Tokat Merkez ve İlçelerinde İnsan ve
Sığırlarda Kırım-Kongo Kanamalı Ateşi Virüsü (KKKA) Prevalansının ELİSA Yöntemiyle Belirlenmesi
Önem YÜCE Yüksek Lisans Tezi Biyoloji Anabilim Dalı Doç.Dr.Şaban TEKİN
2008
FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI
YÜKSEK LİSANS TEZİ
Tokat Merkez ve İlçelerinde İnsan ve Sığırlarda Kırım-Kongo Kanamalı Ateşi Virüsü (KKKA) Prevalansının ELİSA Yöntemiyle Belirlenmesi
Önem YÜCE
TOKAT 2008
Doç.Dr.Şaban TEKİN danışmanlığında, Önem YÜCE tarafından hazırlanan bu çalışma 18/04/2008 tarihinde aşağıdaki jüri tarafından oy birliği ile Biyoloji Anabilim Dalı’nda Yüksek Lisans Tezi olarak kabul edilmiştir.
Başkan : Doç.Dr.Şaban TEKİN İmza :
Üye : Yrd.Doç.Dr.Ahmet BURSALI İmza :
Üye : Yrd.Doç.Şener BARUT İmza :
Yukarıdaki sonucu onaylarım
Prof.Dr.Metin YILDIRIM Enstitü Müdürü
kurallarına uyulduğunu, başkalarının eserlerinden yararlanılması durumunda bilimsel normlara uygun olarak atıfta bulunulduğunu, tezin içerdiği yenilik ve sonuçların başka bir yerden alınmadığını, kullanılan verilerde herhangi bir tahrifat yapılmadığını, tezin herhangi bir kısmının bu üniversite veya başka bir üniversitedeki başka bir tez çalışması olarak sunulmadığını beyan ederim.
TEŞEKKÜR
Çalışmalarım sırasında her türlü desteğini benden esirgemeyen değerli hocam Doç.Dr. Şaban TEKİN’e, sayın Yrd.Doç.Dr. Ahmet Bursalı’ya, her zaman her konuda destek veren sevgili aileme ve çalışmamda emeği geçen tüm arkadaşlarıma sonsuz teşekkürlerimi sunarım.
ÖZET
YÜKSEK LİSANS TEZİ
Tokat Merkez ve İlçelerinde İnsan ve Sığırlarda Kırım-Kongo Kanamalı Ateşi Virüsü (KKKA) Prevalansının ELİSA Yöntemiyle Belirlenmesi
Önem YÜCE Gaziosmanpaşa Üniversitesi
Biyoloji Anabilim Dalı Danışman: Doç.Dr.Şaban TEKİN
Kırım-Kongo Kanamalı Ateşi Virüs’ü Bunyaviridae ailesinden Nairovirus genusundadır. Kırım-Kongo Kanamalı Ateşi Afrika, Asya ve Doğu Avrupa’da oluşan kene kaynaklı bir hastalıktır. Virüs, kanamalı ve ateşli bir hastalığa neden olur. KKKA insanlarda %10-50 arası ölüm oranına sahiptir. İnsanlarda enfeksiyon ya direk olarak kontamine doku ve kanla temasla ya da kene ısırığıyla olur. Bu çalışmada sığırlarda ve farklı risk gruplarında bulunan insanlardaki KKKA seroprevalansı IgG ELİSA yöntemi kullanılarak tespit edilmiştir. Sonuç olarak çalışmada seropozitif sığır serumuna rastlanmamıştır. İnsanlarda ise endemik bölgede hayvancılık yapanlar (%23.2) ve hasta yakınlarının (%22.8) seroprevalansının kene ile ısırılanlara (%10.4) göre daha yüksek olduğu saptanmıştır.
Yıl, 2008; Sayfa, 36
ii
ii ABSTRACT Master Thesis
Determination of Crimean-Congo Haemorrhagic Fever Virus Prevalance in Human and Cattle by Using ELİSA in Tokat Center and Vicinity
Önem YÜCE
Gaziosmanpasa University
Graduate School of Natural and Applied Sciences
Department of Biology
Supervisor: Assoc.Prof.Dr. Şaban TEKİN
Crimean-Congo Hemorrhagic Fever (CCHF) Virus is a member of the genus Nairovirus in the family of Bunyaviridae. CCHF is a tick-borne disease which occurs in regions of Africa, Asia, and Eastern Europe. The virus causes diseases associated with bleeding disorder and fever. CCHF has a fatality range between %10-50 in human. Humans are infected with this virus by direct contact with contaminated blood or tissues or the bite of ticks. Several hudreds of CCHF cases were reported in Tokat, Turkey since 2002. In this study, seroprevalance of the CCHF in cattle and humans from various risk groups were determined by ELİSA. Sera from cattle and humans were examined for the presence of anti-CCHF IgG. In this study seroprevalance of the CCHF was examined by the method of IgG ELİSA in domestic livestock blood samples; relatives of patients(RP) (%22.8), people working with animals (PWA) (%23,1)and people had tick bites (PTB) (%10.4). Analysis of the results indicated that PWA and RP had significantly higher CCHF prevalance.
Year, 2008; Pages, 36
İÇİNDEKİLER Sayfa ÖZET …...…….i ABSTRACT...ii TEŞEKKÜR…...………….iii ŞEKİLLER DİZİNİ ...vi ÇİZELGELER DİZİNİ ...v 1. GİRİŞ VE LİTERATÜR ÖZETİ... 1 1.1. Tarihçe ...1
1.2. Dünyada ve Türkiye’deki Yayılımı ve Salgın Lokasyonları ...2
1.2.1. Dünyadaki Yayılımı ve Salgın Lokasyonları... 2
1.2.2. Türkiye’deki Yayılımı ve Salgın Lokasyonları ... 5
1.3. Hastalığın Taşınma Yolları ...6
1.3.1. İnsandan İnsana Taşınma Yolları ... 6
1.3.2. Keneden İnsana Taşınma Yolları ... 7
1.3.3. Hayvandan İnsana Taşınma Yolları... 7
1.3.4. Hayvandan Keneye Taşınma Yolları ... 8
1.3.5. Keneden Keneye Taşınma Yolları... 8
1.4. KKKA Virüsünün Yapısı, Özellikleri ve Patojenitesi ...8
1.4.1. KKKA Virüsünün Yapısı... 8
1.4.2. Kırım Kongo Kanamalı Ateş Virüsünün Özellikleri ... 10
1.4.3. Virüsün Patojenitesi ve Diğer Özellikleri... 11
1.5 Virüsün Doğal Döngüsü ve Temel Bulaşma Yolları...13
1.6 Keneler ve KKKA Virüsü ...14
1.7 KKKA Virüsü Tanı Testleri...15
1.7.1. Organizma Tanımlama Testleri ... 15
1.7.2. İmmunoassay Testleri... 16
1.7.2.1. ELİSA (Enzyme-linked İmmunosorbent Assay)... 16
1.7.2.1.1. Direct ELİSA ... 17
1.7.2.1.2. İndirect ELİSA ... 18
iv
iv
1.7.2.3. Reversed Passive Hemagglutination ( RPHA ) Test... 18
1.7.3. Moleküler Tanı Testleri ... 19
1.7.4. KKKA Hastalığından Korunma Yolları ... 19
1.7.4.1. Virüse Maruz Kalmanın Minimuma İndirilmesi ya da Tamamen Korunma Sağlanması ... 19 1.7.4.2. Kene Kontrolü ... 19 1.7.4.3. Omurgalı Kontrolü... 19 1.7.4.4. Bariyer Kullanımı ... 20 1.7.4.5. Aşılama ... 20 2. MATERYAL VE METOD... 21 2.1. Materyal...21 2.1.1. Kullanılan Kimyasallar... 21 2.1.2. Kullanılan Cihazlar... 22 2.2. Metod ...22 2.2.1. Solüsyonların Hazırlanması... 22 2.2.2. Test Prosedürü ... 23
2.2.3. Test Uygulama Dizaynı ... 24
3. ARAŞTIRMA SONUÇLARININ YORUMLANMASI ... 26
KISALTMALAR DİZİNİ
Kısaltma Açıklama
IgG İmmunoglobulin G
IgM İmmunoglobulin M
KKHA Kırım Kongo Hemorajik Ateşi
vi
vi
ŞEKİLLER DİZİNİ
Şekil Sayfa
Şekil:1.1 KKKA hastalığının dünyadaki yayılımı...……….……....1
Şekil 1.2 KKKA hastalığının Türkiye’deki yayılımı ...5
Şekil 1.3 Bunyaviridae familyasına ait virüslerin replikasyon döngüleri ...9
Şekil 1.4 KKKA virüsünün yapısı ...10
Şekil 1.5 Bunyaviridae ailesine ait virüsler...11
Şekil 1.6 KKKAV’nün metabolik etkileri...12
Şekil 1.7 Kenelerin hayat döngüsü ...13
Şekil 1.8 Kenenin Yaşam Evreleri...15
ÇİZELGELER DİZİNİ
Çizelge Sayfa
Çizelge 1.1 1984-2006 yılları arasında dünyada görülen KKKA vakalarının % mortalite oranları………... 3 Çizelge 1.2 2002-2004 yılları arasında KKKA hastalığının Türkiye’deki dağılımı……6
Çizelge 1.3 Kenelerin sistematikteki yeri………...14 Çizelge 2.1 ELISA plate……….24 Çizelge 2.2 Risk Gruplarında KKHA prevalansı………...26
1.GİRİŞ VE LİTERATÜR ÖZETİ
Kırım–Kongo Kanamalı Ateşli hastalığı Bunyaviridae ailesinden Nairovirus genusundaki Kırım Kongo Kanamalı Ateş Virüsü (KKKAV)’nün (Crimean-Congo Haemorrhagic Fever Virus, CCHFV) sebep olduğu, sert keneler tarafından bulaştırılan ateşli ve kanamalı bir hastalıktır. Hastalık günümüzde Afrika’nın pek çok bölgesinde, Asya’da ve Avrupa’da görülmekte olup insanlarda ölüm oranı %10-50 arasında değişmektedir. Hastalık aynı zamanda evcil ve yabani memeliler ve kuşlarda da görülmekle birlikte ölüme sebep olmamaktadır. Bu yüzden zoonoz (hayvanlardan insanlara geçen enfeksiyon) bir hastalıktır (Bossi ve ark., 2004; Burt ve Swanepoel, 2005).
