Doğrudan gen aktarım teknikleri ile bitkilere gen aktarımı

(1)

Doğrudan gen aktarım teknikleri ile bitkilere gen aktarımı

 a. Biyolistik (Partikül Tabancası)a. Biyolistik (Partikül Tabancası)

 b. Mikroenjeksiyonb. Mikroenjeksiyon

 c. Protoplastlara Gen Aktarımıc. Protoplastlara Gen Aktarımı

 i. Kimyasal Yöntemleri. Kimyasal Yöntemler

 ii. Elektroparosyonii. Elektroparosyon

Sebahattin ÖZCAN

(2)

Biyolistik (Partikül Tabancası) Biyolistik (Partikül Tabancası)

 Bu yöntemin esası, yüksek derecede Bu yöntemin esası, yüksek derecede hızlandırılmış

hızlandırılmış mikro-taşıyıcımikro-taşıyıcı adı verilen 1-2 adı verilen 1-2

m çapındaki metal (çoğunlukla altın ya m çapındaki metal (çoğunlukla altın ya da tungsten) partiküller aracılığıyla, bir da tungsten) partiküller aracılığıyla, bir

ateşleme mekanizmasından yararlanılarak ateşleme mekanizmasından yararlanılarak

DNA’nın hedef dokulara aktarılmasıdır DNA’nın hedef dokulara aktarılmasıdır

(3)

Biyolistik (Partikül Tabancası) Biyolistik (Partikül Tabancası)

 Mikro-taşıyıcılar Mikro-taşıyıcılar makro-taşıyıcımakro-taşıyıcı olarak olarak adlandırılan plastik bir silindir üzerinden adlandırılan plastik bir silindir üzerinden

hedef dokulara doğru bir helyum gazı hedef dokulara doğru bir helyum gazı

basncı ile hızlandırılır.

 Ateşleme gerek mikro-taşıyıcıların Ateşleme gerek mikro-taşıyıcıların

sürtünmesinden doğan sürüklenmeyi, sürtünmesinden doğan sürüklenmeyi,

gerekse yüksek basınçlı gaz şokundan gerekse yüksek basınçlı gaz şokundan

doğabilecek hücre parçalanmasını ve sesi doğabilecek hücre parçalanmasını ve sesi

engellemek için vakum altında yapılır.

(4)

Biyolistik yönteminde gen aktarım Biyolistik yönteminde gen aktarım

frekansını etkileyen faktörler frekansını etkileyen faktörler

 Partikül hızlandırmada kullanılan helyum gazının basıncı: Gaz Partikül hızlandırmada kullanılan helyum gazının basıncı: Gaz hızlandırma tüpündeki helyum basıncı, mikro-partiküllerin hızının hızlandırma tüpündeki helyum basıncı, mikro-partiküllerin hızının belirlenmesinde etkilidir. Partikülü hızlandırmak amacıyla,

belirlenmesinde etkilidir. Partikülü hızlandırmak amacıyla,

kullanılan dokunun özelliğine bağlı olarak 450 ile 2200 psi basınç kullanılan dokunun özelliğine bağlı olarak 450 ile 2200 psi basınç uygulanır. Ancak, çoğu hücre tipi için optimal basınç 1000 psi uygulanır. Ancak, çoğu hücre tipi için optimal basınç 1000 psi olarak belirlenmiştir. Bu değerden daha yüksek basınçlarda olarak belirlenmiştir. Bu değerden daha yüksek basınçlarda

hücrelerde yaralanma düzeyi artar ve gen aktarım frekansı düşer.

 Mikro-taşıyıcının boyutu, tipi ve sayısı: Tungsten partiküllerin Mikro-taşıyıcının boyutu, tipi ve sayısı: Tungsten partiküllerin ortalama çapları 0.5-2.0

ortalama çapları 0.5-2.0 m olup, optimum boyut hedef hücrelerin m olup, optimum boyut hedef hücrelerin çapı ile ilişkilidir. Ancak 1.0

çapı ile ilişkilidir. Ancak 1.0 mm çaplı partiküllerin, başarılı geçici çaplı partiküllerin, başarılı geçici ve stabil transformasyonlar için uygun olduğu saptanmıştır.

ve stabil transformasyonlar için uygun olduğu saptanmıştır.

