LAKTOKOKSİN BZ’NİN TAZE SIĞIR ETİNİN MİKROBİYOLOJİK KALİTESİ ÜZERİNE ETKİSİ
Sabire Battal
Yüksek Lisans Tezi Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı
Danışman:
Prof. Dr. Zeliha YILDIRIM 2012
T.C.
GAZİOSMANPAŞA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI
Y. LİSANS TEZİ
LAKTOKOKSİN BZ’NİN TAZE SIĞIR ETİNİN MİKROBİYOLOJİK
KALİTESİ ÜZERİNE ETKİSİ
Sabire Battal
2012 TOKAT
NVWpVp ıuIeN'JC 'ÖoC 'wıml,(euo ncnuos DI?pIffın^ T,t07t
8t
sl
nlqsug rnp$t\i ITx^Ig11şyşJ zıueğ'ıq
'öoq'a
: a,(ç1Tn)a)uoJ
uIIwJqI'ıq
'Öoq :a(ç
ruIuICITI^ EqIlreZ 'JC JoJd : rre1Öeg 'ıı1Sııu1ıpe InqPI {BJ€Io IZaJ suBsIT Iesln^ €pu6IIEC IuIIIqeuV ıŞı1sıpueqç7qeplo
eI
EIIJIq.(o
uupuIJ€JP} IJnç qupıfie*z apuFIIJe}7|07l8yil
uru*ıpÖ nqTEZ BEYANI
Tez yazım kurallarına uygun olarak hazırlanan bu tezin yazılmasında bilimsel ahlak kurallarına uyulduğunu, başkalarının eserlerinden yararlanılması durumunda bilimsel normlara uygun olarak atıfta bulunulduğunu, tezin içerdiği yenilik ve sonuçların başka bir yerden alınmadığını, kullanılan verilerde herhangi bir tahrifat yapılmadığını, tezin herhangi bir kısmının bu üniversite veya başka bir üniversitedeki başka bir tez çalışması olarak sunulmadığını beyan ederim.
i
Yüksek Lisans Tezi
LAKTOKOKSİN BZ’NİN TAZE SIĞIR ETİNİN MİKROBİYOLOJİK KALİTESİ ÜZERİNE ETKİSİ
Sabire Battal
Gaziosmanpaşa Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı Danışman: Prof.Dr. Zeliha YILDIRIM
Bu çalışma Lactococcus lactis ssp. lactis BZ tarafından üretilen laktokoksin BZ’nin taze sığır etinin mikrobiyolojik kalitesi üzerindeki etkisini belirlemek ve ete inoküle edilen
Listeria monocytogenes’e karşı antimikrobiyal etkisini ortaya koymak amacıyla
gerçekleştirilmiştir. Ayrıca laktokoksin BZ’nin taze sığır etinde stabilitesi de belirlenmiştir. Bu amaçla, piyasadan alınan et örneklerinin yüzeyi farklı konsantrasyonlarda laktokoksin BZ (0, 200, 400, 800, 1600 ve 2500 AU/g ) ile muamele edildikten sonra buzdolabı sıcaklığında (4-5°C) 12 gün süreyle depolanmıştır. Depolamanın belirli periyodunda alınan et örneklerinde toplam mezofilik aerobik bakteri, toplam psikrotrof aerobik bakteri, toplam koliform, fekal koliform, laktik asit bakterileri ve maya-küf sayımları yapılmıştır. Ayrıca laktokoksin BZ’nin et yüzeyine tutunan veya tutunma aşamasında olan L. monocytogenes’e (yaklaşık 105
veya 108 kob/mL) karşı antimikrobiyal etkisi de belirlenmiştir. Buna ilave olarak farklı konsantrasyonlarda laktokoksin BZ ile muamele edilerek buzdolabında depolanan et örneklerinin depolamanın farklı zamanlarındaki antilisterial aktivitesi de tespit edilmiştir.
