Total DNA’ nın Agaroz Jelde Yürütülmesi ve Görüntülenmesi

Dokulardan total DNA elde edilip edilmediğini anlamak için agaroz jel elektroforez yöntemi kullanıldı.

*Elde edilen total DNA’ lar, % 0.8’ lik agaroz jelde yürütülerek görüntülendi. %0.8’ lik agaroz jel hazırlanması için bir erlende 1.2 gram agaroz ve üzerine 150 ml 1X TAE

14

(Trisma Base, Glacial Asetic Acid, EDTA) çözeltisi eklendi. Karışım mikrodalga fırında ısıtılarak manyetik karıştırıcıda balık yardımıyla karıştırılıp karışım sıcaklığının 40 – 42 ^oC’ ye düşmesi beklendi. Sıcaklığın uygun değerleri düşmesi beklenirken çözeltiye 1 mg/ml Etidyum Bromid’ den 8 µl eklendi.

*Elektroforez tepsisine taraklar yerleştirilerek çözelti kabarcık oluşmayacak şekilde döküldü ve donması beklendi. Donduğu anlaşılan jelden taraklar dikkatli bir şekilde çıkarılarak elektorforez tepsisi, elektroforez tankına yerleştirildi. Jelin üzerini tamamen kaplayacak şekilde 1X’ lik TAE tamponu tanka dolduruldu.

*Kuyucuklara 10 µl total DNA ve 2 µl 6X Loading Dye (% 40’ lık sükroz, xylene cyanol FF ve Bromophenol Blue) karıştırılarak kuyucuklara yüklendi.

*Kuyucuklara yüklenen karışım 80 V doğrusal akımda 1 saat yürütüldü. Yürütülmesi tamamlanan jelin görüntüsü, jel görüntüleme cihazında (KODAK Gel Logic 1500 jel görüntüleme sistemi) UV yardımıyla alındı.

Şekil 2.2. Total DNA izolasyonu gerçekleştirilmiş Crocidura cinsine ait bazı örneklerin agaroz jel görüntüsü.

2.2.3. Mitokondrial DNA’ nın Sitokrom b Gen Bölgesinin PCR ile Çoğaltılması Tüm örneklerden elde edilen total DNA’ lar, mtDNA sitokrom b gen bölgesi için kalıp DNA olarak kullanıldı.

Bu sitokrom b gen bölgesinin çoğaltılması için;

L14724 (5’-GATATGAAAAACCATCGTTG-3’) ve H15149 (5’-

CAGAATTGATATTTGTCCTCA-3’) primer çifti kullanıldı [41 - 43].

Şekil 2.3. Crocidura örneklerinden sitokrom b genini amplifiye etmek için kullanılan L14724 ve H15149 primerlerinin PCR stratejisi [41].

Yapılan çalışmalarda kullanılan PCR bileşenleri ve miktarları:

Bileşenler Kullanılan miktar Son konsantrasyon

10X Taq Buffer 5 µl 1X

10 uM L14724 Primer 5 µl 1 µM

10 uM H15149 Primer 5 µl 1 µM

10 mM dNTP mix 1 µl 200 µM

Taq DNA Polimeraz 5 ü/µl 0.4 µl 2 ü

25 mM MgCl2 4 µl 2 mM

DNA (1/5 oranında seyreltiliş) 5 µl ----

dH2O 24.6 µl ----

Total hacim 50 µl

İstenilen bölgenin çoğaltılması için gradient özelliğine sahip thermocycler (SENSOQEST) kullanıldı.

Çoğaltılan cyt b gen bölgesinin PCR döngü şartları:

Basamak Sıcaklık (^oC) Süre Döngü Sayısı Ön Denatürasyon 95 3 dk. 1

Denatürasyon 94 1 dk. 30 Bağlanma 50 1 dk. 30 Uzama 72 1.5 dk. 30 Sonlandırma 72 7 dk. 1

16

2.2.4. Çoğaltılan PCR Ürünlerinin Agaroz Jelde Görüntülenmesi

Çoğaltılan PCR ürünleri, % 2’ lik agaroz jelde yürütülerek dizi analizi yapılacak olan gen bölgesinin çoğaltılıp çoğaltılmadığı gözlendi. PCR ürünlerinin yürütülmesi için jel, 3 mg agaroz, 150 ml 1X TAE’ lik tamponunda çözdürülerek hazırlandı. Agaroz, tamponda çözdürüldükten sonra mikrodalga fırında ısıtılıp 8 µl Etidyum Bromid eklenerek sıcaklık 40 - 42^o C’ye düşene kadar manyetik karıştırıcıda karıştırıldı.

Elektroforez tepsisine taraklar yerleştirilerek çözelti kabarcık oluşmayacak şekilde tepsiye döküldü ve donması beklendi. Donduğu anlaşılan jelden taraklar dikkatli bir şekilde çıkarılarak elektroforez tepsisi, elektroforez tankına yerleştirildi. Jelin üzerini tamamen kaplayacak şekilde 1X’ lik TAE tamponu tanka dolduruldu.

10 µl total DNA ve 2 µl 6X’ lik Loading Dye karıştırılarak kuyucukların biri boş bırakılacak şekilde yüklendi. Bu boş kuyucuğa 6 µl 1000 bç’ lik DNA Ladder yüklendi.

80 V doğrusal akımda 1 saat yürütüldü. Yürütülmesi tamamlanan jel, jel görüntüleme cihazında (KODAK Gel Logic 1500 jel görüntüleme sistemi) UV yardımıyla görüntüsü alındı.

