Agrobacterium tumefaciens aracılığıyla bitkilere gen aktarımı

(1)

Agrobacterium tumefaciens

aracılığıyla bitkilere gen aktarımı

Sebahattin ÖZCAN

Bu bölümdeki tüm bilgiler Özcan vd. 2002’den alınmıştır ^.

(2)

Ti Plazmidlerinin Bitkilere Gen Ti Plazmidlerinin Bitkilere Gen

Aktarımında Kullanılması Aktarımında Kullanılması

 Daha önce de belirtildigi gibi, gen aktarımı için T- Daha önce de belirtildigi gibi, gen aktarımı için T- DNA’nın sağ sınır nükleotid dizisi ile

DNA’nın sağ sınır nükleotid dizisi ile vir vir ve ve chv chv genleri mutlak gereklidir.

genleri mutlak gereklidir.

 Öte yandan, T-DNA bölgesinde bulunan ve opin Öte yandan, T-DNA bölgesinde bulunan ve opin sentezini sağlayan genler ile tümör oluşumuna sentezini sağlayan genler ile tümör oluşumuna

neden olan

neden olan onc onc genlerinin T-DNA’nın genlerinin T-DNA’nın aktarımında işlevleri bulunmamaktadır.

aktarımında işlevleri bulunmamaktadır.

 Bu genlerin T-DNA bölgesinden kesici enzimler Bu genlerin T-DNA bölgesinden kesici enzimler ile çıkartılarak yerlerine yabancı genlerin

ile çıkartılarak yerlerine yabancı genlerin klonlanmasının gen aktarımını kesinlikle klonlanmasının gen aktarımını kesinlikle

etkilemediği görülmüştür.

(3)

Ti Plazmidlerinin Bitkilere Gen Ti Plazmidlerinin Bitkilere Gen

Aktarımında Kullanılması Aktarımında Kullanılması

 T-DNA aktarımı, son derece düşük oranda T-DNA aktarımı, son derece düşük oranda gerçekleştiği için gen aktarılmış hücrelerin ve gerçekleştiği için gen aktarılmış hücrelerin ve

dolayısıyla transgenik bitkilerin normallerinden dolayısıyla transgenik bitkilerin normallerinden ayrılması hemen hemen imkansız olmaktadır.

ayrılması hemen hemen imkansız olmaktadır.

 Gen aktarılmış hücrelerin ve bunlardan gelişen Gen aktarılmış hücrelerin ve bunlardan gelişen sürgünlerin seçimi için seçici işaret (markör)

sürgünlerin seçimi için seçici işaret (markör) genleri geliştirilmiştir.

genleri geliştirilmiştir.

 Bu markör genler, bitki hücre ve dokularına bazı Bu markör genler, bitki hücre ve dokularına bazı antibiyotik veya herbisitlere karşı dayanıklılık

antibiyotik veya herbisitlere karşı dayanıklılık kazandırmaktadırlar.

kazandırmaktadırlar.

(4)

Ti Plazmidlerinin Bitkilere Gen Ti Plazmidlerinin Bitkilere Gen

Aktarımında Kullanılması Aktarımında Kullanılması

 Antibiyotik ya da herbisitlerin bulunduğu doku Antibiyotik ya da herbisitlerin bulunduğu doku kültürü ortamlarında, normal bitki hücreleri

kültürü ortamlarında, normal bitki hücreleri antibiyotik ve herbisitlere karşı duyarlı

antibiyotik ve herbisitlere karşı duyarlı

olmasından dolayı gelişememekte, sadece olmasından dolayı gelişememekte, sadece

seçici işaret genlerinin aktarıldığı bitki hücreleri seçici işaret genlerinin aktarıldığı bitki hücreleri

gelişip çoğalabilmektedir.

 Dolayısıyla, gen aktarımı son derece düşük Dolayısıyla, gen aktarımı son derece düşük

frekansta gerçekleşse dahi, gen aktarımı yapılan frekansta gerçekleşse dahi, gen aktarımı yapılan

hücre ve dokulardan transgenik bitkiler elde hücre ve dokulardan transgenik bitkiler elde

edilebilmektedir.