Tungsten partiküllerinin kullanımının dezavantajları; düzensiz Tungsten partiküllerinin kullanımının dezavantajları; düzensiz şekil ve boyutta olmaları, belli hücre tipleri için toksik etki

şekil ve boyutta olmaları, belli hücre tipleri için toksik etki göstermeleri ve DNA çökelmesi ile sonuçlanabilecek yüzey göstermeleri ve DNA çökelmesi ile sonuçlanabilecek yüzey oksidasyonuna neden olmalarıdır. Uniform boyutta olan (1-3

oksidasyonuna neden olmalarıdır. Uniform boyutta olan (1-3 m) m) altın partikülleri ise tungstenden daha pahalı olmalarına karşın altın partikülleri ise tungstenden daha pahalı olmalarına karşın daha az toksik etkiye sahiplerdir.

daha az toksik etkiye sahiplerdir.

(5)

Biyolistik yönteminde gen aktarım Biyolistik yönteminde gen aktarım

frekansını etkileyen faktörler frekansını etkileyen faktörler

 Makro-taşıyıcı ile hedef doku arasındaki Makro-taşıyıcı ile hedef doku arasındaki

uzaklık: Maksimum etkinlikte transformasyon uzaklık: Maksimum etkinlikte transformasyon elde etmek için makro-taşıyıcı ile hedef doku elde etmek için makro-taşıyıcı ile hedef doku arasındaki uzaklık (uçuş mesafesi) önemli bir arasındaki uzaklık (uçuş mesafesi) önemli bir parametredir. Her hücre tipi için bu mesafenin parametredir. Her hücre tipi için bu mesafenin

deneme yoluyla belirlenmesi gerekmekle deneme yoluyla belirlenmesi gerekmekle

birlikte, pek çok örnekte 10 mm’lik uçuş birlikte, pek çok örnekte 10 mm’lik uçuş

mesafesi kullanılarak yüksek transformasyon mesafesi kullanılarak yüksek transformasyon

frekansı elde edilmiştir.

 DNA’nın mikro-taşıyıcı partiküllere yapışması DNA’nın mikro-taşıyıcı partiküllere yapışması için kullanılan spermidin ve CaCl

için kullanılan spermidin ve CaCl₂₂’ün ’ün konsantrasyonu.

konsantrasyonu.

(6)

Biyolistik yönteminin başlıca Biyolistik yönteminin başlıca

üstünlükleri üstünlükleri

 Kullanım kolaylığı,Kullanım kolaylığı,

 Her ateşlemede mikro-taşıyıcıların birden fazla Her ateşlemede mikro-taşıyıcıların birden fazla hücreye ulaşabilmesi,

hücreye ulaşabilmesi,

 Mikro-taşıyıcılara bağlı genlerin biyolojik Mikro-taşıyıcılara bağlı genlerin biyolojik aktivitelerinin bozulmaması,

aktivitelerinin bozulmaması,

 Polen, hücre kültürleri, bitki organları, Polen, hücre kültürleri, bitki organları,

meristemler, kallus, olgunlaşmamış embriyo, meristemler, kallus, olgunlaşmamış embriyo,

olgun embriyo parçaları, yaprak parçaları, olgun embriyo parçaları, yaprak parçaları,

mikrosporlar gibi çeşitli hedef dokulara mikrosporlar gibi çeşitli hedef dokulara

uygulanabilmesi, uygulanabilmesi,

 Mikro-taşıyıcıların derin hücre katmanlarına Mikro-taşıyıcıların derin hücre katmanlarına ulaşabilmesidir.

ulaşabilmesidir.

(7)

Bio-Rad, Arı 2002 (Ed: Özcan Vd.)

(8)

Ye vd. 1997, Arı 2002 (Ed: Özcan Vd.)