Şekil 2.4. Crocidura örneklerinden elde edilen total DNA’ lar kullanılarak L14724 ve H15149 primeleri yardımıyla çoğaltılan PCR ürünlerinin agaroz jelde görüntüsü.

Her bir örnek için hedef bölge DNA dizisi, ileri ve geri olmak üzere iki yönde elde edildi. İleri primer olarak L14724 (5’-GATATGAAAAACCATCGTTG -3’) ve geri primer olarak H15149 (5’-CAGAATTGATATTTGTCCTCA-3’) kullanıldı [41 - 43].

mtDNA dizi analizi, otomatik DNA dizi analiz sistemi (ABI PRISM 310 Genetic Analyzer) kullanılarak RefGen (ODTÜ-Teknopark/Ankara) Gen Araştırmaları ve Biyoteknoloji Laboratuar’ ından hizmet alımı şeklinde yapıldı.

Şekil 2.5. Crocidura örneğine ait L14724 no’ lu primer (İleri, Forward) ile elde edilmiş DNA dizi diyagramı.

Şekil 2.6. Crocidura örneğine ait H15149 no’ lu primer (Geri, Revers) ile elde edilmiş DNA dizi diyagramı.

2.2.5. Kısmi Sitokrom b Gen Bölgesinin DNA Dizilerinin Hizalanması ve Düzenlenmesi

mtDNA cyt b geninin ham dizileri, BioEdit version 7.0.9.0 [44] programı kullanılarak düzenlendi. Her bir birey için aynı bölgeye ait ileri ve geri (Forward ve Revers) primerler ile elde edilen dizilerin kromatogramları, tek tek gözden geçirildi ve her bir birey için ilgili bölgenin en ortak (consensus) dizileri oluşturuldu. Hizalanan ve

18

çakışmayan DNA dizi kısımları kesilip (trim edilip) aynı uzunluğa getirildi. Aynı uzunluğa getirilen bu diziler, diğer programlar tarafından okunabilmesi ve değişik formatlara dönüştürülebilmesi için fasta formatında kaydedildi.

2.2.6. Crocidura Örneklerinin Filogenetik Analizleri

Filogenetik analizler için bu çalışmada tespit edilen haplotipler ile Türkiye ve yakın çevresini kapsayan daha önceki çalışmalarda bulunan ve Gen Bankası’ nda depolanmış haplotiplerden oluşturulan üç farklı DNA veri seti oluşturuldu.

Birincisi bu çalışmada analizi yapılan mtDNA cyt b genine ait 381 bç uzunluğundaki dizilerin bir araya getirilmesiyle 80 diziden ibaret veri setidir.

İkincisi 351 bç uzunluğundaki bu çalışmada tespit edilen 29 C. suaveolens haplotipi ile Gen Bankası’ nda bulunan Türkiye’ den kaydedilmiş 12 C. suaveolens haplotipinin [28]

bir araya getirilmesiyle oluşturulan veri setidir.

Üçüncüsü ise bu çalışmada tespit edilen haplotipler ile Türkiye ve yakın çevresini kapsayan daha önceki çalışmalarda bulunan ve Gen Bankası’ nda depolanmış C.

leucodon ve C. suaveolens’ e ait toplam 105 (80 adet C. suaveolens haplotipi, 25 adet C.

leucodon haplotipi) haplotipin [24, 27, 28, 45] bir araya getirilmesiyle oluşturulan 252 bç uzunluğundaki 58 haplotipten oluşan veri setidir.

Bu üç veri setinin her biri kendi içerisinde hizalandı ve çakışmayan bölgeler trim (çakışmayan bölgelerin kesilme işlemi) edildi. DnaSP Version 5.10.01 [46] programına aktarılan üç ayrı veri setinin ayrı ayrı yeni haplotipleri ile birlikte genetik varyasyonlar belirlendi.

Filogenetik ilişkileri gösterebilmek için üç ayrı veri setindeki haplotipler, MEGA5 v5.05 [47] programına aktarıldı. Neighbor Joining (NJ), Maximum Parsinmony (MP) ve Maximum Likelihood (ML) metodları kullanılarak filogenetik analizleri yapıldı.

Filogenetik analizlerde dış grup olarak Gen Bankası’ na (NCBI, The National Center for Biotechnology) HM036166 erişim numarasıyla depolanmış Sorex satunini ye ait DNA dizisi [48] kullanıldı.

MEGA5 v5.05 [47]’ a aktarılan 252 bç, 351 bç ve 381 uzunluğundaki üç veri seti için filogenetik analizlerde yaygın olarak kullanılan Kimura 2-parametre (K2P) [49] baz değişim modeli kullanılmıştır. Ayrıca 381 bç uzunluğudaki veri seti için MEGA5 v5.05

[47] programı yardımıyla en iyi baz değişim modeli, Akaike Information Criterion (AIC) ve Bayesian Information criterion (BIC) değerleri baz alınarak belirlendi. En iyi baz değişim modeli olarak gamma değerliğiyle birlikte Tamura - Nei (TN93+G) modeli [50] belirlendi.

Bu çalışmada DNA dizi analizi yapılan Türkiye örneklerine ait 381 bç uzunluğundaki veri setinin ML analizi Tamura - Nei (TN93+G) [50] baz değişim modeli kullanılarak yapıldı. Filogenetik analizlerde NJ metodu için ise en yüksek bootstrap değerlerini verdiğinden TN93+G baz değişim modeli yerine aynı ağaç topolojisi veren gamma değerliğiyle birlikte Tajime - Nei (Tajime - Nei+G) baz değişim modeli kullanıldı.