Laktokoksin BZ’nin taze etin mikrobiyolojik kalitesini toplam mezofilik aerobik bakteri, toplam psikrotrof aerobik bakteri, toplam koliform, fekal koliform ve laktik asit bakteri sayılarında azalmaya neden olarak iyileştirdiği belirlenmiştir. Taze et örnekleri L.
monocytogenes ile 4,71 veya 7,92 log kob/g düzeyinde inoküle edildiğinde laktokoksin BZ
ilk 5 dk içerisinde konsantrasyona bağlı olarak, tutunmuş listeria sayısında sırasıyla 1,11-4,71 ve 0,90-7,92 log kob/g düzeyinde azalmaya neden olmuştur. Et örnekleri L.
monocytogenes ve laktokoksin BZ ile aynı anda muamele edildiklerinde, konsantrasyona
bağımlı bir şekilde, laktokoksin BZ’nin düşük tutunmamış listeria içerikli (5,00 log kob/g) örneklerde ilk 10 dk içerisinde 1,93-5,00 log kob/g, yüksek listeria içerikli (7,99 log kob/g) örneklerde ise 1,35-7,99 log kob/g seviyesinde bir azalmaya neden olduğu gözlenmiştir. Ayrıca laktokoksin BZ’nin buzdolabı koşullarında 12 günlük depolama süresince de L.
monocytogenes sayısında düşüşe sebep olduğu bulunmuştur. Laktokoksin BZ’nin
antilisteriyal aktivitesinin bakteriyosin konsantrasyonunun artmasıyla ve listeria sayısının azalmasıyla arttığı belirlenmiştir. Laktokoksin BZ ile muamele edilip buzdolabında 12 gün
ii
depolanan et örneklerinde bile laktokoksin BZ’nin aktivitesini koruduğu ve L.
monocytogenes’i etkili bir şekilde inhibe ettiği saptanmıştır.
Sonuç olarak, laktokoksin BZ’nin taze sığır etinin mikrobiyolojik güvenliğini iyileştirdiği, depolama ömrünü arttırdığı ve ette kuvvetli bir antilisteriyal aktiviteye sahip olduğu tespit edilmiştir.
2012, 48 sayfa
Anahtar Kelimeler: Bakteriyosin, laktokoksin BZ, Lactococcus lactis ssp. lactis BZ,
iii
EFFECT OF LACTOCOCCIN BZ ON MICROBIOLOGICAL QUALITY OF FRESH BEAF MEAT
Sabire Battal Gaziosmanpaşa University
Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Food Engineering
Supervisor: Prof. Zeliha YILDIRIM
The aims of this study were to determine the effect of lactococcin BZ produced by
Lactococcus lactis ssp. lactis BZ on the microbiological quality of fresh beef meat and to
investigate its antimicrobial activity against Listeria monocytogenes inoculated onto the surface of raw meat. The stability of lactococcin BZ in raw beef meat was also evaluated. For this purpose, beef meat samples obtained from markets were treated with various concentration of lactococcin BZ (0, 200, 400, 800, 1600, and 2500 AU/g) and kept at refrigeration temperature (4-5oC) for 12 days. Total mesophilic aerobic bacteria, psycrotrophic bacteria, total coliform, fecal coliform, lactic acid bacteria and yeast-mold counts were determined in beef meat samples at certain storage periods. Furthermore, antilisterial activity of lactococcin BZ on attached and non-attached L. monocytogenes cells (approximately 105 or 108 cfu/g) were examined. Additionally, antilisterial activity of meat samples treated with various concentrations of lactococcin BZ and stored at the refrigerator were determined at certain storage periods.
It was found that lactococcin BZ improved the microbiological quality of beef meat by reducing the counts of indigenous total mesophilic aerobic bacteria, total psycrotrophic aerobic bacteria, total coliform, fecal coliform, and lactic acid bacteria. When meat samples were inoculated with L. monocytogenes at the level of 4.71 and 7.92 log cfu/g, lactococcin BZ depending on concentration reduced the number of attached listeria by 1.11-4.71 log cycles and 0.90-7.92 log cycles, respectively in 5 min. When meat samples were simultaneously inoculated with lactococcin BZ and L. monocytogenes, lactococcin BZ reduced the number of non-attached listeria cells in 10 min by 1.93-5.00 log cycles in the small inoculum (5.00 log cfu/g) and 1.35-7.99 log cycles in the large inoculum (7.99 log cfu/g) compared to control samples. In addition, lactococcin BZ reduced the number of L.
monocytogenes during 12 days refrigerated storage. The antilisterial activity of lactococcin
BZ increased with an increasing bacteriocin concentration and a decreasing listeria cell count. Even after 12 days of refrigerated storage on meat surfaces, lactococcin BZ retained its activity and reduced listeria counts effectively.
iv
In conclusion, it was observed that lactococcin BZ improved the microbiologiacal safety and storage life of raw beef meat, and had strong anti-listerial activity against L.
monocytogenes in meat system.