(5)

İşaret (Markör) genleri İşaret (Markör) genleri

 Seçici yapıdaki işaret genleri çoğunlukla Seçici yapıdaki işaret genleri çoğunlukla bakteriyel kökenli olup, bunlar T-DNA

bakteriyel kökenli olup, bunlar T-DNA

bölgesinden veya diğer kaynaklardan elde bölgesinden veya diğer kaynaklardan elde

edilen promotor ve terminatör baz dizileri edilen promotor ve terminatör baz dizileri

arasına yerleştirilerek bitkilerde arasına yerleştirilerek bitkilerde fonksiyonel duruma getirilmiştir.

fonksiyonel duruma getirilmiştir.

 En yaygın kullanılan promotor bölgesi ise En yaygın kullanılan promotor bölgesi ise karnıbahar mozaik virüsünden izole edilen karnıbahar mozaik virüsünden izole edilen

konstitütif CaMV 35S promotorudur.

(6)

İşaret Geni Kodladığı Enzim Dayanıklılık Antibiyotik

NptII Neomisin fosfotransferaz Kanamisin Neomisin Hpt veya aph

IV Higromisin

fosfotransferaz Higromisin Herbisit

Bar Fosfinotrisin asetil

transferaz Fosfinotrisin

Aro A 5-fenolpirüvilşikimat-3-

fosfat sentaz Glifosat

Raportör Gen

Gfp Yeşil floresan proteini

Gus -glukuronidaz

Npt II Neomisin fosfotransferaz

Luc Lusiferaz

(7)

Gen Aktarımında Kullanılan Seçici İşaret Genleri

Marker gene Origin Enzyme encoded Substrate

Neomycin Phospho- transferase (NPT) gene II

Tn5

(E. coli) Neomycin Phosp-

hotransferase II Kanamycin, Neomycin, G418 Neomycin Phospho-

transferase (NPT) gene I

Tn601

(E. coli) Neomycin Phosp-

hotransferase I Kanamycin, Neomycin, G418 Hygromycin Phospho-

transferase (HPT) gene

E. coli Hygromycin

Phosphotrans- ferase Hygromycin B

Mutated mouse dihydrofolate

reductase (DHFR) gene

Mouse Dihydrofolate

reductase Methotrexate

Bacterial dihydrofolate

reductase (DHER) gene Plasmid R6

(E. coli) Dihydrofolate

reductase Methotrexate

aroA gene Salmonella

typhimurium EPSP synthase Glphosate

bar gene Streptomyces

hygroscopicus Phosphinothricin

acetyltransferase Phosphinotricin bialaphos

Octopine synthase

gene (ocs)* T-DNA Octopine

synthase Toxic opine

precursor analogues Bleomycin resistance

gene Tn5

(E. coli) Bleomycin Bleomycin Streptomycin phospho-

transferase gene Tn5

(E. coli) Streptomycin

phosphotrans-ferase Streptomycin Sulfonamide resistance

gene Plasmid R46

(E. coli) Mutated dihyd-

dropteroate synthase Sulfonamides

(8)

Vektör (Plazmid) Sistemleri Vektör (Plazmid) Sistemleri

 Tarımsal özelliklerini iyileştirmek amacıyla Tarımsal özelliklerini iyileştirmek amacıyla

bitkilere aktarılmak istenen gen ya da genler ile bitkilere aktarılmak istenen gen ya da genler ile

işaret genlerinin doğrudan Ti plazmidlerinin T- işaret genlerinin doğrudan Ti plazmidlerinin T-

DNA bölgesine klonlanması pratikte pek DNA bölgesine klonlanması pratikte pek

mümkün olmamaktadır.

 Bu durum, Ti plazmidlerinin büyüklüklerinden ve Bu durum, Ti plazmidlerinin büyüklüklerinden ve düşük kopya sayılarından kaynaklanmaktadır.

düşük kopya sayılarından kaynaklanmaktadır.

 Karşılaşılan bu sorunu aşmak için “ Karşılaşılan bu sorunu aşmak için “ ko-entegratif ko-entegratif ” ” ve “ ve “ binari binari ” (ikili) vektör sistemleri geliştirilmiştir. ” (ikili) vektör sistemleri geliştirilmiştir.

 Bu vektörler hem Bu vektörler hem E. coli E. coli , hem , hem Agrobacterium Agrobacterium ve ve hem de bitkide fonksiyonel olacak şekilde

hem de bitkide fonksiyonel olacak şekilde tasarlanmıştır.

tasarlanmıştır.