1.1.Tarihçe
KKKA’nin tarihteki ilk varlığına 12y.y.’da bugünkü Tacikistan’da rastlanmıştır. Hastalık, karatavuklara parazitlenen bir kene tarafından bulaştırılan, insanlarda idrarda, rektumda, dişetlerinde ve karın boşluğunda kanamalara yol açan hemorajik bir hastalık olarak tanımlanmıştır (Yashina ve ark., 2003; Ergonul, 2006).
Kırım-Kongo Kanamalı Ateşi (KKKA) bu yüzyılda ilk kez 1944 ve 1945 yılı yaz aylarında Batı Kırım steplerinde çoğunlukla ürün toplamaya yardım eden Sovyet askerleri arasında görülmüştür. Hastalığa Kırım Hemorajik Ateşi adı verilmiştir (Chamberlain ve ark., 2005; Ergonul 2006). Bu tarihten sonra 1956 yılında Zaire’de ateşli ve kanamalı bir hastadan izole edilen virüs Kongo virüsü olarak adlandırılmıştır. 1969’da ise Kongo virüsü ile Kırım hemorajik ateşi virüslerinin aynı virüs olduğu belirlenmiş ve Kırım-Kongo Kanamalı Ateşi Virüsü olarak yeniden adlandırılmıştır (Bakır ve ark. 2005; Ergonul, 2006)
1.2. Dünyada ve Türkiye’deki Yayılımı ve Salgın Lokasyonları
1.2.1. Dünyadaki Yayılımı ve Salgın Lokasyonları
KKKA Hastalığı Afrika, Batı Asya, Ortadoğu ve Avrupa’da görülmüştür. Ayrıca Bulgaristan, Makedonya, Pakistan, Irak, Afganistan, İran, Kosova, Kazakistan, Sahra altı Afrika ülkeleri, Rusya, Yugoslavya, Yunanistan, Arap Yarım Adası, Dubai, Kuveyt, Çin ve Moritanya’da KKKA salgınları bildirilmiştir(Şekil1.1)(Çizelge 1.1). 2002 yılının bahar ve yaz aylarından itibaren Tokat başta olmak üzere ülkemizin bazı illerinde görülmüş ve yapılan çalışmalar sonucu hastalığın K.K.K.A. olduğu saptanmıştır (Bakır ve ark. 2005; Ergonul, 2006, Garcia ve ark., 2006).
3
3
Çizelge 1.1 1984-2006 yılları arasında dünyada görülen KKKA vakalarının % mortalite oranları (Suleiman ve ark., 1980; Schwarz ve ark., 1996; van de Wat ve ark., 1985; Altaf ve ark., 1998; Papa ve ark., 2002B; ; Nabeth ve ark., 2004; Whitehouse,2004; Chinikar ve ark., 2006; Ergonul, 2006; Ozkurt ve ark., 2006)
Ülke Adı Zaman Olgu Sayısı Mortalite(%)
Afrika 1984 -1994 48 %24 Pakistan 1994 7 %28.5 Kosova 2001 69 %8.6 Moritanya 2003 40 %15 Birleşik Arap Emirlikleri 1979 -1994 63 %15.5 Suudi Arabistan 1979 5 %40 İran 1999 -2000 2000 -2006 287 341 %19.8 %16.7 Türkiye 2002 -2004 239 %5.4
Afrika’da görülen salgınlar devekuşu kesimleri sırasında gözlenmiştir. (Ergonul, 2006). 1984’te devekuşu kesiminde yer alan çalışanlar enfekte olmuştur. Çevre çiftliklerde yapılan tetkikler sonucu devekuşundan alınan örneklerde %24 oranında virüse karşı antikor oluşumu gözlenmiştir (Hastanın bulunduğu çiftlikte ise 9 kuşun 6’sında antikor oluşumu belirlenmiştir.) (Ergonul, 2006). 1996 yılında deve kuşu mezbahası çalışanlarında 17 hastalık vakası saptanmıştır. Her iki örnekte de enfeksiyon nedeninin ya hayvanların kanlarıyla ya da derilerinin yüzülmesi sırasında birebir temas yoluyla enfekte kenelerden bulaştığından şüphelenilmiştir (Whitehouse,2004). Aynı şekilde Tyberg Hospital’da çalışan 7 eleman ise hastalığı henüz teşhis edilmemiş olan vakayla temas sırasında enfeksiyon kapmıştır. 2 hasta, 1 çalışan ölmüş: 4 tanesi ciddi şekilde hastalanmıştır (Joubert ve ark., 1985). Hastanede aynı zamanda virüsün ilk klinik belirtileriyle aynı belirtilere sahip eş zamanlı grip salgını tespit edilmiştir (van de Wat ve ark., 1985).
Pakistan; Quetta’da Aralık 1994’te daha sonra ölen kanamalı hastanın ameliyatına katılan ekipten 3 sağlık çalışanı enfekte olmuştur. Aynı yılda 4 cerrahtan 2’si deriden enfeksiyona maruz kalmıştır (Altaf ve ark., 1998). Kosova’da ise 2001 yılı ilkbahar ve yaz mevsimi boyunca virüs ortaya çıkmış; 69 vakadan 6’sı ölümle sonuçlanmıştır (Papa ve ark., 2002b). 2003’te Moritanya Sağlık Bakanlığı’nın bildirdiği 35 vakanın 18’i laboratuvar sonuçlarıyla doğrulanmış, 6 vakanın öldüğü saptanmıştır. Virüs salgını hastane acil servisinde toplam 5’i hastane çalışanı, 10’u hasta ve ziyaretçi olmak üzere 15 kişide gözlenmiştir (Nabeth ve ark., 2004).
Birleşik Arap Emirlikleri’nde ilk vaka 1979’da Dubai’de hastanede tespit edilmiştir. Enfeksiyon kaynağı olarak Irak, Kenya ya da Pakistan’dan ithal edilen sığırlar gösterilmiştir. Bununla birlikte ana kaynak belirsizdir. 1993’e kadar yeni bir vaka tespit edilmemiştir.1994’te mezbaha çalışanlarında salgın görülmüş, 35 şüpheli sağlık kuruluşlarına başvurmuştur. Ölüm oranı %62 olarak rapor edilmiştir. Ayrıca çiftlik, mezbaha çalışanları ve deri işleme çalışanlarında 28 şüpheli vakadan 16’sında virüs saptanmıştır (Schwarz ve ark., 1996). Geçmiş asemptomatik (hastalık belirtisi göstermeyen) serolojik kanıtlar 291 çiftlik hayvanının 12’sinde ve mezbaha çalışanlarında tespit edilmiştir (Khan ve ark., 1980). Suudi Arabistan; Dubai’de Kasım 1979’da hastane salgınıyla ortaya çıkan vakalarda, hasta kaydının yapılmasından hemen sonra 5 vakadan 2’sinde ölüm gözlenmiştir (Suleiman ve ark., 1980).
7 Haziran 2000 - 14 Ekim 2006 tarihleri arasında İran’da 873 şüpheliden 341 vakanın KKKA (+) olduğu doğrulanmış ve doğrulanan 341 hastanın 57’si ölmüştür. 7 Ekim 2000 - 16 Temmuz 2006 arasında 4181 besi hayvanından alınan serum örneklerinde 1759 serumun IgG (+) olduğu saptanmıştır (Chinikar ve ark., 2006). 1999-2000 yılları arasında yine İran’da yapılan bir çalışmada; toplamda 666 vakanın 287’si dışında vakaların tümünde uygulanan testler sonucu IgM ve IgG (+) sonuçlar saptanmıştır. Aynı çalışmanın mevsimsel araştırmalarında ise hastalığın maksimum insidansının Ağustos ve Eylül ayları arasında olduğu belirlenmiştir (Mardani ve ark., 2006).