(9)

Mikroenjeksiyon Mikroenjeksiyon

 Doğrudan gen aktarımı yöntemleri arasında en Doğrudan gen aktarımı yöntemleri arasında en kesin biçimde hücrenin istenilen bölmesine

kesin biçimde hücrenin istenilen bölmesine DNA’nın enjekte edilmesini sağlayan mikro- DNA’nın enjekte edilmesini sağlayan mikro-

enjeksiyon, kapiller mikropipetler yardımıyla ve enjeksiyon, kapiller mikropipetler yardımıyla ve

mikroskop altında gerçekleştirilir.

 Mikro-enjeksiyonla protoplastlara, izole edilmiş Mikro-enjeksiyonla protoplastlara, izole edilmiş hücrelere, kallus, meristemler, zigotik ve

hücrelere, kallus, meristemler, zigotik ve

mikrospor türevli proembriyolar gibi çok hücreli mikrospor türevli proembriyolar gibi çok hücreli

dokulara DNA aktarımı mümkündür.

(10)

Mikroenjeksiyon Mikroenjeksiyon

 Alıcı hücreler veya dokular sodyum alginat, Alıcı hücreler veya dokular sodyum alginat, agaroz veya poli-L-lisin ile ya da kapiler

agaroz veya poli-L-lisin ile ya da kapiler sistem kullanılarak sabitlenir.

sistem kullanılarak sabitlenir.

 DNA mikromanipülatör sistemine bağlı DNA mikromanipülatör sistemine bağlı

kapiler bir mikropipet aracılığı ile doğrudan kapiler bir mikropipet aracılığı ile doğrudan

hücrenin çekirdeğine aktarılır.

(11)

Mikroenjeksiyon yönteminin Mikroenjeksiyon yönteminin

avantajları avantajları

 Aktarılan DNA’nın miktarı optimize edilebilir.Aktarılan DNA’nın miktarı optimize edilebilir.

 İstenilen hücreye DNA aktarılabilir.İstenilen hücreye DNA aktarılabilir.

 İstenilen hücre kısmına DNA aktarımı görsel İstenilen hücre kısmına DNA aktarımı görsel olarak kontrol edilebilir.

olarak kontrol edilebilir.

 Mikrosporlar ya da birkaç hücreli proembriyolar Mikrosporlar ya da birkaç hücreli proembriyolar gibi küçük boyutlu hedef dokular kullanılabilir.

gibi küçük boyutlu hedef dokular kullanılabilir.

 Zigotik embriyo kültürü ve mikro-enjeksiyon Zigotik embriyo kültürü ve mikro-enjeksiyon yöntemleri birlikte kullanılarak her bitki türüne yöntemleri birlikte kullanılarak her bitki türüne

gen aktarımı yapabilmek mümkün olabilir.

(12)

Glick ve Pasternak 1994, Arı 2002 (Ed: Özcan Vd.)

(13)

Protoplastlara Gen Aktarımı Protoplastlara Gen Aktarımı

 Enzimatik yollarla hücre duvarları uzaklaştırılmış Enzimatik yollarla hücre duvarları uzaklaştırılmış bitki hücreleri, yani protoplastlar hücre

bitki hücreleri, yani protoplastlar hücre süspansiyon kültürü, kallus kültürü ve süspansiyon kültürü, kallus kültürü ve

farklılaşmış bitki dokularından izole edilebilir farklılaşmış bitki dokularından izole edilebilir

 Kimyasal maddeler yardımıyla veya membran Kimyasal maddeler yardımıyla veya membran geçirgenliğinin elektrik akımı ile değiştirilmesi geçirgenliğinin elektrik akımı ile değiştirilmesi

(elektroporasyon) sonucunda protoplastlar gen (elektroporasyon) sonucunda protoplastlar gen

aktarımında kullanılabilmektedir.

(14)

Protoplastların ideal eksplant olarak Protoplastların ideal eksplant olarak

kullanılmalarının nedenleri kullanılmalarının nedenleri

 Hücre zarı ile çevrili olduklarından deneysel olarak Hücre zarı ile çevrili olduklarından deneysel olarak

belirlenmiş konsantrasyonlardaki DNA’yı içlerine almaları belirlenmiş konsantrasyonlardaki DNA’yı içlerine almaları

kolaydır.