2010, 48 pages
Keywords: Bacteriocin, lactococcin BZ, Lactococcus lactis ssp. lactis BZ, Listeria
v
ÖNSÖZ
Yüksek lisans öğrenimim süresince danışmanlığımı yapan, çalışmalarım sırasında desteğini esirgemeyen, çalışmalarımı ve beni sürekli yönlendiren, yaşamsal deneyimleri ve öngörüleriyle günümü ve geleceğimi aydınlatan değerli hocam Sayın Prof. Dr. Zeliha YILDIRIM’a, tez konumun belirlendiği ilk andan itibaren yardımlarını esirgemeyen Sayın Arş. Gör. Nilgün ÖNCÜL’e ve maddi ve manevi desteğini her zaman karşılıksız olarak sağlayan babam Mustafa BATTAL’a, annem Halime BATTAL’a ve kardeşim Seval BATTAL’a sonsuz teşekkürlerimi sunarım.
Gaziosmanpaşa Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Komisyonu tarafından desteklenmiştir. (Proje numarası 2011-80)
vi İÇİNDEKİLER ÖZET……….……….………... ABSTRACT……….……….……… ÖNSÖZ…..………..……… İÇİNDEKİLER……….……… ŞEKİLLER DİZİNİ…………...……… Sayfa 1. GİRİŞ…...……….……….. 2. KAYNAK ÖZETLERİ…………..………...………..……. 2.1. Bakteriyosinin Tanımı………... 2.2. Bakteriyosinlerin Sınıflandırılması………...…..………... 2.3. Bakteriyosinlerin Antimikrobiyal Etki Mekanizmaları……….……... 2.4. Bakteriyosinlerin Etki Spektrumları………... 2.5. Laktokokların ve Laktokoksin BZ’nin Genel Özellikleri………... 2.6. Et Endüstrisinde Bakteriyosinojenik Laktik Asit Bakterileri ile
Bakteriyosinlerinin Önemi ve Fonksiyonları……….. 2.7. Ette Bakteriyosin Kullanımıyla İlgili Olarak Yapılan Araştırmalar……..…….…
3. MATERYAL VE YÖNTEM………..………. 3.1. Materyal………..………... 3.1.1. Et Örnekleri……….……….……… 3.1.2. Mikroorganizmalar ve Besiyerleri…….……….. 3.2. Yöntem….……….……….……….. 3.2.1. Bakteriyosinlerin Hazırlanması…….……….……….. 3.2.2. Laktokoksinin Taze Sığır Etinin Mikrobiyolojik Kalitesi Üzerine Etkisi……… 3.2.2.1. Mikrobiyolojik Analizler İçin Örnek Hazırlama………….……….. 3.2.2.2. Toplam Mezofil Aerobik Bakteri Sayımı………….………. 3.2.2.3. Toplam Psikrotrof Aerobik Bakteri Sayımı………….………. 3.2.2.4. Toplam Koliform ve Fekal Koliform Sayımı………….………... 3.2.2.5. Laktik Asit Bakteri Sayımı……….………... 3.2.2.6. Maya-Küf Sayımı……….………. 3.2.3. Laktokoksin BZ’nin Ete Tutunan L. monocytogenes Üzerine İnhibitör Etkisi 3.2.4. Tutunma Esnasında L. monocytogenes’in İnhibisyonu……….…... 3.2.5. Etin Buzdolabında Depolanması Sırasında L. monocytogenes Gelişimi
Üzerine Laktokosin BZ’nin İnhibitör Etkisi……….………... 3.2.6. Depolama İşleminin Bakteriyosin Aktivitesi Üzerine Etkisi
3.2.7. İstatiksel Analiz……….……….………..
4. BULGULAR ve TARTIŞMA………..………
4.1. Laktokoksin BZ’nin Taze Sığır Etinin Mikrobiyolojik Kalitesi
Üzerine Etkisi ……….………..….….. 4.1.1. Toplam Mezofil Aerobik Bakteriler Üzerine Etkisi………...……….….
i iii v vi viii 1 5 6 6 8 9 9 10 14 20 20 20 20 20 20 21 21 21 21 21 22 22 23 23 23 23 24 24 25 25 25
vii
4.1.4. Laktik Asit Bakterileri Üzerine Etkisi…………..……..….………. 4.1.6. Maya-Küf Üzerine Etkisi…………...…….…………..….……….. 4.2. Laktokoksin BZ’nin Ete Tutunan L. monocytogenes
Üzerine İnhibitör Etkisi……….. 4.3. Tutunma Esnasında L. monocytogenes’in İnhibisyonu…..………. 4.4. Etin Buzdolabında Depolanması Sırasında L. monocytogenes Gelişimi
Üzerine Laktokoksin BZ’nin İnhibitör Etkisi……….……… 4.5. Depolama İşleminin Bakteriyosin Aktivitesi Üzerine Etkisi…………..………...