(9)

Ko-entegratif (

Ko-entegratif ( cis cis ) vektörler ) vektörler

 Ko-entegratif vektör Ko-entegratif vektör (plazmid) sisteminde, (plazmid) sisteminde, sınır bölgeleri kalacak sınır bölgeleri kalacak

şekilde Ti plazmidinin T- şekilde Ti plazmidinin T-

DNA bölgesinin büyük DNA bölgesinin büyük

bölümü çıkartılarak (bu bölümü çıkartılarak (bu vektöre alıcı vektör adı vektöre alıcı vektör adı

verilmektedir) yerine, verilmektedir) yerine,

küçük bir

küçük bir E. coli E. coli

klonlama plazmidine klonlama plazmidine

(aracı) homolog yapıda (aracı) homolog yapıda

bir DNA parçası bir DNA parçası

yerleştirilmektedir.

(10)

Ko-entegratif (

Ko-entegratif ( cis cis ) vektörler ) vektörler

 Aracı vektörlerin önemli bir kısmı Aracı vektörlerin önemli bir kısmı E. E.

coli coli ’nin ColE1 plazmidinden ’nin ColE1 plazmidinden türetilmiştir.

türetilmiştir.

 Bu aracı plazmid sadece Bu aracı plazmid sadece E. coli E. coli

içerisinde replike olabilme yeteneğine içerisinde replike olabilme yeteneğine

sahip olup,

sahip olup, Agrobacterium Agrobacterium içerisinde içerisinde replike olmaması gerekmektedir.

replike olmaması gerekmektedir.

 Bitkilere aktarılacak genler, işaret Bitkilere aktarılacak genler, işaret geni ile birlikte önce bu aracı

geni ile birlikte önce bu aracı plazmidlere

plazmidlere E. coli içerisinde E. coli içerisinde klonlanırlar. Daha sonra aracı klonlanırlar. Daha sonra aracı

plazmidler, alıcı (reseptör) vektörün plazmidler, alıcı (reseptör) vektörün

bulunduğu

bulunduğu A. tumefaciens A. tumefaciens ’e ’e aktarıldıklarında, tek homolog aktarıldıklarında, tek homolog

rekombinasyon ile Ti plazmidinin T- rekombinasyon ile Ti plazmidinin T-

DNA bölgesine entegre olurlar.

(11)

Ko-entegratif (

Ko-entegratif ( cis cis ) vektörler ) vektörler

Standart aracı vektörlerin özellikleri Standart aracı vektörlerin özellikleri

 Bitkilere aktarılmak istenen genlerin Bitkilere aktarılmak istenen genlerin kolayca klonlanabileceği klonlama kolayca klonlanabileceği klonlama

bölgesi.

 E. coli E. coli ve Agrobacterium ve Agrobacterium ’da aktif olan ’da aktif olan seçici bakteriyel işaret geni.

seçici bakteriyel işaret geni.

 Bitkide işlev yapabilen seçici işaret Bitkide işlev yapabilen seçici işaret geni.

geni.

 E. coli E. coli içerisinde fonksiyonel olan, içerisinde fonksiyonel olan, ancak

ancak Agrobacterium Agrobacterium’da etkili ’da etkili olmayan bir replikasyon orijini.

olmayan bir replikasyon orijini.

(12)

(13)

İkili (binari/

İkili (binari/ trans trans ) vektörler ) vektörler

 Vir Vir bölgesinin bölgesinin trans trans -hareket özelliğinden -hareket özelliğinden yararlanarak ikili

yararlanarak ikili (binari) vektörler (binari) vektörler geliştirilmiştir.

geliştirilmiştir.

 İkili vektör sistemi, İkili vektör sistemi, Agrobacterium Agrobacterium

içerisinde birbirinden bağımsız olarak içerisinde birbirinden bağımsız olarak

replike olan iki plazmidten oluşmaktadır.

(14)

İkili (binari/

İkili (binari/ trans trans ) vektörler ) vektörler

 Bunlardan ilki; T-DNA Bunlardan ilki; T-DNA bölgesinin tamamının bölgesinin tamamının

çıkartıldığı ve çıkartıldığı ve

yalnızca

yalnızca vir vir bölgesini bölgesini

taşıyan Ti plazmidi

( ( vir vir helper), helper),

(15)

İkili (binari/

İkili (binari/ trans trans ) vektörler ) vektörler

 diğeri ise T-DNA sınır diğeri ise T-DNA sınır

bölgeleri içersinde bitkilere bölgeleri içersinde bitkilere aktarılmak istenen genleri aktarılmak istenen genleri taşıyan, maniplasyonu kolay taşıyan, maniplasyonu kolay olan, küçük ve hareketli bir olan, küçük ve hareketli bir (ikili) plazmidtir.