5
5
1.2.2. Türkiye’deki Yayılımı ve Salgın Lokasyonları
Başta Karadeniz ve Orta Anadolu olmak üzere (Şekil1.2) Tokat, Sivas ve Çorum gibi illerle birlikte 22 il Kırım-Kongo Kanamalı Ateşi yönünden risk altındadır. Sağlık Bakanlığı verilerine göre Türkiye’de 2002-2006 yılları arasında 736 vaka bildirilmiş ve bunların 36’sı ölümle sonuçlanmıştır. 2006 yılının ilk yarısından beri ise toplam 63 Kırım-Kongo Kanamalı Ateşi vakası görülmüştür. Yapılan çalışmalar sonucu vakaların %90’ını kene ısırığına maruz kalan, tarım ve hayvancılıkla uğraşan kişilerin oluşturduğu saptanmıştır. Hastalıktan ikinci sırada etkilenen grubu ise sağlık çalışanlarının oluşturduğu belirlenmiştir (Ergonul, 2006).
Tokat Giresun Sivas Yozgat Tokat 820000 Sivas 710000 Giresun 520000 Yozgat 400000 Toplam 2.5 milyon
Şekil 1.2 KKKA hastalığının Türkiye’deki yayılımı ve etkilenen bölgenin toplam nüfusu (Anonim, 2007b)
2002 ve 2003 yılları arasında Kırım Kongo Kanamalı Ateşli Hastalığı ya da benzer viral enfeksiyonlar belirtileriyle 19 vaka tespit edilmiştir. 6 şüphelinin test sonuçları IgM (+) değer göstermiştir. 2 örnekten virüs izolatı elde edilmiştir. İzolatların genetik analizi sonucu Yugoslavya ve Güney Rusya’daki izolatlarla benzerlik gösterdiği saptanmıştır. Türkiye’de görülen ilk 19 vakanın 18’i çiftçi, 1’i ise hemşiredir. 19 kişiden 2’si ölümle
sonuçlanan enfeksiyona maruz kalmıştır. Tüm oran 19 kişide %11 olarak hesaplanmıştır (Karti ve ark., 2004).
Genel olarak 2002-2004 yılları arasında Türkiye’deki KKKA hastalığı mortalitesinin % 1-13 arasında değiştiği rapor edilmiştir (Çizelge1.2). Hastalığın ortaya çıktığı mevsimlerin ilkbahar ve yaz mevsimleri olduğu saptanmıştır ( Ozkurt ve ark., 2006).
Çizelge 1.2 2002-2004 yılları arasında KKKA hastalığının Türkiye’deki dağılımı (Ozkurt ve ark., 2006)
Ülke adı Bölge Zaman Olgu sayısı Mortalite (%)
Türkiye İç Anadolu Karadeniz 2002-2003 35 1 (%2.8) Türkiye Doğu-Karadeniz 2002-2003 19 2 (%10) Türkiye İç Anadolu Karadeniz 2003 92 11 (%12)
Türkiye Türkiye geneli 2004 249 13 (%5.2)
1.3. Hastalığın Taşınma Yolları
1.3.1. İnsandan İnsana Taşınma Yolları
KKKA hastalığı hastalardan hasta yakınlarına ve sağlık çalışanlarına hasta kanıyla temas edilmesi veya nozokomial yolla bulaşmaktadır (Papa ve ark., 2002a). Virüsün insandan insana taşınma yollarından birinin de hastane, klinik vb. ortamlar olduğu tespit edilmiştir. Enfekte hayvan, insan kanı ya da dokularıyla temas edilmesi virüs taşınmasının diğer yollarından biridir. Çeşitli klinik semptomlar içerir ve yüksek
7
7
mortaliteye sahip olduğu belirlenmiştir (Flick ve ark., 2005). En ciddi enfeksiyon riskinin burun, ağız, dişeti, vajina ve enjeksiyon alanları olduğu belirlenmiştir (Drosten ve ark., 2003). Virüsun anneden çocuğa horizontal transmisyonu da görülmüştür Bu nedenle sağlık çalışanları 1. derece risk grubunu oluşturmaktadırlar (Ergonul, 2006, Saijo ve ark., 2004).
1.3.2. Keneden İnsana Taşınma Yolları
KKKAV insanlara başlıca Hyalomma cinsi ixodid kenelerin ısırmasıyla bulaşmaktadır. Özellikle hayvancılığın yoğun olduğu ve kene infestasyonunun fazla olduğu bölgelerde hastalığın kenelerle insanlara bulaşma sıklığının daha fazla olduğu saptanmıştır. Hastalık en çok Hyalomma cinsi kenelerle taşınsa da sadece bu cinsle sınırlı değildir. Rhipicephalus, Dermacentor, İxodes cinsi sert kenelerin ve bazı yumuşak kene türlerinin de bu virüsü taşıdığı gösterilmiştir (Morikawa ve ark., 2002).
1.3.3. Hayvandan İnsana Taşınma Yolları
Enfekte hayvan kanı, salgıları veya dokularıyla temas edilmesi KKKA virüsünün insanlara bulaşmasının etkin yollarından biridir (Flick ve ark., 2005; Morikawa ve ark., 2002). Besi ve çiftlik hayvanlarının enfeksiyondan sonra hastalık göstermemelerine rağmen bir hafta süreyle viremik olduğu gözlenmiştir. Bir hafta boyunca hayvanlarla yakın temasta bulunan tarım işçileri, mezbaha çalışanları ve veterinerlerin risk altında olduğu belirlenmiştir (Drosten ve ark., 2003).
1.3.4. Hayvandan Keneye Taşınma Yolları
Olgunlaşmamış kenelerin, virüsü özellikle küçük omurgalılar (kemirgenler) üzerinden beslenerek bulaştırdıkları belirlenmiştir. Küçük omurgalıların bir sefer enfekte olunca gelişimleri boyunca enfeksiyonu taşıyıp daha sonra geniş kitlelere bulaştırabildikleri de edinilen bilgiler arasındadır. Dolayısıyla enfekte hayvanlardan kan emen keneler virüsü almakta ve insan dahil beslendiği diğer konaklara bulaştırmaktadırlar (Nabeth ve ark., 2004).
1.3.5. Keneden Keneye Taşınma Yolları
Omurgasızlar arasında virüs yalnızca kenelerde bulunmuştur (Watts ve ark., 1988). Virüs kenelerde transstradial (larvadan nimfe, nimfden erişkine) veya transovarial (anneden yumurtaya) geçiş yapabilmektedir (Whitehouse, 2004).
1.4. KKKA Virüsünün Yapısı, Özellikleri ve Patojenitesi
1.4.1. KKKA Virüsünün Yapısı
Virüsun tamamı yaklaşık 100 nanometre (nm) çapında ve sferik görünümdedir. Virüsün viral genomu ve buna bağlı proteinler (nükleoproteinler ve polimeraz) protein kılıfı (kapsid) içinde yer alırken, kapsid bir lipid zarfla çevrilmiştir (Şekil 1.3, Şekil1.4).
Bunyaviridae ailesinin diğer üyeleri gibi KKKAV’de üç yapısal proteine sahiptir. Bu proteinler virüsün tripartit yani üç segmentli negatif tek zincirli RNA genomu tarafından kodlanmaktadır. Bu segmentler S, M, ve L segmentleridir. S segmenti nükleokapsit proteinini, M segment Gn ve Gc yapısal glikoproteinlerini ve L segmenti RNA bağımlı viral RNA polimerazı kodlamaktadır. Gn ve Gc proteinleri zar glikoproteinleridir ve bu
9
9
viral glikoproteinlerin duyarlı hücrelerdeki reseptör bölgelerini tanımaktan sorumlu olduğuna inanılmaktadır. Duyarlı hücrelerdeki reseptörlere bağlanan virüsler endositoz yoluyla hücre içine alınırlar ve virüs çoğalması sitoplazma içerisinde meydana gelir. Olgunlaşmış virüsler (virionlar) endoplazmik retikulumdan tomurcuklanarak ayrılırlar ve golgi bölgesinde sitoplazmik veziküller içine alınırlar. Buradan da füzyon işlemi ile virüs en dıştaki zarını almış olarak hücre dışına çıkar (Şekil1.3) (Whitehouse, 2004).
Şekil 1.3 KKKA Virüsünün yapısı (Whitehouse, 2004)
L ( Large ) Viral RNA polimeraz
M ( Medium) Yapısal proteinler (G1 ve G2) S ( Small) Nukleokapsid protein (N) Lipit membran Bunyaviridae
Şekil 1.4 Bunyaviridae familyasına ait virüslerin replikasyon döngüleri (Whitehouse, 2004)
1.4.2. Kırım Kongo Kanamalı Ateş Virüsünün Özellikleri
KKKA virüsü Bunyaviridae ailesinden Nairovirus türü içinde yer alan bir virüstür (şekil1.5). Bu virüslerin zarflı ve tek iplikçikli RNA parçacığından oluştukları belirlenmiştir. Yapılan sistematik çalışmaları sonucu Nairovirus’lerin 34 türü bulunduğu ve bunlardan sadece 3 türün insanlarda duyarlı hücreler üzerindeki alıcılara tutunarak hücre içerisine alınması sonucu.hastalığa yol açtığı saptanmıştır (Bossi ve ark., 2004). Genetik yapısındaki farklılıklara göre virüs 8 alt gruba ayrılmaktadır ve Türkiye’de elde edilen KKKA virüslerinin Rus ve Balkan virüs gruplarına %99 benzerlik gösterdiği belirlenmiştir (Ergonul, 2006).