5. SONUÇ……….. KAYNAKLAR……….. ÖZGEÇMİŞ ………... 29 31 31 33 35 37 39 42 48
viii
ŞEKİLLER DİZİNİ
Şekil 2.1. Bakteriyosinlerin antimikrobiyal etki mekanizması……….…. Sayfa Şekil 2.2. Antimikrobiyal aktiviteye sahip LAB’lerin taze ete uygulanma
şekilleri ……….. Şekil 4.1. Laktokoksin BZ’nin taze ette toplam mezofil aerobik bakteri
(TMAB) gelişimi üzerine etkisi... Şekil 4.2. Laktokoksin BZ’nin taze ette toplam psikrotrof aerobik bakteri
(TPAB) gelişimi üzerine etkisi... Şekil 4.3. Laktokoksin BZ’nin taze ette laktik asit bakterilerin (LAB) gelişimi üzerine etkisi... Şekil 4.4. Ete tutunan L. monocytogenes üzerine laktokoksin BZ’nin
inhibitör etkisi... Şekil 4.5. Laktokoksin BZ’nin ete tutunma esnasında L. monocytogenes’e karşı inhibitör aktivitesi... Şekil 4.6. Laktokoksin BZ’nin buzdolabında depolama sürecinde ette
L. monocytogenes gelişimi üzerine etkisi...
Şekil 4.7. Et ortamında laktokoksin BZ’nin buzdolabı koşullarında stabilitesi... 8 12 27 27 30 32 34 38 38
ix
ÇİZELGELER DİZİNİ
Çizelge 2.1. Et ve ürünlerinden izole edilen bakteriyosinojenik LAB’leri…...……..
Sayfa
Çizelge 4.1. Laktokoksin BZ’nin taze etin toplam koliform içeriği üzerine etkisi…. Çizelge 4.2. Laktokoksin BZ’nin taze etin fekal koliform içeriği üzerine etkisi……
7 29 29
1
1. GİRİŞ
Modern teknikler ve güvenlik önlemlerinin (örneğin HACCP) tanımlanması ile gıda biyoteknolojisinde sağlanan gelişmelere rağmen gıda güvenliği halen daha çözüm bekleyen bir problemdir. Gıda kaynaklı hastalıklar dünya çapında halk sağlığını ilgilendiren en ciddi problemlerden biri olarak kabul edilmektedir. Modern teknolojiler, iyi üretim uygulamaları, kalite kontrol ve hijyen, Tehlike Analizi ve Kritik Kontrol Noktaları (HACCP) ve risk değerlendirmesi gibi güvenlik konseptlerine rağmen geçtiğimiz on yıl içinde gıda kaynaklı hastalık ve zehirlenme sayısında artış görülmektedir. Avrupa Birliği’nde en çok görülen gıda kaynaklı enfeksiyonlar Campylobacter, Salmonella ve Listeria cinsi bakteriler ile virüslerden kaynaklanmaktadır. Avrupa Gıda Güvenliği Kurumu (EFSA) tarafından her yıl 380.000 kişinin Avrupa Birliği ülkelerinde bu enfeksiyonlara yakalandığı tespit edilmiştir (Seçkin ve ark., 2010).
Kimyasal bileşimi ve biyolojik özelliklerinden dolayı et mikroorganizmaların gelişmesi için mükemmel bir ortam oluşturmaktadır. Taze et; nem içeriği yüksek (% 70), proteince zengin (nitrojenli gıdalarda % 18–20 protein), gelişme için gerekli minerallere sahip, yeterli düzeyde karbonhidrat içeren, uygun pH değerine sahip ( ~5,6 ) olan bir gıdadır (Aymeric ve ark., 2008; Biswas ve ark., 2008). Bundan dolayı taze et mikrobiyolojik bozulmalara karşı en duyarlı gıdalar veya potansiyel olarak en tehlikeli gıdalar arasında yer almaktadır. Başlangıç mikroorganizma sayısı ve türü hayvan sağlığı ve üretim parametrelerine bağlı olarak değişkenlik göstermektedir. Ette patojen ve bozulma etmeni mezofil ve psikrotrof bakteriler bulunabilmektedir. Etlerin kesim, yüzme, parçalama, taşıma, depolama ve işleme sırasında uygulanan yanlış teknikler sonucunda Salmonella spp., E. coli O157:H7, Listeria monocytogenes gibi salgınlara neden olan patojen mikroorganizmalarla kontamine olma ihtimali yüksektir. Bundan dolayı mikrobiyal gelişimi önlemek veya kontrol altına almak için iyi üretim uygulamaları ve uygun muhafaza yöntemlerinin uygulanması gerekmektedir (Fiorentini ve ark., 2001).