(ikili) plazmidtir.

 T-DNA bölgesi çıkartılan T-DNA bölgesi çıkartılan yardımcı Ti plazmidinde yardımcı Ti plazmidinde bulunan

bulunan vir vir genleri, genleri, trans trans - -

hareket özellikleri sayesinde hareket özellikleri sayesinde ikili vektörde bulunan T-DNA ikili vektörde bulunan T-DNA bölgesini bitki hücrelerine

bölgesini bitki hücrelerine aktarmaktadırlar.

aktarmaktadırlar.

(16)

İkili (binari/

İkili (binari/ trans trans ) vektörler ) vektörler

Bir ikili vektörde bulunan standart özellikler;



T-DNA içerisinde bulunan ve T-DNA içerisinde bulunan ve

bitkilere aktarılmak istenen genlerin bitkilere aktarılmak istenen genlerin kolaylıkla klonlanabileceği bir

kolaylıkla klonlanabileceği bir klonlama bölgesi.

klonlama bölgesi.



Hem E. coli Hem E. coli, hem de , hem de Agrobacterium

Agrobacterium’da fonksiyonel olan ’da fonksiyonel olan replikasyon orijini (örnek: RK2).

replikasyon orijini (örnek: RK2).



E. coli ve E. coli ve Agrobacterium Agrobacterium’da aktif ’da aktif olan seçici bakteriyel işaret geni.

olan seçici bakteriyel işaret geni.



Bitkide işlev yapabilen seçici işaret Bitkide işlev yapabilen seçici işaret geni.

geni.



İkili vektörün konjugasyonla İkili vektörün konjugasyonla Agrobacterium

Agrobacterium’a aktarımı için gerekli ’a aktarımı için gerekli olan transfer fonksiyonları (örnek:

olan transfer fonksiyonları (örnek:

oriV, oriT ve trfA doğrudan DNA oriV, oriT ve trfA doğrudan DNA aktarımında gerekli değildirler).

aktarımında gerekli değildirler).



T-DNA sınır bölgeleri (sadece sağ T-DNA sınır bölgeleri (sadece sağ sınır yeterli olabilir).

sınır yeterli olabilir).

(17)

(18)

(19)

A. A. t t umefaciens umefaciens ile ile b b itkilere gen itkilere gen aktarımı

aktarımı

 A. tumefaciens A. tumefaciens transgenik bitkilerin üretiminde kullanılan transgenik bitkilerin üretiminde kullanılan en yaygın araç olma özelliğini halen korumaktadır.

en yaygın araç olma özelliğini halen korumaktadır.

 Bu bakteri aracılığıyla her çeşit bitki hücresine gen Bu bakteri aracılığıyla her çeşit bitki hücresine gen

aktarmak mümkün iken, gen aktarılan hücre oranı son aktarmak mümkün iken, gen aktarılan hücre oranı son derece düşüktür.

derece düşüktür.

 Bu nedenle, çok sayıda gen aktarımı yapılmayan hücre Bu nedenle, çok sayıda gen aktarımı yapılmayan hücre içerisinden gen aktarımı yapılan hücrelerin belirlenerek içerisinden gen aktarımı yapılan hücrelerin belirlenerek seçilmesi gerekmektedir.

seçilmesi gerekmektedir.

 Gen aktarımının başarısını en fazla etkileyen faktör ise Gen aktarımının başarısını en fazla etkileyen faktör ise gen aktarımı yapılan hücrelerin rejenerasyon

gen aktarımı yapılan hücrelerin rejenerasyon kabiliyetidir.

kabiliyetidir.

(20)

A. A. t t umefaciens umefaciens ile ile b b itkilere gen itkilere gen aktarımı

aktarımı

 Ancak, bitki dokularındaki hücrelerin son derece Ancak, bitki dokularındaki hücrelerin son derece az bir bölümü hem gen aktarımı hem de

az bir bölümü hem gen aktarımı hem de rejenerasyon yeteneğine sahiptirler.

rejenerasyon yeteneğine sahiptirler.

 Bundan dolayı, tarımsal öneme sahip olan Bundan dolayı, tarımsal öneme sahip olan

genleri bitkilere aktarabilmek için, bitki doku ve genleri bitkilere aktarabilmek için, bitki doku ve hücrelerinden etkili rejenerasyon yöntemlerinin hücrelerinden etkili rejenerasyon yöntemlerinin

geliştirilmesi büyük önem taşımaktadır geliştirilmesi büyük önem taşımaktadır . .