11
11
Bunyaviridae
Bunyavirus Hantavirus Nairovirus Phlebovirus Tospovirus
•Crimean-Congo hemorrhagic fever virus •Dera Ghazi Khan Virus
•Hughes Virus Group
•Nairobi Sheep Disease Virus Group •Qalyub Virus Group
•Sakhalin Virus Group •Thiafora Virus Group
Şekil 1.5 Bunyaviridae ailesine ait virüsler (Whitehouse, 2004)
1.4.3. Virüsün Patojenitesi ve Diğer Özellikleri
KKKA virüsü Nairoviruslar içinde en patojen olan virüstür. İnsanlarda enfeksiyon sonrası hastalık yaygın olarak görülmektedir. Virüs glikoproteini kene, omurgalı konakçı seçiminde ve insanlardaki yüksek patojeniteden sorumludur. Viral glikoproteinlerin önemli bir bölümü, hücre içi proteazlarla; küçük bir bölümü de salınan proteazlarla daha küçük parçalara yıkılmaktadır. Viral glikoprotein ve hücresel proteazların etkileşiminin, konakçı seçimi ve patojenitede rol aldığı düşünülmektedir. Virüs temel olarak mononukleer fagositleri, endoteli ve karaciğeri enfekte ederek ağır hemorajiyle seyreden yüksek ateşe neden olmaktadır. Histopatolojik incelemeler; karaciğerde hemoraji nekroz, dalakta lenfosit tüketimi, akciğerde hemoraji, ödem, birçok organda hemoraji ve hücresel nekroz olduğu gösterilmiştir (şekil1.6).
Şekil 1.6 KKKAV’nün metabolik etkileri (Geisberg ve Jahrling, 2004)
Virülansının çok yüksek olmasına rağmen KKKA virüsü dış ortamda nispeten dayanıklılığını yitirmektedir. Konak dışında uzun süre varlığını sürdürememektedir. Ultraviole ile hızla öldüğü saptanmıştır. 56°C’de 30 dakikada inaktive olmaktadır. Kanda 40°C’de 10 gün süreyle yaşayabilmektedir. %1 hipoklorit ve %2 glutaraldehide duyarlı olduğu saptanmıştır. Ortam pH’sına duyarlıdır (düşük pH’ da hızla inaktive olur) (Drosten ve ark., 2003; Kara, 2006).
13
13
1.5. Virüsun Doğal Döngüsü ve Temel Bulaşma Yolları
Virüsun ortaya çıkması mevsimsel özelliklere bağlıdır. Hastalık etmeninin döngüsü yabani hayvan-kene arasında geçmektedir. Ekolojik dengenin bozulduğu ve baskın türlerin ortaya çıktığı durumlarda odakların genişlediği tespit edilmiştir. Keneler, hayvanların aksine rezervuardır (Anonim, 2007d). Virüs; kenelerin enfekte hayvanı emmesi sonucunda keneye geçer, kenelerin tüm hayat döngüsü sırasında taşınır ve bulunduğu konakları enfekte eder (Şekil1.7). Kene türünün konak sayısının fazlalığı virüsün diğer canlı gruplarına ve insanlara bulaşma ihtimalini artıran faktörlerden biridir (Ergonul, 2006).
Yumurtalar
Larva yumurtadan çıkar
Larva yeni konak arar
Larva I.konakta beslenir
I. Konak Beslenen larva toprağa düşer Larva nimfe dönüşür II. Konak
Nimf II.konağa yapışır ve beslenir
Nimf erişkin keneye dönüşür
III. Konak
Dişi erişkin kene III.konağa yapışır ve beslenir
Beslenen dişi erişkin kene toprağa düşer
1.6. Keneler ve KKKA Virüsü
Keneler kanla beslenen ve hastalık ajanlarını hayvan ve insanlara taşıyan en önemli
Artropod vektörlerdendir. Dünyada tanımlanmış ~900 kene türünden, 6 familyaya
(Çizelge 1.3) ait en az 30 tür Türkiye’de bulunmaktadır. Hyalomma cinsi keneler Türkiye’nin de içinde bulunduğu coğrafyada çok yaygın olarak bulunmakta ve KKKAV taşıyan temel kene cinsini temsil etmektedir. Keneler dünyanın bütün kara parçalarında bulunan ve karada yaşayan eklembacaklıların en kalabalık grubunu oluşturan canlılardır. Yaşamları süresince değişik canlılar üzerinde (küçük kemirgenler, sürüngenler, kuşlar, çiftlik hayvanları veya büyük yabani memeli hayvanlar ve insanlar) zorunlu ektoparazit olarak bulunurlar. Kenelerin beslendikleri konak sayısı genellikle türe bağlı olarak 1-3 arasında değişebilir. Yumurtadan çıkan larvalar ilk konakta kan emdikten sonra nimf haline gelirler. Daha sonra başka bir konağa geçerek veya aynı konak üzerinde beslenerek erişkin kene haline gelirler (şekil1.6) (Watts ve ark.,1988).
Keneler KKKA virüsünün asıl rezervuarıdırlar. Virüs kenenin bütün organlarında çoğalır ve kenenin yaşamı boyunca infektivitesini korur (1 yıldan fazla; kışı kenede geçirir). Sahadan toplanan henüz beslenmemiş immatür kenelerde de virüsün bulunması virüsün kenelerde transovarial (anneden yumurtaya) yolla geçebildiğini, enfekte larvaların ergin hale geldiklerinde de virüsü bulaştırması da transstradial (larvadan nimfe, nimfden erişkine) geçiş olduğunu göstermiştir (Şekil1.8) (Ergonul, 2006).
Çizelge 1.3 Kenelerin sistematikteki yeri (Anonim, 2007e) Phylum Arthropoda
Classis Arachnida
Ordo Acarina
Family Argasidae (yumuşak keneler) Ixodidae (sert keneler)
Genus Ixodes, Hyalomma, Amblyomma, Haemaphysalis, Dermacentor, Boophilus, Rhipicephalus
15
15
ergin dişi ergin erkek ergin dişi
larva (üst) larva (alt) nimf (alt) Şekil 1.8 Kenenin yaşam evreleri
1.7. KKKA Virüsü Tanı Testleri
KKKA virüsünün tanısı için değişik yöntemler kullanılmaktadır. Bunlardan bazıları aşağıda özetlenmiştir.
1.7.1. Organizma Tanımlama Testleri
1.7.1.1. Mikroskopi
Bilinmeyen bir viral hemorajik ateş ajanının tanımlanmasında immünohistokimyasal yöntemleri, hücre kültüründe izolasyon ve elektron mikroskobuyla incelenmesi başarılı sonuçlar getiren metotlardır (Ergonul,2006).
1.7.2. İmmunoassay Testleri
1.7.2.1. ELİSA (Enzyme-Linked İmmunosorbent Assay)
Her mikroorganizmanın kendine özgü antijeni vardır. Bu antijenler saflaştırılır ve spesifik monoklonal antikor üretiminde kullanılır. ELİSA, antijen ya da antikor varlığında kullanılan en yaygın serolojik testtir. Testin iki formu bulunur: numunede antijen varlığını tanımlayan monoklonal antikorları kullanan Direct ELİSA ve numunede spesifik antikor (örn: KKKAV antikoru) tanımlamada kullanılan İndirect ELİSA (Qing ve ark., 2003).
Özellikle insan ve hayvanlarda seruma bağlı olarak yapılan teşhislerde ve prevalans araştırmalarında ELISA tekniği yoğun olarak kullanılmaktadır. Bu teknik doğrudan serum, plazma, diğer vücut sıvıları veya hücre homojenizatlarında bulunan viral antijenlerin, bu antijene spesifik enzimle işaretli antikorlarla tespit edilmesine veya seruma viral antijenlere karşı üretilen IgM (enfeksiyonun ilk haftasında yüksek konsantrasyonda sentezlenir ve kısa ömürlüdür) ve IgG (Enfeksiyonun ilerleyen safhalarında yüksek konsantrasyonda üretilir ve uzun ömürlüdür) (Özbal, 2000) gibi immünoglobülinlerin, bu immünoglobülinlere spesifik enzim işaretli antikorlarla tespit edilmesine dayanmaktadır. IgG ve IgM sınıfı immünoglobülinler, hedef hücreleri infekte eden ekstrasellüler virüsleri nötralize etme yeteneğindedirler. Enfeksiyonu olan bir hastanın serumunda enfeksiyonun başlangıcında IgM ve iyileşme döneminde IgG sınıfından etkene özgü antikorlar bulunmaktadır IgM ELİSA (+) sonuç, örnek kaynağında viral enfeksiyon varlığını gösterirken; IgG ELİSA (+) sonuçlar enfeksiyonun geçirildiğini ve virüse karşı immünitenin oluştuğunu ifade eder (Özbal, 2000).
KKKA virüsünün insan ve hayvan (sığır, koyun ve keçi) serumları kullanılarak yapılan prevalans araştırmalarında ELISA tekniği yoğun olarak kullanılmıştır (Qing ve ark., 2003).
17
17 1.7.2.1.1. Direct ELİSA
Serum veya plazma gibi örneklerde antijen varlığının ve konsantrasyonunun belirlenmesi için kullanılan ELİSA yöntemidir. Direct ELİSA metoduna en iyi örnek Sandwich ELİSA (şekil1.9) ve Rekabete Dayalı ELİSA teknikleridir.