Ette bulunan başlıca patojenler, Salmonella spp., Escherichia coli, Listeria
perfringenes, Staphylococcus aureus, Aeromonas hydrophila’dır. Ete bulaşan
mikroorganizmalar hızla çoğalır ve et ürünlerinin gerçek florasını oluşturur. Bu durumun sonucunda insan sağlığı tehlikeye girmekte ve hatta ölümle sonuçlanan vakalar görülebilmektedir (Biswas ve ark., 2008).
Listeria monocytogenes fakültatif aerobik, gıda kaynaklı fırsatçı patojen olup listeriosis
gıda enfeksiyonuna neden olmaktadır. Kolay gelişen bakteriler içinde yer alır. Basit besiyerlerinde ve 0-45°C gibi geniş bir sıcaklık aralığında gelişebilen psikrotrof bir bakteridir. Gelişebildiği pH aralığı 4,1-9,6 arasında değişmektedir. Yüksek tuza (%10) ve düşük sıcaklığa (buzdolabı sıcaklığı) karşı dayanıklı olduğu gibi nitriti de tolere edebilmektedir (Beresford ve ark., 2001; Zhu ve ark., 2005).
L. monocytogenes enfeksiyonları özellikle belirli gruplar, örneğin hamile kadınlar,
yaşlılar, yeni doğan bebekler ve bağışıklık sistemi zayıf kişiler için oldukça tehlikelidir. Vakaların %25-30’unun ölümle sonuçlandığı belirlenmiştir (Doyle ve Montville, 1997; McLauchlin ve ark., 2004; Liu, 2006; Hamon ve ark., 2006; Jemmi ve Stephan, 2006). Listeriosisin belirtileri menenjit, septisemi, gebelerde düşük ve/veya ölü doğum ve lokal enfeksiyonlardır (McLauchlin ve ark., 2004; Liu, 2006).
L. monocytogenes doğada yaygın (su, toprak, gıda, insan ve hayvan) olarak bulunmakta
ve gıda zincirine taşıyıcı hayvanların dışkıları ve sütleriyle girebilmektedir (Wiedmann ve ark., 1998; Chan ve ark., 2007; Denny ve McLauchlin, 2008). Listeriosis enfeksiyonlarında en çok rol oynayan gıdalar, taze et ve et ürünleri, çiğ süt ve süt ürünleri, sebzeler ve deniz ürünleridir. Bu ürünlerde düşük sıcaklıklarda bile gelişebilmektedir. L. monocytogenes düşük sıcaklıklarda gelişebildiğinden imhası için hızlı ve uygun bir metot uygulanmadığı sürece gıda endüstrisi için bir tehdit oluşturmaktadır. L. monocytogenes spor oluşturmayan bakteriler içinde dondurma, kurutma ve ısıl işlemlerin yok edici etkilerine karşı oldukça dayanıklı ve dirençli olanıdır (Small ve ark., 2003; Chaturongakul ve Boor, 2006; Chan ve ark., 2007). Bu ürünlerde düşük sıcaklıklarda bile gelişebildiğinden imhası için hızlı ve uygun bir metot uygulanmadığı sürece özellikle et endüstrisi için bir tehdit oluşturmaktadır. Diğer patojen mikroorganizmalarla karşılaştırıldığında gıda işlenmesi sırasında çevresel ve gıda kaynaklı faktörlerle kontrolü ve imhası biraz zordur. L. monocytogenes’in
3
pastörizasyon sıcaklığı ile imha olduğu belirtilmesine karşın son zamanlarda bu bakterinin ısıl işleme dayanıklılığı hususunda çelişkiler bulunmaktadır. Bazı kaynaklarda spor oluşturmayan bakteriler içinde en yüksek termotolerant bakteri olduğu belirtilmektedir (Jemmi ve Stephan, 2006; Kim ve ark., 2008).