 Agrobacterium Agrobacterium aracılığıyla yüksek oranda bir aracılığıyla yüksek oranda bir

gen aktarımı için gerekli olan koşulları şu şekilde gen aktarımı için gerekli olan koşulları şu şekilde

sıralamak mümkündür

sıralamak mümkündür ; ;

(21)

G G en aktarımı için gerekli olan en aktarımı için gerekli olan koşullar

koşullar

 Gen aktarımı için uygun gelişme safhasındaki eksplant Gen aktarımı için uygun gelişme safhasındaki eksplant devamlı olarak sağlanmalıdır.

devamlı olarak sağlanmalıdır.

 Tür içerisindeki farklı çeşitlerde başarılı olmalıdır. Tür içerisindeki farklı çeşitlerde başarılı olmalıdır.

Geliştirilen gen aktarım tekniği, kültürü yapılan yüksek Geliştirilen gen aktarım tekniği, kültürü yapılan yüksek

verimli çeşitlerde başarılı olmadıkça hiç bir önemi verimli çeşitlerde başarılı olmadıkça hiç bir önemi

yoktur.

 Çok sayıda bireysel transgenik bitki elde edebilmek için Çok sayıda bireysel transgenik bitki elde edebilmek için yöntem etkili, ekonomik ve tekrarlanabilir olmalıdır.

yöntem etkili, ekonomik ve tekrarlanabilir olmalıdır.

 Gen aktarımı yapılan hücrelerden transgenik bitkilerin Gen aktarımı yapılan hücrelerden transgenik bitkilerin elde edilebilmesi için etkili bir seleksiyon sistemi

elde edilebilmesi için etkili bir seleksiyon sistemi geliştirilmelidir.

geliştirilmelidir.

 Maliyet ve somaklonal varyasyonu en düşük seviyede Maliyet ve somaklonal varyasyonu en düşük seviyede tutmak için, doku kültüründe geçen süre mümkün

tutmak için, doku kültüründe geçen süre mümkün olduğu kadar kısaltılmalıdır.

olduğu kadar kısaltılmalıdır.

(22)

G G en aktarımı için gerekli olan en aktarımı için gerekli olan koşullar

koşullar

 Gerek tohumla, gerekse vejatatif çoğaltım için stabil ve Gerek tohumla, gerekse vejatatif çoğaltım için stabil ve üniform transgenik bitkiler elde edilmelidir.

üniform transgenik bitkiler elde edilmelidir.

 Sadece istenilen özellikleri kodlayan genler bitkilere Sadece istenilen özellikleri kodlayan genler bitkilere aktarılmalı, istenmeyen DNA dizilerinin geçişi

aktarılmalı, istenmeyen DNA dizilerinin geçişi engellenmelidir.

engellenmelidir.

 Fazla kopya sayısından kaynaklanan, aktarılan genin Fazla kopya sayısından kaynaklanan, aktarılan genin inaktivasyonunu ve entegrasyon bölgelerinde

inaktivasyonunu ve entegrasyon bölgelerinde

oluşabilecek gen zararlarını engellemek için, genler oluşabilecek gen zararlarını engellemek için, genler düşük kopya sayısında aktarılmalıdır.

düşük kopya sayısında aktarılmalıdır.

 Aktarılan genler istenilen fizyolojik devrede ve arzu Aktarılan genler istenilen fizyolojik devrede ve arzu edilen seviyede aktivite göstermelidir.

edilen seviyede aktivite göstermelidir.

(23)

Agrobacterium

Agrobacterium ile gen aktarımını ile gen aktarımını etkileyen faktörler

etkileyen faktörler

 Bitki genotipi Bitki genotipi , ,

 A A setosiringon gibi setosiringon gibi vir vir genlerini uyarıcı bileşikler, genlerini uyarıcı bileşikler,

 Şekerler Şekerler ve ve pH, pH,

 Sıcaklık Sıcaklık ve ve ışık, ışık,

 H H ücre konsantrasyonu, ücre konsantrasyonu,

 İ İ nokulasyon ve ko-kültüvasyon süresi, nokulasyon ve ko-kültüvasyon süresi,

 E E ksplant tipi, ksplant tipi,

 H H ormon uygulması ormon uygulması , ,

 Y Y aralama gibi faktörler aralama gibi faktörler

(24)

Agrobacterium tumefaciens aracılığıyla bitkilere gen aktarımı