Şekil 1.9 Sandwich ELİSA (Anonim, 2007f)
Antijen üzerinde birikmeyen epitoplara bağlanacak 2 antikora ihtiyaç vardır. Antikor, kuyucukların dibine inmesini sağlayan katı bir faza tutunur. Antikora bağlanarak kompleks oluşturması için üzerine antijen eklenir. Kompleks oluşumundan sonra bağlanmayan antijenlerin ayrılması için yıkama işlemi yapılır ve deteksiyon antikoru eklenir. Eğer antijen varsa: kuyucuğa yapışan antikor-antijen ve enzim konjuge edilmiş antikor kompleksi oluşur ve renk değişimi gözlenir. Antijen yoksa enzim bağlı antikor yıkanma sonucu uzaklaştırılır ve renk değişimi görülmez. Renk değişimi örnekte antijene varlığını gösterir ve sonuç (+)tir. Renk değişimi yoksa numunede antijen yoktur ve sonuç (-)tir (Donets ve ark.,1982).
1.7.2.1.2. İndirect ELİSA
Serum ve benzeri örneklerde antijene karşı gelişmiş antikorların aranmasında (örn:HIV) kullanılan ELİSA tekniğidir. Antijen ilk önce kuyucuklara absorbe olur. Serum, kuyucuklara eklenen antikorlara karşı antijen içermelidir. Örnekte antikor varsa antijene bağlanma olur. Örnek non-spesifik antikor içeriyorsa antijene bağlanma olmaz. Kuyucuğa absorbe olamayan antikorlar yıkanma sonucu uzaklaştırılır. Eğer antikorlar antijene bağlandıysa bu durum antikor-enzim konjugatı eklenerek tespit edilir. Bu reporter antikorlar genelde IgG olmak üzere immunoglobülinlere bağlanırlar. Eğer örnekte insan serumunda bulunan antikorlar varsa reporter olarak enzim konjuge edilmiş anti-human IgG kullanılır. Örnekte antikor varsa absorbe olan antijene bağlanır ve enzim konjuge edilmiş antikor bu komplekse bağlanır. Numune, bağlanmamış antikorların ayrılması için yıkanır. Son durumda enzim için substrat eklenmiştir. Numunede meydana gelen renk değişimi orijinal antijene karşı antikor varlığına işaret eder (Donets ve ark., 1982).
1.7.2.2. İndirect İmmunoflorescence Assay (IFA)
Dokularda bulunan hedef antijen, bu antijene karşı spesifik floresanla işaretli antikorlar kullanılarak tespit edilir ve bir floresan mikroskop yardımıyla antijenin bulunduğu bölge tespit edilir. Bu teknik KKKA vakalarında özellikle kan preparatlarına uygulanarak veya hücre kültürleriyle yapılan araştırmalarda viral teşhiste yaygın olarak kullanılmaktadır (Haferkamp ve ark., 2005).
1.7.2.3. Reversed Passive Hemagglutination ( RPHA ) Test
KKKA virüs antijenlerinin tespiti için yapılan testtir. Günler öncesinden ölmüş yeni doğan kobayların beyinlerinde enfeksiyondan 2-3 gün sonra RPHA testiyle KKKA virüs tespiti yapılmıştır (Shephard ve ark., 1988).
19
19 1.7.3. Moleküler Tanı Testleri
Moleküler tanı testleri RT-PCR ve one step RT-PCR olmak üzere 2’ye ayrılır. (Drosten ve ark., 2002).
1.7.4. KKKA Hastalığından Korunma Yolları
1.7.4.1. Virüse Maruz Kalmanın Minimuma İndirilmesi ya da Tamamen Korunma Sağlanması
Eldiven kullanma, çıplak elle kan vb. vücut sıvılarına dokunmama, yürüyüşe çıkıldığında koruyucu giysi kullanma (Whitehouse, 2004).
1.7.4.2. Kene Kontrolü
Evcil hayvanlarda vektör kontrolü en iyi kimyasal kullanımıyla olur. Permethrin emdirilmiş kıyafetler kene ısırmalarına karşı koruma sağlayabilir. Ayrıca sulama ve toprağı sürme, H. a. anatolicum’un bulunma yoğunluğunu azalttığı bildirilmiştir (Watts ve ark.,1988).
1.7.4.3. Omurgalı Kontrolü
Endemik alanlarda besi hayvanlarına akarisit uygulamasının enfekte kene populasyonunu azalttığı saptanmıştır. Rodent populasyonunun suprese edilmesiyle Avrupa’da D. marginatus populasyonunun azaldığı saptanmıştır. Avrupa’da yabani tavşan ve kirpi populasyonunun kontrol altına alınmasıyla Hyalomma kenelerinde azalma gözlenmiştir. Kuş populasyonunun kontrolüyle de kene vektörlerinin dağılımının azaldığı belirlenmiştir (Watts ve ark., 1988).
1.7.4.4. Bariyer Kullanımı
Hasta ziyaretinde koruyucu kıyafet kullanımı, hasta odasının tek girişli olması, tuvalet, banyo vb. ihtiyaçların maksimum güvenlikle atılımının sağlanmasıdır. Hasta ziyareti sırasında koruyucu kıyafet (eldiven, maske vb..) kullanımı, hasta odasının havalandırılmasının normal hava akımına ters yönde olması da diğer faktörler arasındadır. Dezenfektan olarak: %5 sodyum hipoklorit, Gluteraldehit, fenolik dezenfektanlar ve sabun kullanılabilir (CDC,1988).
1.7.4.5. Aşılama
Bulgaristan, Doğu Avrupa ve Eski Sovyetler Birliği’nde formalin-inactivated aşı kullanılmıştır. Bununla birlikte CCHF virüsüyle temas riski olan insanlarda, aşının modern standartlarda geniş oranda üretilmesi imkansızdır ve kullanılan aşının güvenliği şüphelidir. Fakat bu aşının uygulandığı Rusya ve Bulgaristan’da aşının verildiği yüzlerce gönüllüde yüksek oranda antikora rastlanmıştır (Whitehouse, 2004).
2. MATERYAL VE METOD
2.1. Materyal
Araştırmada Tokat bölgesi ve çevre illerden tarım ve hayvancılık çalışanlarıyla kontrol grubundan alınan kan örnekleriyle, büyükbaş besi hayvanlarından alınan kan örnekleri kullanılmıştır. Kan örnekleri hayvandan ya kesim sırasında ya da kesim öncesi hayvanın jagular damarından alınmıştır. İnsan serum örnekleri ise Tokat ili ve çevresindeki Turhal, Zile, Niksar, Artova, Erbaa, Yeşilyurt, Sulusaray, Pazar, Başçiftlik, Artova gibi KKHA vakalarının görüldüğü ilçe ve bunlara bağlı köylerden toplanmıştır. Bu bölgelerde risk grupları içinde yer alan birinci derecede hayvancılıkla uğraşan (besici ve çobanlar) 26 kişi, kene ile ısırılan 106 kişi ve daha önce KKHA geçirmiş kişilerin yakınları arasından 193 kişiden kan alınmıştır. Kan örnekleri EDTA içeren vakumlu tüplerle (5-10 ml) toplanmış ve santrifüjlenerek plazmanın ayrılması sağlanmıştır. Daha sonra 1.5 ml plazma 2 ml’lik ependorf tüplerine aktarılarak -20ºC de test edilene kadar saklanmıştır.
2.1.1. Kullanılan Kimyasallar
Yapılan çalışmada CCHF IgG-Human BDSL (Biological Diagnosis Supplies Limited and Special Pathogens Unit, NICD / South Africa) ve CCHF IgG-Bovine (Biological Diagnosis Supplies Limited and Special Pathogens Unit, NICD / South Africa) ELİSA kitleri kullanılmıştır. Kitin içeriği aşağıda belirtildiği gibidir:
• Monoklonal anti-KKKA antikoru, 2 ×150µl • KKKA antijeni, 2 ×200µl
• Kontrol antijeni, 1 ×300µl
• Goat anti-human IgG horseradish peroxidase (HPRO), 1 ×100µl • Kontrol serumları: 1×100µl yüksek (+) kontrol (C++)
1×100µl düşük (+) kontrol (C+) 1×100µl (-) kontrol (C-)
• Phosphate-buffered saline (PBS) tozu, 20×poşet • Süt tozu, 2×50g
• Tween 20, 1× 100ml
• Immunoplates, 25×(nunc maxi sorb) • ABTS substrate, 3×100ml
• SDS-stop solution 10×konsantre, 1×100 ml.
2.1.2. Kullanılan Cihazlar
Yapılan çalışma sırasında kullanılan kit ve cihazlar: - ELİSA Plate Washer : Cenix Exaro
- Micro Plate Reader : RT-2100C Rayto (India) - Memmert İnkübator (Germany)
2.2. Metod
Bu çalışmada CCHF IgG-Human ve IgG-Bovine ELİSA kiti üretici firmanın önerdiği prosedüre göre kullanılmıştır.
2.2.1. Solüsyonların Hazırlanması
• PBS: 0,01M, pH 7,4: 1litre suya 1 paket PBS tozu paketi steril distile suda çözülmüştür.
• Yıkama Tamponu: Son konsantrasyon 0,1% olacak şekilde Tween 20 PBS’te dilüe edilmiştir.