Satın aldıkları ürünlerin bileşenlerini inceleyen bilinçli tüketici sayısının giderek arttığı bu günlerde tüketiciler az işlenmiş ve kimyasal koruyucu içermeyen gıdalara yönelmiştir (Lopez ve Belloso, 2008). Tüketici talepleri doğrultusunda endüstride; gıda güvenliğini tehlikeye atmadan, gıdanın besin ve vitamin değerlerini, organoleptik özellikleriyle birlikte koruyarak raf ömrünü uzatan biyokoruyucuların kullanımına ilgi artmıştır. Gıdaların depolama ömrünü ve güvenliğini artırmak amacıyla laktik asit bakterileri (LAB) veya bunların ürettiği inhibitör maddelerin kullanılmasına biyokoruma tekniği denilmektedir (Soomro ve ark., 2002; Devlieghere ve ark., 2004).
Buzdolabında muhafaza edilen ürünlerde patojen ve bozulma etmeni mikroorganizmaların gelişiminin kontrol edilmesinde doğal bir metot olduğundan en çok tercih ve kabul edilen yöntemlerden birisi biyokorumadır. Gıdaların raf ömrünün uzaması ve gıda güvenliğinin artması yönünde koşullar yaratan biyokoruma yöntemi ette doğal olarak bulunan mikroorganizmalar veya bu mikroorganizmaların ürettiği antimikrobiyal ürünler vasıtasıyla gerçekleşmektedir. Ette ve diğer gıdalarda bulunan laktik asit bakterilerinden bazıları bakteriyosin olarak bilinen antimikrobiyal peptitler veya proteinler üretmektedirler. Depolanmış ette doğal flora olarak bulunan laktik asit bakterileri Lactobacillus, Carnobacterium, Leuconostoc, Lactococcus ve diğer cinslerdir. Bakteriyosin üretici laktik asit bakterilerinin Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Streptococcus, Lactococcus, Enterococcus ve Carnobacterium olduğu düşünülürse, söz konusu bakteriyosinojenik laktik asit bakterilerin kullanılması ile koruyucu bir etki yaratılabilir. Bakteriler tarafından üretilen protein yapısındaki bakteriyosinler, duyarlı bakterilere karşı bakterisidal veya bakteriyostatik etki göstermektedirler. Duyarlı hücrelerin stoplazmik membranı bakteriyosinlerin hedef noktasını oluşturmaktadır. Doğal kaynaklı olmaları, insan ve hayvan bağırsak sisteminde kolayca parçalanmaları ve korunacak gıdaların fizikokimyasal yapılarında herhangi bir değişime neden olmaksızın bozulma ve hastalık etmeni bakterileri inhibe etme özellikleri ile bakteriyosinler, özellikle son yıllarda üzerinde çok fazla çalışılan bir
konu haline gelmiştir (Jack ve ark., 1995; Cleveland ve ark., 2001; O’Sullivan ve ark., 2002; Chen ve Hoover, 2003; Cotter ve ark., 2005; Fimland ve ark., 2005; Deegan ve ark., 2006; Drider ve ark., 2006).
Daha önce bozadan elde edilen Lactococcus lactis ssp. lactis BZ’nin bakteriyosin üreticisi olduğu tespit edilmiş ve bakteriyosini karakterize edilmiştir. Laktokoksin BZ’nin Gram pozitif bakterilerden L. plantarum, E. faecium, E. feacalis, E. dissduens,
Leu. mesentereoides, L. cremoris, Listeria monocytogenes, L. ivonovi, Bacillus cereus, B. subtilis ve B. treungesis ssp. plasteni ile Gram negatif bakterilerden Enterobacter cloaceae, E. coli, Rhodococcus equi, Salmonella ssp., Salmonella enteritidis, Yersinia
enterocolitica O:9 ve Citrobacter freundii’ye karşı inhibitör aktiviteye sahip olduğu
belirlenmiştir (Şahingil ve ark., 2011). Laktokoksin BZ tek başına besiyerinde oldukça geniş bir antimikrobiyal spektruma sahiptir. Ancak laktokoksinin et ürünlerinde patojen bakteriler üzerine inhibitör etkisi bilinmemektedir. Dolayısıyla bu araştırmanın gerçekleştirilmesi durumunda laktokoksinin biyokoruyucu olarak taze et endüstrisinde kullanım olanakları ortaya konulmaya çalışılacaktır.
Bu çalışmanın amaçları (i) Lactococcus lactis ssp. lactis tarafından üretilen laktokoksin BZ bakteriyosininin taze sığır etinin mikrobiyolojik kalitesi üzerine etkisinin belirlenmesi, (ii) taze ete inoküle edilen gıda kaynaklı patojen bakterilerden Listeria
5
2. KAYNAK ÖZETLERİ
Laktik asit bakterileri (LAB); gram pozitif, hareketsiz, spor oluşturmayan, çubuk ve koklar şeklinde, katalaz negatif, mikroaerofilik, aerotolerant, fakültatif anaerobik, aside dayanıklı, nitratı indirgemeyen, karbonhidratları ve yüksek alkolleri fermente ederek başlıca son ürün olarak laktik asit üreten doğal bir gruptur (Beasley, 2004).