 Enzimatik veya mekanik yolla yapılan izolasyon işlemleri Enzimatik veya mekanik yolla yapılan izolasyon işlemleri aynı zamanda hücre yaralanmalarını artırmakta, bu

aynı zamanda hücre yaralanmalarını artırmakta, bu

durum hücrelerin rejenerasyon yeteneğini ve entegratif durum hücrelerin rejenerasyon yeteneğini ve entegratif

transformasyonu teşvik edebilmektedir.

 Hücrelerin DNA molekülleri ile teması kolay olduğundan Hücrelerin DNA molekülleri ile teması kolay olduğundan transgenik bitki elde etme şansı fazladır.

transgenik bitki elde etme şansı fazladır.

 Gen transferi için biyolojik vektör kullanılmadığından Gen transferi için biyolojik vektör kullanılmadığından

DNA’nın hücre içine alınması fiziksel bir süreçtir ve bu da DNA’nın hücre içine alınması fiziksel bir süreçtir ve bu da

konukçu sınırı engelini ortadan kaldırmaktadır.

(15)

Kimyasal yöntemlerle protoplastlara Kimyasal yöntemlerle protoplastlara

gen aktarımı gen aktarımı

 Polietilen glikol (PEG), polivinil alkol veya kalsiyum fosfat Polietilen glikol (PEG), polivinil alkol veya kalsiyum fosfat gibi kimyasal maddelerle protoplastların hücre zarlarının gibi kimyasal maddelerle protoplastların hücre zarlarının

geçirgenlikleri geri dönüşümlü olarak artırılabilir.

 Genetik transformasyon için protoplastlar, DNA ve Genetik transformasyon için protoplastlar, DNA ve kimyasal maddeler ile birlikte inkübe edilir.

kimyasal maddeler ile birlikte inkübe edilir.

 Bitki türü, kültür koşulları, protoplast kaynağı ve Bitki türü, kültür koşulları, protoplast kaynağı ve izolasyon için kullanılan yöntemlerin yanısıra, izolasyon için kullanılan yöntemlerin yanısıra,

transformasyon için kullanılan tampon ve katyonla, transformasyon için kullanılan tampon ve katyonla,

taşıyıcı DNA’nın varlığı ve konsantrasyonu, plazmid ve taşıyıcı DNA’nın varlığı ve konsantrasyonu, plazmid ve

taşıyıcı DNA formu, hücre döngüsü, PEG gibi gen taşıyıcı DNA formu, hücre döngüsü, PEG gibi gen

aktarımına yardımcı kimyasal maddelerin aktarımına yardımcı kimyasal maddelerin

konsantrasyonu kimyasal yöntemlerle protoplastlara gen konsantrasyonu kimyasal yöntemlerle protoplastlara gen

aktarımını önemli ölçüde etkilemektedir.

(16)

Elektroporasyon ile Elektroporasyon ile

protoplastlara gen aktarımı protoplastlara gen aktarımı

 Süspansiyon halindeki protoplastlara yüksek Süspansiyon halindeki protoplastlara yüksek voltajlı elektrik akımı uygulandığında hücre voltajlı elektrik akımı uygulandığında hücre

zarının geçirgenliği geri dönüşümlü olarak artar zarının geçirgenliği geri dönüşümlü olarak artar

ve mikroporlar oluşur.

 Elektroporasyon sırasında protoplastların Elektroporasyon sırasında protoplastların

bulunduğu solüsyonda DNA da bulunduğundan bulunduğu solüsyonda DNA da bulunduğundan

membranda açılan porlardan DNA hücre içine membranda açılan porlardan DNA hücre içine

girer porlar kapanarak hücrenin bütünlüğü girer porlar kapanarak hücrenin bütünlüğü

sağlanır.