• Dilüent Tamponu: %2’lik süt tozu PBS’te çözülmüştür.
• Blocking Tamponu: %10’luk süt tozu 1lt. distile suda 1 paket hazırlanmış olan PBS’te çözülmüştür.
23
23
• Monoklonal anti-CCHF: 150µl steril distile suda çözülmüştür.
• Antijenler: CCHFV Ag 200µl ve kontrol antijeni 300µl steril distile suda çözülmüştür.
• Kontrol Serumları: Her biri 100µl steril distile suda çözülmüştür.
• Working dilution of coating antibody (1:1000): 1lt distile suda 1 paket hazırlanmış olan PBS’de çözülmüştür.
• Antijenlerin çalışma solüsyonları (1:500), kontrol ve test serumları (1:400) konjugat (1:10000) dilüent tamponunda hazırlanmıştır.
• Substrate:ABTS
• Stop solüsyonu: 1:10 oranında distile suda çözülmüştür.
2.2.2. Test Prosedürü
1. IgG ELİSA için kullanılan plate toplam 96 kuyucuktan oluşmaktadır.
2. ELİSA plate’i her kuyucuğuna 100µl olacak şekilde 1:1000 oranında dilüe edilmiş monoklonal anti-KKKA antikoruyla kaplanmıştır. Bir gece boyunca +4ºC’de inkübasyona bırakıldıktan sonra 300µl yıkama solüsyonuyla 3 defa yıkama işlemi gerçekleştirilmiştir.
3. Her kuyucuğa 200’er µl blocking tamponu eklenmiş ve nem çemberi içerisinde 1 saat boyunca 37ºC’de inkübasyona bırakıldıktan sonra 300µl yıkama solüsyonuyla 3 defa yıkanmıştır.( CCHF IgG-Human Kiti prosedürü için geçerlidir.)
4. Dilüsyon oranı 1:500 olacak şekilde her kuyucuğa sırasıyla dilüent tamponunda hazırlanan 100’er µl A-D, 1-12 KKKA antijeni ve E-H, 1-12 kontrol antijeni pipetlenerek nem çemberi içerisinde inkübatörde (Memmert) 1 saat boyunca 37ºC’de inkübasyona bırakıldıktan sonra 300µl yıkama solüsyonuyla 3 defa yıkanmıştır.
5. Dilüent tamponunda 1:400 oranında dilüe edilen test ve kontrol örneklerinden belirtildiği şekilde kuyucuklara 100’er µl eklenerek nem çemberi içerisinde 1 saat
boyunca 37ºC’de inkübasyona bırakıldıktan sonra 300µl yıkama solüsyonuyla 6 defa yıkanmıştır.
6. 100’er µl anti-bovine IgG HRPO dilüent tamponunda 1:10000 oranında dilüe edilerek eklendikten sonra nem çemberi içerisinde 1 saat boyunca 37ºC’de inkübasyona bırakıldıktan sonra 300µl yıkama solüsyonuyla 6 defa yıkanmıştır (ELİSA Plate Washer Cenix) .
7. Her kuyucuğa 100’er µl ABTS eklenmiştir ve karanlık ortamda oda sıcaklığında (22-23ºC) bırakıldıktan sonra her kuyucuğa 100’er µl reaksiyonu durdurucu etkisi bulunan SDS solüsyonu pipetlenerek 405 nm’deki absorbans saptanmıştır (Micro Plate Reader RT-2100C Rayto).
2.2.3. Test Uygulama Dizaynı
C++ : Yüksek (+) kontrol serum C+ : Düşük (+) kontrol serum C- : (-) kontrol serum
1-40 : Test serum A-D 1-12 : CCHFV antijeni
25
25 Çizelge 2.1 ELİSA plate çalışma düzeni.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A C++ C++ 1 5 9 13 17 21 25 29 33 37 B C++ C++ 2 6 10 14 18 22 26 30 34 38 C C+ C+ 3 7 11 15 19 23 27 31 35 39 D C- C- 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 E C++ C++ 1 5 9 13 17 21 25 29 33 37 F C++ C++ 2 6 10 14 18 22 26 30 34 38 G C+ C+ 3 7 11 15 19 23 27 31 35 39 H C- C- 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40
Yapılan çalışma sonucu elde edilen bulgular, üretici firmanın belirlediği kabul şartlarına göre testler kabul edilmiş ve değerlendirilmiştir.
görüldüğü çeşitli yayınlarda rapor edilmiştir. Bölgemizde hangi risk gruplarının KKHA den daha çok etkilendiğine dair çok kapsamlı bir çalışma bulunmaktadır. Özellikle hayvancılıkla uğraşanlar, kene ile ısırılanlar ve KKHA hasta yakınlarının KKHA riski tam olarak bilinmemektedir. Bu nedenle bu çalışmada Tokat ve çevresinde KKHA Hastalığının sık görüldüğü endemik bölgelerde hayvancılıkla uğraşanlar, kene ile ısırılanlar ve KKHA hasta yakınlarının KKHA seroprevalansının araştırılması ve dolayısıyla bu grupların KKHA risk potansiyelinin belirlenmesi hedeflenmiştir. Çalışmada aynı zamanda Tokat genelinde sığırlardan da kan örnekleri alınarak sığırlardaki KKHA seroprevalansı da araştırılmıştır.
Sığırlarda KKHA seroprevalansı
Bu çalışmada 280 adet sığır kanı anti-KKHA IgG ELISA ile test edilmiştir. ELISA sonuçlarına göre incelenen 280 adet sığır kanı örneğinde seropozitif sonuca rastlanmamıştır. Bu sonuç çok sınırlı sayıdaki örnekle alınan bir sonuç olup sığırlardaki KKHA prevalansı hakkında genel populasyonun sonucunu yansıtmadığı düşünülmektedir. Literatürdeki çalışmaların bazılarında sığır ve koyunlarda KKHV prevalansının ortalama %5-30 civarında olduğunun rapor edilmesi bu fikrimizi desteklemektedir. Daha kesin ve sağlıklı sonuç için test edilen sığır sayısının ve hayvan çeşidinin arttırılması gerekmektedir.
Risk Gruplarında KKHA Seroprevalansı
Dünyada yapılan birçok çalışmada sağlık çalışanları (Doktor, hemşire, sağlık teknisyenleri ve veterinerler), hayvancılıkla uğraşanlar, mezbaha işçileri, kene ile ısırılanların KKHA yakalanma riskinin yüksek olduğu rapor edilmiştir. Ülkemizde özelikle KKHA’nın endemik olduğu Tokat yöresinde risk gruplarının KKHA seroprevalansı hakkında detaylı çalışma yapılmamıştır. Özellikle endemik bölgede kene
26
26
ile ısırılanların ve hasta yakınlarının KKHA riski hakkında tam bir bilgi yoktur. Bu nedenle bu çalışmada Tokat çevresinde KKHA Hastalığının sık görüldüğü endemik bölgelerde hayvancılıkla uğraşanlar, kene ile ısırılanlar ve KKHA hasta yakınlarının KKHA seroprevalansı araştırılmış ve bu grupların KKHA risk potansiyeli belirlenmiştir. Yapılan insan anti-KKHA IgG ELISA testlerinin sonuçlarına göre; profesyonel olarak hayvancılıkla uğraşanların (6/26) KKHA prevalansı %23.1 iken, kene ısırığına maruz kalanların (11/106) KKHA prevalansı ise %10.4 olarak bulunmuştur. Buna karşılık hasta yakınlarının (44/193) KKHA prevalansının ise %22.8 olduğu saptanmıştır. Dolayısıyla bu çalışmaya göre bölgede KKHA riski yüksek olan grupların başında Hayvancılıkla uğraşanlar ve hasta yakınları gelmektedir. Hayvancılıkla uğraşanların ve hasta yakınlarının KKHA prevalansının kene ile ısırılanlardan istatistiksel olarak ta farklı tespit edilmiştir (p<0.05) (Çizelge 1.5).
Çizelge 2.2 Risk Gruplarında KKHA prevalansı
0 5 10 15 20 25 Risk Grupları
Hayvancılıkla uğraşanlar Hasta yakınları Kene ile ısırılanlar
% Prevalans
a
b a
2000-2006 yılları arasında İran’da yapılan benzer bir çalışmada 854 şüpheli vakanın 335’inde IgG (+) benzer bulgulara rastlanmıştır. Toplam vakaların %54.3’ünün yaş oranının 21-40 arasında olduğu ve hastalıktan en çok etkilenen grupların ise; %19,4 oranında çiftçiler, %18,2 oranında işçiler, %19 oranında ev hanımları olduğu bildirilmiştir (Chinikar ve ark., 2007).
Yapılan araştırmayla benzer sonuçlar gösteren diğer bir araştırma da Sağlık Bakanlığı verileriyle desteklenmiştir. Türkiye’de 2002-2006 yılları arasında 736 vaka bildirilmiş ve bunların 36’sı ölümle sonuçlanmıştır. 2006 yılının ilk yarısından beri ise toplam 63 Kırım-Kongo Kanamalı Ateşi vakası görülmüştür. Yapılan çalışmalar sonucu vakaların %90’ını kene ısırığına maruz kalan, tarım ve hayvancılıkla uğraşan kişilerin oluşturduğunun saptanmıştır. Hastalıktan ikinci sırada etkilenen grubu ise sağlık çalışanlarının oluşturduğu belirlenmiştir (Ergonul, 2006).