LAB grubu içerisinde; Lactococcus, Carnobacterium, Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Tetragenococcus, Streptococcus, Weissela, Vagococcus, Enterococcus ve Lactosphaera cinsleri yer almaktadır (Kuipers ve ark., 1997; O’Sullivan ve ark., 2002; Galvez ve ark., 2007). LAB ekosistemde yaygın olup toprak, su, bitki ve hayvanlarda bulunur. Ayrıca fermente olmayan süt ürünleri, et ürünleri, su ürünleri, meyve ve sebzelerde, insan ve hayvan bağırsak ve solunum sistemlerinde doğal olarak bulunur (Beasley, 2004; Thevenot ve ark., 2006). Et ve et ürünlerinden izole edilen laktik asit bakteri cinsleri Lactobacillus (Lactobacillus sakei, Lb. curvatus ve Lb. plantarum), Pediococcus (P. acidilactici, P. pentosaceus), Leuconostoc (Leu. mesenteroides ssp.
mesenteroides, Leu. gelidum, Leu. carnosum), Carnobacterium ( C. piscicola, C. divergens), Weissella, Enterococcus (E. faecalis, E. faecium)’dur (Hugas 1998). Vakum
paketlenmiş et ürünleri gibi fermente olmayan gıdalarda depolama sırasında laktik asit bakterileri baskın mikroflorayı oluşturur. Laktik asit bakterilerinin baskın olmasının et ürünlerinde bozulmaya neden olduğu belirtilmektedir. Fakat aynı zamanda laktik asit bakterilerinin et ürünlerinin duyusal özelliklerini depolama boyunca koruduğu da ifade edilmektedir (Budde ve ark., 2002).
LAB, fermentasyon sırasında oluşturdukları metabolitleriyle gıda kaynaklı patojenleri ve gıdalarda bozulmaya neden olan bakterileri inhibe ederek antagonistik aktivite göstermektedir (Chen ve Hoover, 2003; De Vuyst ve Leroy, 2007). Laktik asit bakterileri antagonistik aktivitelerini, ortamda besin maddeleri için rekabet ederek ya da ürettikleri metabolitleriyle sağlamaktadırlar. Laktik asit bakterilerinin ürettiği antimikrobiyal aktiviteye sahip metabolitler organik asitler, diasetil, asetaldehit, reuterin, hidrojen peroksit, CO2, yağ asitleri, etanol, enzimler ve bakteriyosinlerdir. Bu
bileşiklerden uygulama alanına sahip olanlar bakteriyosinler, organik asitler ve reuterindir. Bu antimikrobiyal metabolitler içinde en önemlilerinden birisi
bakteriyosinlerdir (Khalid ve ark., 1999; Soomro ve ark., 2002).
2.1. Bakteriyosinin Tanımı
Laktik asit bakterileri tarafından üretilen bakteriyosinler, ribozomal olarak sentezlenen, küçük katyonik, hidrofobik veya amfifilik karakterli antimikrobiyal peptidler ve/veya proteinlerdir. Aynı veya farklı cins veya türdeki suşlar üzerinde antimikrobiyal aktiviteye sahiptir. LAB’lerinden Enterococcus, Lactococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc, Corynebacterium cinslerinin bakteriyosin üretme yeteneğine sahip olduğu birçok araştırmacı tarafından ortaya konmuştur (Klaenhammer 1993; Cleveland ve ark., 2001; Chen ve Hoover, 2003; Rodriguez ve ark., 2003). Et ve ürünlerinden izole edilen bakteriyosinojenik LAB’lerine bazı örnekler Çizelge 2.1’de verilmiştir.
Bakteriyosinler, bakteriler tarafından üretilen protein yapısında bakterisidal veya bakteriyostatik etkiye sahip doğal antimikrobiyal bileşiklerdir. Antimikrobiyal etkilerinden dolayı gıda kaynaklı patojenleri ve bozulma etmeni mikroflorayı inhibe etmede önemli rol oynamaktadırlar. Bu özelliklerinden dolayı bakteriyosin üreten laktik asit bakterileri veya saflaştırılmış bakteriyosinleri gıda muhafaza sistemlerinde biyolojik koruyucu olarak büyük bir kullanım potansiyeline sahiptir (De Martinis ve ark., 2002).
