığı çalışmada Vogel et al. [22], Kanarya Adaları'ndaki Crocidura türlerinin kökenini ve taksonomik durumunu incelemişler ve Avrupa, Kuzeybatı Afrika ve Kafkasya civarında yayılış gösteren türlerle karşılaştırmasını yapmışlardır. Vogel et al. [22]’ nın bu çalışmasındaki analizlere Türkiye’ den C.

leucodon’ a ait bir haplotip’ de dahil edilmiş ve C. leucodon’ nun Türkiye haplotipi, İsviçre haplotipi ile birlikte Fas, Tunus ve İspanya’ dan C. russula ve Kanarya Adaları'ndan C. osorio haplotiplerinin yer aldığı soy hattının bazalına bağlanmıştır.

C. suaveolens tür grubu (2n= 40) içerisinde yer alan taksonların (C. suaveolens, C.

gueldenstaedtii, C. caspica, C. sibirica, C. mimula) filogenetik ilişkilerini iki bağımsız belirteç olan inter - SINE - PCR (Interspersed Repeat PCR fingerprints) ve mtDNA’nın cyt b geninin tamamı (1140 bp) veya kismi (400 bp) dizilerine dayanarak analiz eden Bannikova et al. [45], Türkiye’ nin doğu ve kuzeydoğu sınırına yakın Kafkasya bölgesinden Crocidura örneklerini, C. suaveolens, C. gueldenstaedtii ve C. caspica olarak değerlendirdiler ve tüm verileri kombine ederek Nei-Li genetik uzaklık modelini kullanmak suretiyle hesapladıkları değerlere göre C. suaveolens türü kendi içerisinde en küçük 0.046 ve en büyük 0.567, C. suaveolens ile C. gueldenstaedtii arasındaki en

44

küçük değer 0.399 ve en büyük değer 0.552 iken C. suaveolens ile C. caspica arasındaki en büyük değeri 0.618 ve en küçük değeri 0.342 olarak tespit etmişlerdir. C. suaveolens ile C. leucodon türleri arasında genetik uzaklıklar da 1.309 ile 1.508 olarak buldukları görülmektedir. Bu çalışmada K2P modeli kullanılarak hesaplanan genetik uzaklık değerlerinde C. suaveolens için en küçük değer 0.003 ve en yüksek değer 0.044 iken C.

suaveolens ile C. leucodon türleri arasında en küçük değer 0.144, en büyük genetik uzaklık değeri ise 0.165 olarak tespit edilmiştir. Bannikova et al.[45]’ un C. suaveolens’

in kendi içerisinde ve C. suaveolens ile C. leucodon türleri arasındaki genetik uzaklık değerlerini kendi çalışmamızda göstermiş olduğumuz değerlerle karşılaştırdığımızda Bannikova et al. [45]’ un bulmuş olduğu değerlerin bu kadar farklı çıkmasının nedeni olarak kullanılan parametrelerin, modellerin ve seçilen bazı belirteçlerin farklı olmasından kaynaklanmış olabileceği düşünülmektedir.

Memeli genomunda bulunan kısa tekrar dizilerinin çoğaltılması için inter - SINE - PCR (inter - MIR - ve inter - SOR - PCR) yöntemini kullanan Bannikova et al. [62], Afrotropical ve Palaearktik Crocidura türlerinin filogenetik ilişkilerini belirlemeye çalıştılar. Filogenetik ilişkileri ortaya çıkarmak için NJ ve MP metotlarını kullanan bu araştırıcılar, elde ettikleri filogenetik ağaçlarda üç ana kümelenme tespit etmişler ve bu kümelenmelerde C. leucodon türü, Afrika’ ya ait 50 kromozomlu türlerle birlikte kümelenirken 40 kromozomlu C. suaveolens tür grubu olarak bilinen türler (C.

suaveolens, C. gueldenstaedtii, C. sibirica) ise ayrı büyük bir grup olarak kümelenmiştir. Bannikova et al. [62]’ nın bu çalışmasında Türkiye’ ye yakın bir coğrafya olan Kafkasya’ dan Crocidura örnekleri, C. suaveolens, C. gueldenstaedtii ve C. leucodon olarak kaydedilmiştir.

C. suaveolens tür grubuna ait Portekiz’ den Japonya’ ya kadar olan coğrafya sınırları içerisinden elde edilen 143 örneğin mtDNA cyt b geninin 998 bazlık ve BRCA1 geninin 799 bazlık kısmının dizi analizini yapan Dubey et al. [23], Türkiye’ dende örneklerin bulunduğu çalışmada cyt b geninin 998 bazlık dizisine dayanarak ML metodu ile C.

suaveolens-grubun filogenisini ortaya koydular ve bu filogenide yedi soy hattı tespit ettiler. Dubey et al. [23]’ nın çalışmasında Türkiye’ den Trabzon (Altındere), Samsun (Çakallı) ve Rize örnekleri V. soy hattı içerisinde yer alırken ve Ege bölgesinden (Vukarikisilka - büyük ihtimalle Yukarıkızılca - İzmir) bir örnek ise VI. soy hattı

içerisinde yer alarak Türkiye örnekleri doğu ve batı şeklinde iki ayrı soy hattı içerisinde kümelenmiştir.