Parsimoni analizi için MP metodu (Heuristik + Close Neighbor Interchange) kullanıldı.

Parsimoni analizi ile ağaç uzunluğu (tree lenght, TL), tutarlılık indeksi (consistency index, CI) ve koruma indeksi (retention index, RI) elde edildi. ML, MP ve NJ metodlarıyla üretilen ağaçlardaki soy hatlarının ne kadar oranda desteklendiğini saptamak için 1000 tekrarlı (replikasyon) bootstrap analizi yapıldı.

Şekil 2.7. C. suaveolens türüne ait Gen Bankası’ ndan elde edilen haplotiplerin toplandığı bölge.

20

Şekil 2.8. C. leucodon türüne ait Gen Bankası’ ndan elde edilen haplotiplerin toplandığı bölge.

3. BÖLÜM BULGULAR

3.1. Crocidura Wagler, 1832 Cinsine ait Örneklerin mtDNA Sitokrom b Geninin Kısmi Dizi Analizi

Bu çalışmada mitokondriyal cyt b geninin kısmi dizi (381 bç) analizi yapılan 80 Crocidura örneğinin Crocidura suaveolens (Pallas, 1811) (66 örnek) ve Crocidura leucodon (Hermann, 1780) (14 örnek) türlerine ait olduğu belirlendi. DNA analizi yapılan Crocidura örnekleri, daha önce yayınlanmış çalışmalarla [10, 18]

karşılaştırıldığında morfolojik özelliklere göre de bu iki türe ait olduğu gözlendi.

3.1.1. Crocidura suaveolens (Pallas, 1811)

1811. Sorex suaveolens Pallas, Zoogr. Rosso-Asiat., 1: 133.

Tip yeri: Khersones, Sevastopol yakını, Kırım, Rusya.

3.1.2. Crocidura suaveolens’ e ait mtDNA Sitokrom b Haplotipleri

Türkiye’ deki 64 değişik lokaliteden toplanan C. suaveolens türüne ait 66 örnekte çalışılan mitokondrial cyt b geninin dizi analizi sonucunda 381 bç uzunluğunda 29 adet haplotip tespit edildi (Tablo 3.1; Şekil 3.1). Tespit edilen 29 haplotip için oluşturulan ortak baz dizisi Şekil 3.2’ de verildi. C. suaveolens türüne ait haplotip çeşitliliği (haplotype diversity, Hd) 0.8951, nükleotid çeşitliliği (nucleotide diversity, Pi, ) 0.01049 olarak bulundu. C. suaveolens için haplotip çeşitlilik değerinin 1’ e yakın çıkması, genetik çeşitliliğin nispeten yüksek olduğunu ifade etmektedir.

22

Tablo 3.1. C. suaveolens'e ait örneklerin lokalite bilgileri ve tespit edilen mtDNA sitokrom b haplotipleri.

Sıra No Cyt b Haplotipleri

Örnek No / Cinsiyet

Haplotip/Harita No

Lokaliteler Koordinatlar

1 TR-Suv1 502 / E 1 / 22 Aydınkent, Ereğli, Konya N 37^o 25, 118’ E 34^o 10, 468’

2 TR-Suv1 583 / D 1 / 34 İncesu Köyü, Samsun N 41^o 22, 536’ E 36^o 12, 610’

3 TR-Suv1 764 / E 1 / 37 Çamlıbel geçidi yakını İhsaniye Köyü, Tokat N 39^o 59, 140’ E 36^o 30, 552’

4 TR-Suv1 935 / D 1 / 24 Yaprakhisar, Aksaray N 38^o 17, 821’ E 34^o 16, 136’

5 TR-Suv1 1047 / D 1 / 62 Dere içi (Melik Köy), Kars N 40^o 37, 597’ E 43^o 06, 004’

6 TR-Suv1 1072 / E 1 / 51 Arzular Beldesi, Gümüşhane N 40^o 25, 289’ E 39^o 39, 906’

7 TR-Suv1 1089 / D 1 / 60 Kaleboynu, Şavşat, Artvin N 41^o 15, 465’ E 42^o 19, 653’

8 TR-Suv1 1290 / D 1 / 61 Okçular Köyü, Horasan, Erzurum N 40^o 04, 786’ E 42^o 18, 936’

9 TR-Suv1 1292 / D 1 / 59 Ovacık, Artvin N 41^o 09, 627’ E 41^o 58, 210’

10 TR-Suv2 524 / E 2 / 64 Seydişehir, Konya N 37^o 30, 353’ E 31^o 52, 243’

11 TR-Suv2 642 / D 2 / 30 Geriş, Çaycuma, Zonguldak N 41^o 22, 130’ E 32^o 05, 533’

12 TR-Suv2 911 / D 2 / 54 Dernekpazarı, Trabzon N 40^o 47, 683’ E 40^o 15, 588’

13 TR-Suv2 916 / E 2 / 54 Çaykara, Trabzon N 40^o 46,436’ E 40^o 15, 408’

14 TR-Suv2 918 / E 2 / 52 Maçka, Altındere, Trabzon N 40^o 45, 464’ E 39^o 36, 870’

15 TR-Suv2 920 / D 2 / 52 Maçka, Altindere, Trabzon N 40^o 45, 464’ E 39^o 36, 870’

16 TR-Suv2 991 / E 2 / 42 Özbek, Türkoğlu, Kahramanmaraş N 37^o 22, 132’ E 36^o 57, 58’

Tablo 3.1’ in devamı.