(17)

Elektroporasyon ile Elektroporasyon ile

protoplastlara gen aktarımı protoplastlara gen aktarımı

 Elektroporasyonda elektrik akımı hücre canlılığına zarar Elektroporasyonda elektrik akımı hücre canlılığına zarar vermeyecek şiddette seçilmelidir. Bu kritik noktanın

vermeyecek şiddette seçilmelidir. Bu kritik noktanın üzerine çıkıldığında hücre zarları tamamen

üzerine çıkıldığında hücre zarları tamamen

parçalanabilir, altındaki akım şiddetlerinde ise por parçalanabilir, altındaki akım şiddetlerinde ise por

oluşumu gerçekleşmeyebilir.

 Genellikle kullanılan elektroporasyon sistemleri ya düşük Genellikle kullanılan elektroporasyon sistemleri ya düşük voltaj/uzun süreli elektrik akımı (pulse), ya da yüksek

voltaj/uzun süreli elektrik akımı (pulse), ya da yüksek voltaj/kısa süreli elektrik akımı şeklindedir.

voltaj/kısa süreli elektrik akımı şeklindedir.

 Tütün mezofil hücreleri için tipik değerler düşük Tütün mezofil hücreleri için tipik değerler düşük voltaj/uzun akım için 300-400 V/cm ve 10-50

voltaj/uzun akım için 300-400 V/cm ve 10-50 s, yüksek s, yüksek voltaj/kısa akım için ise 1.000-15.000 V/cm ve 10

voltaj/kısa akım için ise 1.000-15.000 V/cm ve 10 s’dir. s’dir.

(18)

Elektroporasyon ile Elektroporasyon ile

protoplastlara gen aktarımı protoplastlara gen aktarımı

 Elektroporasyon ile gen aktarım frekansı Elektroporasyon ile gen aktarım frekansı plazmid konsantrasyonu, elektriksel

plazmid konsantrasyonu, elektriksel

koşullar, protoplast boyutu ve yoğunluğu koşullar, protoplast boyutu ve yoğunluğu

ile protoplastların fizyolojik özelliklerine ile protoplastların fizyolojik özelliklerine

bağlıdır. Düşük voltaj/uzun akım genellikle bağlıdır. Düşük voltaj/uzun akım genellikle

geçici gen ifadesine, yüksek voltaj/kısa geçici gen ifadesine, yüksek voltaj/kısa

akım ise yüksek düzeyde stabil akım ise yüksek düzeyde stabil

entegrasyona neden olmaktadır.

(19)

(20)

Gen aktarımında yaygın olarak kullanılan yöntemlerin karşılaştırılması.

Yöntem Avantajları Dezavantajları

Agrobacterium 1.Yüksek derece etkinlik 2.Uzun DNA dizilerinin aktarılabilmesi

3.Çoğunlukla tek ya da az sayıda T-DNA entegrasyonu 4.Uygulama için özel bir donanıma ihtiyaç olmaması

1.Sınırlı konukçu alanı

2.Genetik bilginin sadece T-DNA aracılığıyla aktarımı

•Kimyasal Yöntemler ve Elektroporasyon

1.Basit kullanım

2.Tek denemede birçok örneğe uygulanabilirlik 3.Kimyasal yöntemler için özel bir donanıma ihtiyaç duyulmaması

1.Aktarılan DNA’da yüksek derecede yeni düzenlemeler

görülmesi ve çok sayıda kopyanın entegrasyonu

2.Kimyasal yöntemlerde

transgenik bitki üretimi için protoplast kültürü ve

rejenerasyon sistemlerinin kurulması

3.Somoklonal varyasyonda artış Mikro-enjeksiyon 1.Genotipten bağımsız olarak

kullanım

2.Çok çeşitli hedef hücre ve dokulara uygulanabilirlik 3.Uygulamada görsel kontrol olanağı

1.Kompleks ve pahalı donanım gereksinimi

2.Başarı için deneyim gerekliliği

Biyolistik 1.Genotipten bağımsız kullanım

2.Farklı hedef hücre ve dokulara uygulanabilirlik 3.Transgenik tahıl elde

etmek için güçlü bir yöntem olması

1.Kompleks ve pahalı donanım gereksinimi

2.Aktarılan DNA’da yüksek derecede yeni düzenlemeler

görülmesi ve çok sayıda kopyanın integrasyonu.