2004 yılında yapılan bir seroprevalans çalışmasında (Çevik ve ark., 2007) ise KKKA (+) olduğu saptanan 90 hastada; Anti-KKKA IgG’ye rastlanmamasına rağmen (0/10), ölüm vakalarının %40’ında IgM (+) bulunmuştur (4/10). KKKA (+) olduğu saptanan 90 hastanın 54’ü ise KKKA IgM (+), hastalığı atlatan 76 kişinin 35’i ise (%46) Anti-KKKA IgG (+) sonuç vermiştir. 2004 yılı boyunca toplanan örneklerle yapılan seroprevalans araştırmalarında 80 sağlık çalışanının 16’sında (%20), 12 veterinerden 3’ünde (%25), 114 çiftçiden 19’unda (%25) IgG (+) sonuçlarının gözlenmesi (Ozkurt ve ark., 2006) tarım ve hayvancılıkla ilgilenen risk grubunun hastalıktan en fazla etkilenen grup olduğunu destekler niteliktedir. 2003-2006 yıları arasında yapılan bir çalışmada toplanan numunelerin 40 tanesinde IgM (+) bulunmuştur.
2005-2006 yıllarında Kuzey Anadolu ve Karadeniz’in güneyi arasında yaş ortalaması 8 olan KKKAV virüsüyle enfekte olmuş çocuklar üzerinde yapılan araştırmaya göre %62’si erkek çocuklardan oluşan %77’si kene ısırığı olan grup IgM (+) sonuç saptanmıştır. Buna bağlı olarak 1 vakanın ölümle sonuçlandığı bildirilmiştir ( Tanır ve ark., 2007).
2004 yılında İran’da yapılan bir araştırmada ise besi hayvanlarında KKKA hastalığının seroprevalansına bakılmıştır. 88 besi hayvanında IgG (+) sonuç elde edilirken en önemli
28
28
prevalans yüzdeleri koyunlarda %53.3, ineklerde %38.5 ve diğer besi hayvanlarında %18.6 olarak belirlenmiştir (Izadi ve ark., 2007). 1999-2006 yılları arasında İran’da yapılan bir seroprevalans çalışmasında ise 18 yaşın altında 23’ü erkek, 11’i bayan olmak üzere toplam 34 vakanın 29’unun kırsal alanda yaşadığı (%85) ve KKKA’dan etkilenen çocukların %23.5’inde kene ısırığının risk faktörü olduğu belirlenmiştir (Mood ve ark., 2007).
2002 ve 2003 yılları arasında Türkiye’de Karadeniz bölgesinde 19 vaka tespit edilmiştir. 6 şüphelinin test sonuçları IgM (+) olarak bulunmuştur. Türkiye’de görülen ilk 19 vakanın 18’i çiftçi, 1’i ise hemşiredir. 19 kişiden 2’si ölümle sonuçlanan enfeksiyona maruz kalmıştır. Tüm oran 19 kişide %11 olarak hesaplanmıştır (Karti ve ark., 2004). Yine yapılan bu araştırma da bizim çalışmamızda olduğu gibi KKKA hastalığından en fazla etkilenen grubun tarım ve hayvancılıkla uğraşan risk grubu olduğunu göstermektedir.
Bu araştırmada yapılan analiz sonucunda toplanan insan kanı örneklerinde %95 güvenilirlikle endemik alanlarda kene tarafından enfekte edilen tarım ve hayvancılıkla uğraşan risk grubu (%23,1) ve KKKA hasta yakınlarında (%22,8) KKKA seroprevalansının kene ısırığı grubuna göre önemli ölçüde farklılık gösterdiği tespit edilmiştir. Bu sonuçla beraber KKKA hastalığı açısından (+) sonuç veren hastaların yakınlarında yüksek oranda IgG (+) sonuç bulunması hastalardan hasta yakınlarına KKKA bulaştığını göstermektedir. Hasta yakınlarının hasta ziyaretleri veya bakımları sırasında nosokomial veya aerosollerle bu hastalardan KKKA kapmış ola olasılığını mümkün kılmaktadır. Ayrıca hasta yakınlarının bir kısmının hastalığı kenelerden veya başka kaynaklardan da almış olmaları mümkündür. Hasta yakınlarına bulaşmanın nasıl olduğunun anlaşılması için daha ileri çalışmaların yapılması gerekmektedir. Özellikle bu kişilerin hastalığı belirtisiz olarak atlatmış olmaları ayrıca dikkat çeken ve araştırılması gereken bir husus olarak gözden kaçırılmamalıdır.
Sonuç olarak Tokat bölgesinde hayvancılıkla uğraşanlar ve hasta yakınları yüksek oranda KKKA riski altında bulunmaktadır. Dolayısıyla bu grupların korunmasıyla ilgili tedbirlerin ve eğitim çalışmalarının yapılması faydalı olacaktır. Her ne kadar
seroprevalansı düşükte olsa kene ısırığı olanlar özellikle endemik bölgede yaşayanlar risk altında bulunmaktadırlar.
30
30 4. KAYNAKÇA
Altaf, A., Luby, S., Ahmed, A.J., Zaidi, N., Khan, A.J., Mırza, S., Mccormick, J., Fisher-Hoch, S., 1998. Outbreak of Crimean-Congo Haemorrhagic Fever in Quetta, Pakistan: Contact Tracing and Risk Assessment. Trop Med Int Health. 3(11): 878 - 882.
Bakır, M., Ugurlu, M., Dokuzoguz, B., Bodur, H., Tasyaran, M.A., Vahaboglu, H., 2005. Crimean-Congo Haemorrhagic Fever Outbreak in Middle Anatolia: A Multicentre Study of Clinical Features and Outcome Measures. J Med Microbiol. 54(Pt4): 385-389.
Bossi, P., Tegnell, A., Baka, A., Van Loock, F., Hendriks, J., Werner, A., Maidhoff, H., Gouvras, G., 2004. Task Force on Biological and Chemical Agent Threats, Public Health Directorate, European Commission, Luxemburg. Bichat Guidelines fır the Management of Haemorrhagic Fever Viruses and Bioterrorism-Related Haemorrhagic Fever Viruses. Euro Surveill. 9(12): E11-E12.
Burt, F.J., Swanepoel, R., 2005. Molecular Epidemiology of African and Asian Crimean-Congo Haemorrhagic Fever Isolates.Epidemiol Infect. 133(4): 659-666 Cevik, M.A., Erbay, A., Bodur, H., Gulderen, E., Bastug, A., Kubar, A., Akıncı, E.,
2007. Clinical and Laboratory Features of Crimean-Congo Haemorrhagic Fever: Predictors and Fatality. 17th European Congress of Clinical Microbiology and InfectiousDiseases 31 Mar - 04 Apr 2007, ICC, Munich, Germany.
Chamberlain, J., Cook, N., Lloyd, G., Mioulet, V., Tolley, H., Hewson, R., 2005. Co-Evolutionary Patterns of Variation in Small and Large RNA Segments of Crimean-Congo Hemorrhagic Fever Virus. J Gen Virol. 86(Pt 12): 3337-3341.
Chinikar, S., Ahmadnejad, F., Fayaz, A., Hosseini, N., Afzali, N., Gooya, M., Zeinali, M., Hooshmand, B., Lundkvist, A., Nilsson, M., Mırazımı, A., Flick, R., Grolla, A., Feldmann, H., Bouloy, M., 2007. The Situation of
Crimean-Congo Haemorrhagic Fever in the Last Year in Iran. 17th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases 31 Mar - 04 Apr 2007, ICC, Munich, Germany.
Drosten, C., Kummerer, B.M., Schmitz, H., Gunther, S., 2003. Molecular Diagnostics of Viral Hemorrhagic Fevers. Antiviral Res. 57(1-2): 61 - 87.
Donets, M.A., Rezapkin, G.V., Ivanov, A.P., Tkachenko, E.A., 1982. Immunosorbent Assay for Crimean-Congo Hemorrhagic Fever. Am J Trop Med Hyg. 31(1): 156-162.
Ergonul, O., 2003. Crimean-Congo Haermorrhagic Fever. Lancet Infect Dis. 6(4): 203-214
Flick, R., Whitehouse, C.A., 2005. Crimean-Congo Hemorrhagic Fever Virus. Curr Mol Med. 5(8): 753 - 760.
Geisbert, T.W., Jahrling, P.B, 2004. Exotic Emerging Viral Disases: Progress and Challenges. Nat Med 10(12 Suppl): S110-S121.
Garcia, S., Chinikar, S., Coudrier, D., Billecocq, A., Hooshmand, B., Crance, J.M., Garin, D., Bouloy, M., 2006. Evaluation of a Crimean-Congo Hemorrhagic Fever Vırus Recombinant Antigen Expressed by Semliki Forest Suicide Virus for IgM and IgG Antibody Detection in Human and Animal Sera Collected in Iran. Journal of Clinical Virology 35 (2006) 154-159.