17 TR-Suv2 997 / D 2 / 43 Dedeçınar Köyü, Kırıkhan, Hatay N 36^o 37, 486’ E 36^o 25, 847’

18 TR-Suv2 1013/ E 2 / 17 Çarıklar, Anamur, Mersin N 36^o 06, 968’ E 32^o 51, 956’

19 TR-Suv2 1058 / D 2 / 55 Çorapçilar Mh., Rize N 41^o 01, 105’ E 40^o 34, 307’

20 TR-Suv2 1098 / E 2 / 27 Kalecik, Ankara N 40^o 02, 102’ E 33^o 16, 549’

21 TR-Suv2 1280 / E 2 / 64 Arakli, Yildizli Köyü, Trabzon N 40^o 53, 261’ E 40^o 03, 386’

22 TR-Suv3 542 / D 3 / 31 Musa Köy, Ilgaz, Çankırı N 40^o 57’ 440” E 33^o 40’ 300’

23 TR-Suv3 551 / E 3 / 32 Seydiler, Kastamonu N 41^o 37’ 578’’ E 33^o 42’ 733’

24 TR-Suv4 569 / D 4 / 33 Bektaşağa göleti, Bektaşağa, Sinop N 41^o 56, 257’ E 34^o 59, 230’

25 TR-Suv4 594 / E 4 / 28 Rüzgarlar, Bolu N 40^o 44, 147’ E 31^o 47, 930’

26 TR-Suv4 605 / E 4 / 6 Söğütlü, Sakarya N 40^o 53’ 073’ E 30^o 23, 139’

27 TR-Suv4 632 / D 4 / 29 Çay, Eskipazar, Karabük N 41^o 00, 832’ E 32^o 37, 552’

28 TR-Suv4 781 / E 4 / 36 Fındıklı Köyü, Amasya N 40^o 43, 454’ E 35^o 46 696’

29 TR-Suv4 944 / D 4 / 25 Ortaköy, Aksaray N 38^o 43, 209’ E 34^o 04, 581’

30 TR-Suv4 955 / E 4 / 39 Pınarbaşı, Kayseri N 38^o 44, 178’ E 36^o 30, 453’

31 TR-Suv4 1079 / E 4 / 48 Şebinkarahisar, Giresun N 40^o 17, 038’ E 38^o 19, 227’

32 TR-Suv4 1087 / E 4 / 38 10. Km. Fadil irmagi kenari, Sivas N 39^o 40, 933’ E 37^o 05, 582’

33 TR-Suv4 1101 / D 4 / 9 Sivrihisar, Eskişehir N 39^o 31, 617’ E 31^o 37, 819’

34 TR-Suv4 1105 / E 4 / 10 Akşehir, Konya N 38^o 23, 103’ E 31^o 24, 194’

24

Tablo 3.1’ in devamı.

35 TR-Suv4 1109 / D 4 / 26 Çoğun Köyü, Kırşehir N 39^o 18, 729’ E 34^o 07, 775’

36 TR-Suv4 1115 / E 4 / 15 Eğirdir, Isparta N 37^o 41, 778’ E 30^o 52, 620’

37 TR-Suv4 1235 / E 4 / 8 Nallihan, Dereköy, Ankara N 40^o 16, 681’ E 31^o 20, 526’

38 TR-Suv4 1239 / E 4 / 7 D.Y. Hasanbey Köyü,Kaynaşlı, Düzce N 40^o 46, 284’ E 31^o 20, 753’

39 TR-Suv4 1288 / D 4 / 48 Orta Söğütlü Köyü, Terme, Samsun N 41^o 13, 379’ E 36^o 53, 504’

40 TR-Suv5 655 / E 5 / 23 Hasangazi, Ulukışla, Niğde N 37^o 31, 286’ E 34^o 38, 311’

41 TR-Suv5 985 / E 5 / 40 Göksun, Kahramanmaraş N 37^o 58, 624’ E 36^o 30, 000’

42 TR-Suv6 693 / E 6 / 12 Çakırköy, Acıpayam, Denizli N 37^o 17, 149’ E 29^o 19, 611’

43 TR-Suv6 1119 / E 6 / 14 Düzlerçamı, Antalya N 36^o 59, 163’ E 30^o 33, 802’

44 TR-Suv7 832 / E 7 / 35 Erikli, Samsun N 41^o 21, 385’ E 36^o 04, 277’

45 TR-Suv8 843 / D 8 / 46 Perşembe, Ordu N 41^o 03, 899’ E 37^o 37, 173’

46 TR-Suv9 848 / E 9 / 47 Akköy, Giresun N 40^o 51, 978’ E 38^o 19, 041’

47 TR-Suv10 1002 / E 10 / 41 Çukurova TIGEM, Ceyhan, Adana N 37^o 08, 061’ E 35^o 47, 004’

48 TR-Suv11 1005 / E 11 / 21 Sağlıklı Köyü, Tarsus, Mersin N 37^o 00, 730’ E 34^o 57, 601’

49 TR-Suv12 1010 / D 12 / 20 Alata, Erdemli, Mersin N 36^o 34, 331’ E 34^o 15, 590'’

50 TR-Suv13 1022 / E 13 / 18 Çavuş, Ermenek, Karaman N 36^o 33, 177’ E 32^o 56, 132’

51 TR-Suv14 1041 / E 14 / 50 Ganiefendi Köyü, Erzincan N 39^o 41, 514’ E 39^o 36, 630’

Tablo 3.1’ in devamı.