Dubey et al. [24], Akdeniz’ deki adaları kapsayacak şekilde Akdeniz havzası civarından ve Orta Doğu’ dan toplanmış C. suaveolens grubuna ait 143 örneğin mtDNA cyt b geninin 998 baz uzunluğundaki haplotiplerini ML, MP ve NJ metodlarını kullanarak analiz ettiler. Türkiye’ den C. suaveolens' in sekiz haplotipini de (Bunlardan dördü Dubey et al. [23]’ nın çalışmasında kullanılan haplotiplerdir) analizlere dahil eden Dubey et al. [24]' nın çalışmasında ML, MP ve NJ metodları için %100’ lük bootstrap değerleriyle desteklenmiş ve iyi tanımlanmış on büyük soy hattı gözlenmektedir.

Türkiye haplotipleri, Dubey et al. [23]’ nın çalışmasında olduğu gibi iki soy hattı içerinde yer almışlardır. Vuyukarikisilka (Büyük ihtimalle Yukarıkızılca - İzmir) haplotipi, VI. soy hattında yer alırken geri kalan yedi haplotip (Rize, Trabzon, Samsun, Kahramanmaraş, Konya, Adana ve Hatay) ise V. soy hattı içerinde yer almıştır. Dubey ve ark. [24]’ nın çalışmasında Türkiye örnekleri, Dubey et al. [23]’ nın çalışmasında olduğu gibi doğu ve batı şeklinde iki ayrı soy hattı içerinde kümelenmiştir. Dubey et al.

[28], çoğunluğu Türkiye’ den olmak üzere (48 birey) 58 adet C. suaveolens örneğinin yaklaşık 400 bç’ lik cyt b geni ile 799 bç uzunluğundaki BRCA1 geninin dizi analizlerini yaparak Türkiye’ de yayılış gösteren C. suaveolens bireyleri arasındaki hibrid zonları belirlemişlerdir. Türkiye’ nin batısında bulunan VI ve VII soy hatları arasında hibritleşmenin bulunduğunu belirtmişlerdir. Benzer bir şekilde V ile VI soy hatları arasında da bir hibritleşmenin olduğu ve nüklear belirtecin hibrid zonunun (yaklaşık 600 km) mitokondrial belirtece (yaklaşık 50 km) oranla daha geniş olduğunu göstermişlerdir.

Üç Avrupa ve bazı Afrika türlerine ait örneklerin cyt b geninin 998 bazlık kısmının dizi analizini yapıldığı çalışmada Dubey et al. [26], Türkiye’ den C. leucodon’ a ait bir

46

Türkiye'den C. leucodon’ un Trabzon-Maçka-Altındere örneği eski dünya soy hattı içerisinde ve bazalda yer aldığı görülmektedir.

Dubey et al. [27], Türkiye’nin de içinde yer aldığı Fransa’ dan Gürcistan’ a uzanan bölgedeki C. leucodon tür ana genetik soy hatlarını ve bu soy hatları üzerinde Pleistosen dönemi iklimsel varyasyonların etkisini ortaya çıkarmak için mtDNA cyt b geninin 1077 bazlık ve nüklear DNA Apolipoprotein B geninin 511 bazlık kısmının dizi analizini yaptılar. Bu yazarların C. leucodon için mtDNA cyt b analizleri, orta Pleistosen boyunca ayrılmış Avrupa ve Yakın Doğu olmak üzere iki soy hattı ortaya çıkardı. Avrupa soy hattı, Fransa'nın doğu tarafından kuzey - batı Türkiye’ ye kadar olan kısmı kapsarken Yakın Doğu soy hattı ise Gürcistan’ dan Romanya’ ya kadar olan kısmı (Türkiye’ nin kuzey batı kısmı hariç geri kalan kısmı dahil) kapsamaktadır. C.

leucodon’ un Avrupa soy hattı içerisinde yer alan örnekler, Çanakkale (Katrancı - Biga ve Terzialan - Çan) ve İzmir’ den (Özbek) elde edilirken Yakın Doğu soy hattı içerisinde yer alan örnekler ise Rize, Trabzon (Altındere), Samsun (Çakallı), Karaman (Yellibeli) ve Antalya’ dan (Çığlıkara) elde edilmiştir.

Bu çalışmada elde edilen 80 örneğin kısmi mtDNA cyt b geninin 381 bç’ lik dizileriyle oluşturulan veri seti ile daha önce Gen Banka'sında depolanmış olan Türkiye’ de yayılış gösteren Crocidura örneklerinin mtDNA cyt b geninin aynı uzunluktaki dizilerinin birleştirilerek oluşturulan veri setinin, MP ve NJ metodları ile yapılan analizlerde üretilen filogenetik ağaçların topolojisi, nispeten benzerlik göstermektedir (Şekil 3.3, 3.4, 3.5). Dış grup olarak Sorex satunini’ ye ait dizinin kullanıldığı analizler sonucunda

% 100’ lük bootstrap değerleriyle desteklenmiş iki ana soy hattı elde edildi (Şekil 3.3, 3.4, 3.5). Bazalda % 100’ lük bootstrap değeriyle desteklenen soy hattı, hem bu çalışmada hem de daha önceki çalışmada [27] C. leucodon’ a ait haplotiplerin toplandığı soy hattını oluştururken diğer büyük soy hattı ise hem bu çalışmada hem de daha önceki çalışmalarda [23, 24, 28] C. suaveolens’ e haplotiplerden oluştu. C. suaveolens olarak gözlenen ana soy hattı, çok sayıda alt soy hattından oluşurken C. leucodon olarak isimlendirilen soy hattı ise iki alt soy hattından oluşmaktadır.