Haferkamp, S., Fernando, L., Schwarz, T.F., Feldmann, H., Flick, R., 2005. Intracellular Localization of Crimean-Congo Hemorrhagic Fever Vırus Glycoproteins. Virology Journal 2:42
Izadı, M., Salehi, H., Mostafavı, K., Chinikar, S., Ataeı, B., Khorvash, F., Darvısh, M.,Jonaıdı Jafarı, N., 2007. Sero Epidemiology of Crimean-Congo Haemorrhagic Fever in Domestic Animals in Central Area of Iran. 17th
32
32
European Congress of Clinical Microbiology and InfectiousDiseases 31 Mar - 04 Apr 2007, ICC, Munich, Germany.
Joubert, J.R., King, J.B., Rossouv., D.J., Cooper, R., 1985. A Nosocomial Outbreak of Crimean-Congo Haemorrhagic Fever at Tygerberg Hospital. Part III. Clinical Pathology and Pathogenesis. S Afr Med J. 68(10): 722 – 728
Kara, A., 2006. Kırım-Kongo Hemorajik Ateşi. Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları Dergisi. 49: 175-184
Karti, S.S., Odabasi, Z., Korten, V., Yılmaz, M., Sonmez, M., Caylan, R., Akdogan, E., Eren, N., Koksal, I., Ovali, E., Erickson, B.R., Vincent, M.J., Nichol, S.T., Comer, J.A., Rollin, P.E., Ksiazek, T.G.,2004. Crimean-Congo Hemorrhagic Fever in Turkey. Emerg Infect Dis. 10(8): 1379 - 1384.
Khan, A.S., Maupin, G.O., Rollin, P.E., Noor, A.M., Shurie, H.H., Shalabi, A.G., Wasef, S., Haddad, Y.M., Sadek, R., Ijaz, K., Peters, C.J., Ksiazek, T.G.,1997. An outbreak of Crimean-Congo hemorrhagic fever in the United Arab Emirates,1994-1995. Am J Trop Med Hyg. ; 57(5): 519 - 525.
Mardani, M., Goya, M., Zaınalı, M., Jahromi, M.K., 2006. Clinico-Epidemiologic Feature and Outcome Analysis of Crimean-Congo Haemorrhagic Fever in Iran (1999-2006).
MMWR, 1988. Center for Disease Control and Prevention. Management of Patients with Suspected Viral Hemorrhagic Fever. Morb Mortal Weekly Report. 37(Supplemental 3): 1 - 16.
Mood Sharıfı, B., Mardanı, M., Hatamı, H., Metanat, M., 2007. Crimean-Congo Haemorrhagic Fever Among Children in Southeast Iran (Clinico-Epidemiological Feature and Outcome Analysis). 17th European Congress of
Clinical Microbiology and Infectious Diseases
Morikawa, S., Qing, T., Xinqin, Z., Saijo, M., Kurane, I., 2002. Genetic Diversity of the M RNA Segment Among Crimean-Congo Hemorrhagic Fever Virus İsolates in China. Virology. 296(1): 159 - 164.
Nabeth, P., Cheikh, D.O., Lo, B., Faye, O., Vall, I.O., Niang, M., Wague, B., Diop, D., Diallo, M., Diallo, B., Diop, O.M., Simon, F., 2004. Crimean-Congo Hemorrhagic Fever, Mauritania. Emerg Infect Dis. 10(12): 2143 - 2149.
Ozkurt, Z., Kiki, I., Erol, S., Erdem, F., Yılmaz, N., Parlak, M., Gundogdu, M., Tasyaran, M.A., 2006. Crimean-Congo Hemorrhagic Fever in Eastern Turkey: Clinical Features, Risk Factors and Efficacy of Ribavirin Therapy. J Infect. 52(3): 207 - 215.
Özbal, Y., 2000. Temel İmmünoloji, syf. 110-113. Nobel Tıp Kitapevleri, 2. Baskı.
Papa, A., M.A., B., Kouidou, S., Tang, Q., Hang, C., Antoniadis, A., 2002a. Genetic Characterization of The M RNA Segment of Crimean Congo Hemorrhagic Fever Virus Strains, China. Emerg Infect Dis. 8(1): 50 – 53.
Papa, A., Bozovi, B., Pavlidou, V., Papadimitriou, E., Pelemis, M., Antoniadis, A., 2002b. Genetic Detection and Isolation of Crimean-Congo Hemorrhagic Fever Virus, Kosovo, Yugoslavia. Emerg Infect Dis. 8(8): 852 - 854.
Qing, T., Saijo, M., Niikura, M., Maeda, A., Ikegamı, T., Xınjung, W., Kurane, I., Morikawa, S., 2003. Detection of Immunoglobulin G to Crimean-Congo Hemorrhagic Fever Virus in Sheep Sera by Recombinant Nucleoprotein-Based Enzyme-Linked Immunosorbent and Immunofluorescence Assays. J Virol Methods. 108(1): 111 - 116.
34
34
Saıjo, M., Tang, Q., Nııkura, M., Maeda, A., Ikegamı, T., Prehaud, C., Kurane, I., Morıkawa, S., 2002. Recombinant Nucleoprotein-Based Enzyme-Linked İmmunosorbent Assay for Detection of Immunoglobulin G Antibodies to Crimean-Congo Hemorrhagic Fever Virus. J Clin Microbiol. 40(5): 1587 - 1591. Saıjo, M., Tang, Q., Shımayı, B., Han, L., Zhang, Y., Asıguma, M., Tıanshu, D., Maeda, A., Kurane, I., Morikawa, S., 2004. Possible Horizontal Tranmission of Crimean-Congo Hemorrhagic Fever Vırus from A Mother to Her Child. Jpn. J. Inf. Dis., 57, 55-57.
Schwarz, T.F., Nsanze, H., Longson, M., Nitschko, H., Gilch, S., Shurie, H., Ameen, A., Zahir, A.R., Acharya, U.G., Jager, G., 1996 Polymerase Chain Reaction for Diagnosis and İdentification of Distinct Variants of Crimean-Congo Hemorrhagic Fever Virus in the United Arab Emirates. Am J Trop Med Hyg. 55(2): 190 - 196.
Shepherd, A.J., Swanepoel, R., Gill, D.E., 1988. Evaluation of Enzyme-Linked İmmunosorbent Assay and Reversed Passive Hemagglutination for Detection of Crimean-Congo Hemorrhagic fFever Virus Antigen. J Clin Microbiol. 26(2): 347 - 353.
Shepherd, A.J., Swanepoel, R., Leman, P.A., Shepherd, S.P., 1986. Comparison of Methods for Isolation and Titration of Crimean-Congo Hemorrhagic Fever Virus. J Clin Microbiol. 24(4): 654 - 656.
Suleiman, M.N., Muscat-Baron, J.M., Harries, J.R., Satti, A.G., Platt, G.S., Bowen, E.T., Simpson, D.I., 1980. Congo-Crimean Haemorrhagic Fever in Dubai. An Outbreak at the Rashid Hospital. Lancet. 2(8201): 939 - 941.
Tanır, G., Ergonul, O., Tuygun, N., Golabı, P., Korten, V., 2007. Crimean-Congo Haemorrhagic Fever Infection Among Children. 17th European Congress of
Clinical Microbiology and Infectious Diseases
Van De Wal, B.W., Joubert, J.R., Van Eeden, P.J., King, J.B., 1985. A Nosocomial Outbreak of Crimean-Congo Haemorrhagic Fever at Tygerberg Hospital. Part IV. Preventive and Prophylactic Measures. S Afr Med J. 68(10): 729 – 732 Watts, D.M., Kziasek, T.G., Linthicum, K.J., Hoogstraal, H., 1988. Crimean-Congo
Hemorrhagic Fever.
Whıtehouse, C. A., 2004. Crimean-Congo Hemorrhagic Fever. Antiviral Res. 2004; 64(3): 145 - 160.
Yashina, L., Vyshemirskii, O., Seregin, S., Petrova, I., Samokhvalov, E., Lvov, D., Gutorov, V., Kuzina, I., Tyunnikov, G., Tang, Yw., Netesov, S., Petrov, V., 2003. Genetic Analysis of Crimean-Congo Hemorrhagic Fever Virus in Russia. J Clin Microbiol. 41(2): 860-862
ANONİM, 2007a. http://www.gata.edu.tr/dahilibilimler/infeksiyon/duyuru/Sunu3.ppt
ANONİM, 2007b. http://www.gbichina.com/grafts/compan2.jpg
ANONİM, 2007c. http://www.halksagligi.org/bulten/khb/khb
ANONİM, 2007d. http://www.ism.gov.tr/indir/KIRIMKONGO.ppt
ANONİM, 2007e. http://www.klimik.org.tr/KKHA/Keneler%20ve%20CCHF.pdf
36
36 ÖZGEÇMİŞ Kişisel Bilgiler
Adı Soyadı : Önem YÜCE
Doğum Tarihi ve Yer : 04.07.1981/ Tokat-Zile Medeni Hali : Bekar
Yabancı Dili : İngilizce
Telefon : 0 543 350 69 42 e-mail : onemyuce@hotmail.com Eğitim İş Deneyimi
Derece Eğitim Birimi Mezuniyet
Tarihi
Yüksek Lisans GOP Üniversitesi 2005-2008
Lisans Akdeniz Üniversitesi 2000-2004
Lise Turhal Anadolu Lisesi 1999
Yıl Yer Görev
2007-…. Gaziosmanpaşa
Üniversitesi
38