52 TR-Suv15 1054 / D 15 / 57 Uzunyalı, Kemalpaşa Hopa, Artvin N 41^o 29, 001’ E 41^o 32, 463’

53 TR-Suv16 1057 / D 16 / 56 Ayder, Çamlıhemşin, Rize N 40^o 59, 972’ E 41^o 03, 190’

54 TR-Suv17 1082 / E 17 / 49 Ahmethacı Köyü, Zara, Sivas N 39^o 54, 712’ E 37^o 49, 124’

55 TR-Suv18 1112 / E 18 / 19 Beyşehir, Konya N 37^o 42, 477’ E 31^o 44, 533’

56 TR-Suv19 1123 / E 19 / 16 Çolaklı, Manavgat, Antalya N 36^o 50, 216’ E 31^o 18, 803’

57 TR-Suv20 1224 / D 20 / 1 Kırıkköy, Lüleburgaz, Kırklareli N 41^o 28, 239’ E 27^o 14, 581’

58 TR-Suv21 1236 / E 21 / 5 Kandıra yolu, Kocaeli N 40^o 47, 496’ E 29^o 58, 877’

59 TR-Suv22 1263 / D 22 / 13 Sahilkent, Finike, Antalya N 36^o 18, 957’ E 30^o 11, 402’

60 TR-Suv23 1264 / E 23 / 11 İnlice, Fethiye, Muğla N 36^o 44, 313’ E 28^o 58, 273’

61 TR-Suv24 1286 / D 24 / 58 Arhavi, Artvin N 41^o 22, 303’ E 41^o 20, 505’

62 TR-Suv25 1295 / E 25 / 53 Küçükdere, Vakfıkebir, Trabzon N 41^o 04, 052’ E 39^o 20, 717’

63 TR-Suv26 1303 / E 26 / 45 Akkuş, Ordu N 40^o 47, 160’ E 37^o 01, 775’

64 TR-Suv27 1305 / E 27 / 3 Gelibolu, Çanakkale N 40^o 21’ E 26^o 26’

65 TR-Suv28 1309 / E 28 / 2 Kirikköy,Lüleburgaz, Kirklareli N 41^o 28, 239’ E 27^o 14, 581’

66 TR-Suv29 1354 / ? 29 / 4 Bandırma, Balıkesir N 40^o 21’ E 27^o 55’

26

Şekil 3.1. C. suaveolens örneklerinin toplandığı lokaliteler ve tespit edilen haplotiplerin dağılımı (Haplotip no / Harita no).

Tablo 3.2. Bu çalışmada mtDNA analizi yapılan 66 C. suaveolens örneğinden tespit edilen 29 haplotipin ortak baz dizisi.

---

“ATGACCAACATCCGAAAAACACACCCACTAATAAAAATTATTAATAGCTCT TTTATTGACTTACCAGCACCTTCAAACATTTCATCATGATGAAACTTCGGCT CCTTACTAGGAATTTGCCTAATTACCCAAATCTTAACCGGATTATTTTTAGC CATACACTACACATCAGATACTATAACGGCCTTTTCCTCCGTCACACATATC TGCCGAGACGTAAATTATGGTTGACTAATTCGGTATCTTCACGCTAATGGTG CTTCCATATTTTTCATTTGCCTATTCCTCCATGTAGGACGAGGACTTTATTAT GGCTCTTATATATATCTTGAAACATGAAACGTTGGTGTTCTACTCTTATTCGC AGTAATAGCAACAGCC"

--- 3.1.3. Crocidura leucodon (Hermann, 1780)

1780. Sorex leucodon Hermann, In Zimmermann, Geogr. Gesch. Mensch. Vierf.

Thiere, 2: 382.

Tip yeri: Strasbourg çevresi, Bas Rhin, Fransa.

3.1.4. Crocidura leucodon’ a Ait mtDNA Sitokrom b Haplotipleri

Türkiye’ deki 11 değişik lokaliteden toplanan C. leucodon türüne ait 14 örneğin mtDNA cyt b geninin kısmi dizi (381 bç) analizine göre, yedi haplotip tespit edildi (Tablo 3.4 ve Şekil 3.2). Haplotip çeşitliliği (Haplotype Diversity, Hd) 0.8901, nükleotid çeşitliliği (Nucleotide Diversity, Pi, ) 0.00756 olarak bulundu. C. leucodon için haplotip çeşitlilik değerinin 1’ e yakın değerde çıkması, genetik çeşitliliğin nispeten yüksek olduğunu ifade etmektedir. Tespit edilen yedi haplotip için oluşturulan ortak baz dizisi Şekil 3.3’ de verildi.

Tablo 3.3. Bu çalışmada mtDNA analizi yapılan 14 C. leucodon örneğinden tespit edilen 11 haplotipin ortak baz dizisi.

---

"ATGACTAACATCCGAAAAACTCACCCACTAATAAAAATTGTTAATAGTTCT TTTATTGATCTACCAGCCCCCTCCAACATCTCATCATGATGAAATTTTGGCTC CTTACTAGGAATCTGCTTAATTGCACAAATCTTAACAGGACTATTCTTAGCC ATACACTATACATCAGATACTACAACAGCTTTCTCCTCCGTAACACATATTT GCCGAGATGTAAATTACGGCTGACTAATTCGTTACCTCCACGCCAATGGCGC CTCCATATTTTTCATTTGCTTATTTCTTCATGTAGGTCGAGGATTCTACTATG GCTCCTATATATTCCTTGAAACATGAAACATCGGTGTCCTGCTCTTATTTGC AGTTATAGCTACCGCC"

---

28

Tablo 3.4. C. leucodon’ a ait örneklerin lokalite bilgileri ve tespit edilen mtDNA sitokrom b haplotipler.

Sıra No

Cyt b Haplotipleri

Örnek No / Cinsiyet

Haplotip / Harita No Lokaliteler Koordinatlar

1 TR-Leu1 1306 / E 1 / 1 Gelibolu, Çanakkale N 40^o 21’ E 26^o 26’

2 TR-Leu1 614 / E 1 / 2 Kefken, Kandıra, Kocaeli N 41^o 09, 498’ E 30^o 14, 047’

3 TR-Leu2 615 / E 2 / 3 D.Y. Hasanbey Köyü, Kaynaşlı, Düzce N 40^o 46, 284’ E 31^o 20, 753’

4 TR-Leu2 833 / E 2 / 6 Demirciler Mh., Erikli, Samsun N 41^o 21, 385’ E 36^o 42, 277’

5 TR-Leu3 616 / E 3 / 4 D.Y. Hasanbey Köyü, Kaynaşlı, Düzce N 40^o 46, 284’ E 31^o 20, 753’

6 TR-Leu4 913 / D 4 / 9 Çaykara, Trabzon N 40^o 46, 436’ E 40^o 15, 408’

7 TR-Leu4 1287 / E 4 / 11 Arhavi, Artvin N 41^o 22, 303’ E 41^o 20, 505’

8 TR-Leu5 915 / E 5 / 8 Çaykara, Trabzon N 40^o 46, 436’ E 40^o 15, 408’

9 TR-Leu6 921 / E 6 / 12 Atalar Köyü, Şavşat, Artvin N 41^o 20, 615’ E 42^o 21, 125’

10 TR-Leu6 1274 / E 6 / 7 Altındere, Maçka, Trabzon N 40^o 45, 464’ E 39^o 36, 870’

11 TR-Leu6 1276 / E 6 / 10 Yıldız Köyü, Araklı, Trabzon N 40^o 53, 261’ E 40^o 03, 386’

12 TR-Leu6 1289 / E 6 / 13 Dumlu, Erzurum N 40^o 06, 015’ E 41^o 23, 055’

13 TR-Leu7 1228 / E 7 / 5 Dereköy, Nallıhan, Ankara N 40^o 16, 681’ E 31^o 20, 526’

14 TR-Leu7 1229 / E 7 / 5 Dereköy, Nallihan, Ankara N 40^o 16, 681’ E 31^o 20, 526’

Şekil 3.2. C. leucodon örneklerinin toplandığı lokaliteler ve tespit edilen haplotiplerin dağılımı (Haplotip no/ Harita no).

Tablo 3.5. Türkiye’ nin farklı lokalitelerinden toplanmış C. suaveolens ve C. leucodon’

a ait toplam 36 haplotipin baz kompozisyonu.

---

30

3.2. mtDNA Sitokrom b Geninin Kısmi Dizi Analizi

3.2.1. Çalışılan Sitokrom b Gen Bölgesinin Yapısı ve Varyasyonu

Crocidura cinsinin iki türüne ait toplam 36 haplotipe dayanılarak oluşturulan veri setinde bazların oranı ortalama "A: % 29.7, C: % 24.1, G: % 13.4, T(U): % 32.9" olarak bulundu. Örneklere ait kısmi mtDNA cyt b geni dizileri, "A - T" bakımından nispeten zengin olup (% 62.6), "G - C" oranı ise daha düşüktür (% 37.5) (Tablo 3.5).

3.2.2. Bu Çalışmada Tespit Edilen Crocidura Haplotiplerinin Filogenetik Analizleri Bu çalışmada tespit edilen 29 C. suaveolens ve yedi C. leucodon mtDNA cyt b haplotipinin birlikte değerlendirilmesiyle 381 bç uzunluğundaki dizinin, 307 nükleotid bölgesinde benzerlik (monomorfik bölge) tespit edilirken (% 80.57), 74 nükleotid bölgesinde varyasyon (polimorfik bölge) tespit edildi (% 19.43). Bu bölgelerden 63 tanesi parsimonik bilgi içeren bölge (% 85.14), 11 tanesi parsimonik olarak bilgi içermeyen bölgelerdir (% 14.86). Varyasyon tespit edilen bölgelerden 63 adet bölgede transisyona rastlanırken yedi adet bölgede transversiyona rastlanmıştır. Ayrıca 141, 198, 240, 375’ inci baz bölgelerinde C. suaveolen türüne ait haplotiplerde transisyona (141.

ve 198. bölgelerde C’ nin T e, 240. bölgede G’ nin A’ e, 375. bölgede A’ nin G’ e), C.

leucodon’ a ait haplotiplerde transversiyona (141. ve 198. bölgelerde C’ nin A’ e, 240.

bölgede C’ nin ve T’ e, 375. bölgede A’ nin T’ e) rastlanmıştır. Tespit edilen haplotipleri, iki ana soy hattına (I, II, II, IV ve V, VI) ayrılmaktadır. Sorex satunini’ nin dış grup olarak kullanıldığı bu ağaçta büyük ana soy hattı (I, II, II, IV) C. suaveolens’ e, bazaldaki küçük soy hattı (V, VI) ise C. leucodon’ a ait olup her iki soy hattı % 100’ lük bootstrap değerleriyle desteklenmektedir. C. leucodon’ u oluşturan soy hattı içerisinde politomi görülmezken C. suaveolens’ e ait soy hattında (I, II, II, IV) ise politomi görülmektedir. Şekil 3.3 incelendiğinde C. suaveolens’ i oluşturan ana soy hattı içerisindeki I, II, III ve IV numaralı alt soy hatlarının % 100’ lük bootstrap değeriyle desteklenirken I, II ve III % 75 bootstrap değeriyle, I ve II % 100’ lük bir bootstrap değeriyle desteklenmiştir. C. leucodon oluşturan ana soy hattı içerisinde yer alan alt soy

hatları ise (V ve VI) % 100 bootstrap değerleriyle desteklendiği görülmektedir. MP analizi sonucunda olası 229 adet ağaç elde edilmiş olup tutarlılık indeksi (consistency index, CI) 0.709677 ve koruma indeksi (retention index, RI) 0.916279 olarak bulundu.

Haplotipler arasındaki uzaklıklar (Pairwise Distance), yaygın olarak kullanılan Kimura 2 Parametre [49] uzaklık metodu kullanılarak tahmin edildi ve Tablo 3.6’ da verildi. C.

suaveolens haplotipleri arasındaki en küçük genetik uzaklık değeri, 0.003 iken en büyük genetik uzaklık değeri, 0.044’ dir. C. suaveolens haplotipleri arasındaki ortalama genetik uzaklık 0.0235 olarak hesaplandı. C. leucodon haplotipleri arasındaki en küçük genetik uzaklık değeri, 0.003 iken en büyük genetik uzaklık değeri 0.016’ dir. C.

leucodon haplotipleri arasındaki ortalama genetik uzaklık, 0.0095 olarak bulunmuştur.

İki tür arasındaki en küçük genetik uzaklık değeri, 0.144 iken en büyük genetik uzaklık değeri, 0.165 olarak tespit edilmiştir. İki tür arasındaki ortalama genetik uzaklık ise 0.1545 olarak hesaplanmıştır. Sorex satunini’ nin dış grup olarak kullanıldığı Kimura 2 Parametre modeli [49] kullanılarak üretilen Neighbor Joining ağacına (Şekil 3.4) göre % 100 bootstrap değerleriyle desteklenmiş iki ana soy hattı bulunmaktadır. Bu ana soy hatlarından biri C. suaveolens’ e ait olup dört alt soy hattından (I, II, III, IV) oluşmaktadır.

İkinci ana soy hattını oluşturan C. leucodon ise iki alt soy hattından (V, VI) oluşmaktadır. C. leucodon’ a ait olan birinci alt soy hattını doğu (V) Karadeniz Bölgesi’

nden haplotiplerden oluştururken ikinci alt soy hattı ise (VI) Samsun, Ankara, Düzce, Kocaeli ve Çanakkale örneklerinden tespit edilen haplotiplerden oluştu (Tablo 3.4; Şekil 3.4).

MEGA5 [47] programını kullanmak suretiyle 381 bç’ lik veri seti için en uygun baz değişim modeli olarak gamma değerliğiyle birlikte Tamura - Nei (TN93+G) [50]

belirlendi. Ancak hem aynı topolojiye sahip olması hemde en yüksek bootstrap değerleri, gamma değerliğiyle birlikte Tajime - Nei (Tajime - Nei+G) baz değişim modelinde gözlendiğinden bu model NJ ağacının oluşturulmasında kullanıldı (Şekil 3.5). Dış grup olarak Sorex satunini kullanılarak oluşturuldu. NJ ağacı (Şekil 3.5) iki ana soy hattına ayrılmaktadır. Ana soy hatlardan biri C. suaveolens’ e ait haplotiplerin soy hattını diğeri ise C. leucodon haplotiplerinin bulunduğu soy hattını oluşturmuştur.

32

Şekil 3.3. C. suaveolens ve C. leucodon’ a ait mtDNA cyt b dizileri (381 bç) kullanılarak MP metoduyla (Heuristik + Close Neighbor Interchange) üretilen konsensus ağacı (Bootstrap değeleri: >50%) (C. suaveolens:

TR-Suv; C. leucodon: R-Leu).

Şekil 3.4. C. suaveolens ve C. leucodon’ a ait mtDNA cyt b dizileri (381 bç) kullanarak Kimura 2 Parametre metodu ile üretilen Neighbor Joining ağacı (C.

suaveolens: TR-Suv; C. leucodon: TR-Leu).

34

Şekil 3.5. Crocidura haplotiperi arasındaki filogenetik ilişkiyi gösteren en yüksek bootstrap değerini veren Tajime–Nei+G baz değişim modeli kullanılarak üretilen NJ ağacı (C. suaveolens: TR-Suv; C. leucodon: TR-Leu).

---

---36

C. suaveolens ait örneklerin gruplandığı soy hattı kendi içerisinde incelendiğinde % 100 bootstrap değeri gibi yüksek bir değerle Batı Anadolu’ ya ait örnekler (IV) bir grup, Anadolu’nun geri kalan kısımlarındakiler (I, II) ve Trakya’ ya ait haplotipler (III) de ayrı gruplanmıştır. Anadolu’ nun kalan kısımlarındaki haplotipler ve Trakya grubu incelendiğinde ise Trakya’ ya ait haplotipler (III) % 53’ lük bootstrap değeriyle desteklenmektedir. Anadolu’nun geri kalan kısmındaki haplotipler, % 91’ lik bootstrap değeriyle iki ana soy hattına (I ve II) ayrıldığı görülmektedir. C. leucodon’ a ait haplotiplerin bulunduğu soy hattı incelendiğinde kendi içerisinde % 100 bootstrap değeri gibi yüksek bir değer ile iki soy hattına (Doğu Karadeniz (V) ve Kuzeybatı Anadolu (VI) örneklerinin bulunduğu haplotipler) ayrılmıştır (Şekil 3.5).

Filogenetik analizlerde kullanılan Maksimum Likelihood metodu kullanılarak üretilen ağaç ile NJ metoduna göre üretilen ağacın topolojisi hemen hemen aynı olduğundan ve en yüksek bootstrap değerine sahip olduğundan burada NJ ağacı gösterilmiştir.

3.3. Bu Çalışmada Tespit Edilen Haplotipler ile Türkiye ve Yakın Çevresinden Gen Bankası' nda Bulunan Crocidura Cinsine Ait Haplotiplerin Filogenetik Analizi

Bu çalışmada tespit edilen 36 adet haplotip ile Türkiye ve yakın çevresini kapsayan daha önceki çalışmalardan Gen Bankası’ nda depolanmış haplotiplerin bir araya getirilmesiyle iki DNA veri seti oluşturuldu.

Birinci DNA veri seti, bu çalışmada tespit edilen 29 C. suaveolens haplotipi ile Gen Bankası’ nda bulunan Türkiye’ den kaydedilmiş 12 C. suaveolens haplotipinin bir araya getirilmesiyle oluşturuldu. Dizi uzunluğu 351 bç olan 36 haplotip tespit edildi. 351 bç uzunluğuna göre haplotip çeşitliliği (haplotype diversity, Hd) 0.9939 iken nükleotid çeşitliliği (nucleotide diversity, Pi, ) 0.02266 olarak tespit edilmiştir. Yaygın olarak kullanılan K2P uzaklık metoduna göre haplotipler arası genetik uzaklık değerleri, en düşük 0.003, en yüksek 0.051 ve ortalama olarak 0.027 değerinde bulunmuştur. 351 bç uzunluğa göre bu çalışmada tespit edilen TR-Suv6 haplotipi, Gen Bankası’ ndan alınan İstanbul örnekleriyle; TR-Suv2 haplotipi, Karaman örnekleriyle; TR-Suv20 haplotipi, İstanbul ve Kırklareli örnekleriyle ve TR-Suv4 haplotipi ise Bilecik ve Bursa örnekleriyle aynı DNA dizisine sahip olduğu tespit edildi.

Kimura 2 Parametre baz değişim modeli kullanılarak oluşturulan NJ ağacı (Şekil 3.6) incelendiğinde haplotiplerin iki ana soy hattına (I, II ve III) ayrıldığı gözlenmektedir.

Bazal kısımda toplanan C. suaveolens haplotiplerinin (III) Anadolu’ nun batı kısmına ait olduğu belirlenirken diğer soy hattı ise kendi içerisinde dallanarak Trakya (II) ve Anadolu’ nun geri kalan kısımlarına (I) ait haplotipleri içermektedir.

İkinci veri seti ise, bu çalışmada tespit edilen haplotipler ile Türkiye ve yakın çevresini kapsayan daha önceki çalışmalarda bulunan ve Gen Bankası’ nda depolanmış C.

leucodon ve C. suaveolens’ e ait toplam 105 (80 adet C. suaveolens haplotipi, 25 adet C.

leucodon haplotipi) haplotipin bir araya getirilmesiyle oluşturuldu. 252 bç uzunluğuna göre 105 haplotip içerisinde, bazı haplotiplerin aynı olduğu tespit edildi. Aynı diziye sahip haplotipler, Tablo 3.7’ de gösterildi. 252 bç uzunluğuna göre oluşturulan ikinci veri setinin değerlendirilmesi sonucunda 58 haplotip belirlendi ve haplotip çeşitliliği (haplotype diversity, Hd) ise 0.9410 olarak bulundu. Tespit edilen 58 haplotipten oluşturulan veri setinde bazların oranı A % 26.8, G % 15.2, T (U) % 34.2 ve C % 23.8 olarak bulundu. Bu oranlara bakıldığında veri setindeki DNA dizileri, A - T bazları bakımından zengin olup (% 61). G - C bazları bakımından daha düşük (%39) olduğu gözlendi.

Bu çalışmada tespit edilenler ve Gen Bankası’ nda bulunan haplotipler arasındaki filogenetik ilişkileri göstermek için yaygın olarak kullanılan Kimura 2 Parametre baz değişim (K2P) modeli [49] seçilerek NJ ağacı (Şekil 3.7) üretildi. Dış grup olarak Sorex satunini türüne ait dizi kullanılarak üretilen Şekil 3.7’ deki NJ ağacı incelendiğinde, iki ana soy hattı (C. leucodonve C. suaveolens) görülmektedir. Bu soy hatları % 90 ve

Bu çalışmada tespit edilenler ve Gen Bankası’ nda bulunan haplotipler arasındaki filogenetik ilişkileri göstermek için yaygın olarak kullanılan Kimura 2 Parametre baz değişim (K2P) modeli [49] seçilerek NJ ağacı (Şekil 3.7) üretildi. Dış grup olarak Sorex satunini türüne ait dizi kullanılarak üretilen Şekil 3.7’ deki NJ ağacı incelendiğinde, iki ana soy hattı (C. leucodonve C. suaveolens) görülmektedir. Bu soy hatları % 90 ve

Belgede TÜRKİYE' DE YAYILIŞ GÖSTEREN CROCIDURA (SORICOMORPHA: MAMMALIA) CİNSİNİN MİTOKONDRİYAL SİTOKROM B DİZİ ANALİZİ KULLANARAK MOLEKÜLER FİLOGENİSİ (sayfa 28-0)