Bakteriyosinler doğal antibiyotik olarak nitelenmekle birlikte, klasik antibiyotiklerden farklı olarak mide ve ince bağırsaktan geçerken proteazlar tarafından aminoasitlere parçalanmaktadırlar. Bu nedenle vücutta absorbe edilmezler ve kalın bağırsak florasına ulaşamazlar. Dolayısıyla bakteriyosinler doğal olmaları, insan ve hayvan bağırsak sisteminde kolayca parçalanmaları ve korunacak gıdaların fizikokimyasal yapılarında herhangi bir değişime neden olmaksızın bozulma ve hastalık etmeni bakterileri inhibe etme özellikleriyle son yıllarda üzerinde çok fazla çalışılan bir konu haline gelmiştir.
2.2. Bakteriyosinlerin Sınıflandırılması
Yapısal, fizikokimyasal ve moleküler özellikler temelinde laktik asit bakterileri tarafından üretilen bakteriyosinler 4 ana gruba ayrılmaktadır. Sınıf I lantibiyotikler lanthionin gibi anormal amino asit içerirler. Ribozomda sentezlendikten sonra
7
sitoplazmada dehidrasyon gibi reaksiyonlara uğrarlar. Molekül ağırlıkları düşüktür (5kDa’dan küçük) ve ısıya dayanıklıdırlar. Bu grubun en önemli bakteriyosini nisindir. Sınıf II bakteriyosinleri sınıf I’e benzer ancak anormal amino asitleri içermemektedirler. Molekül ağırlıkları 10 kDa’dan küçüktür. Güçlü antilisterial aktivite gösteren pediosin benzeri bakteriyosinler bu grupta yer alır. Sınıf II bakteriyosinleri 3 alt grup altında toplanmaktadır. Sınıf IIa pediosin benzeri veya Listeria’ya karşı aktif olup N-terminalinde Try-Gly-Asn-Gly-Val-Xaa-Cys amino asit dizisi içermektedir. Grup IIb bakteriyosinlerinin aktivite gösterebilmeleri için genellikle iki farklı peptid gerekmektedir. Grup IIc bakteriyosinlerine thiol’la aktif olan peptidler denilmektedir. Sınıf III bakteriyosinleri büyük moleküllü ve ısıya karşı dayanıklılıkları değişkendir. Enzimatik aktiviteyle hücre duvarını parçalayarak inhibitör etki gösterir. Sınıf IV bakteriyosinleri proteine ilave olarak esansiyel lipit ve karbonhidrat içerir, kompleks ve halkalı peptidlerdir. Bu grupta yer alan glikoproteinler ya da lipoproteinler aktiviteleri için protein doğasında olmayan yapılara ihtiyaç duymaktadırlar (Klaenhammer, 1993).
Çizelge 2.1. Et ve ürünlerinden izole edilen bakteriyosinojenik LAB’leri
Üretici Suş Bakteriyosin Kaynak
L. lactis BB24 Nisin Fermente sosis
Lb. brevis SB27 Brevisin 27 Fermente sosis
Lb. sakei LTH673, 674 Sakasin K, P İnek eti
Lb. curvatus CRL705 Lactosin 705 Fermente sosis
Leu. gelidum UAL187 Leukosin A Vakumlanmış et
Leu. mesenteroides TA33a Leukosin A Vakumlanmış et
P. acidilactici PAC1.0 Pediosin PA-1/AcH Amerikan tip sosis
C. piscicola LV17B Karnobakteriyosin B2 Vakumlanmış et
C. divergens 750 Divergisin 750 Vakumlanmış et
E. faecium CTC492 Enterosin B Fermente sosis
E. casseliflavus IM416K1 Enterosin 416K1 Fermente sosis
Cleveland ve ark., 2001; McAuliffe ve ark., 2001; Chen ve Hoover, 2003; Rodriguez ve ark., 2003; Cotter ve ark., 2005; Heng ve Tagg, 2006).
2.3. Bakteriyosinlerin Antimikrobiyal Etki Mekanizmaları
Bakteriyosinlerin çoğu duyarlı bakterilerin membranlarında gözenekler oluşturarak (Barrel Stave, Wedge veya Lipit II mekanizmalarla) potasyum ve inorganik fosfat sızmasına ve buna paralel olarak membran iyonik dengesinin bozulmasına, proton itici gücün yok olmasına neden olmaktadır (Şekil 2.1). Bunun sonucunda ATP sızması olur transmembran potansiyeli ve/veya pH gradienti kısmen veya tamamen yok olur, proton itici güç ortadan kalkar (Cleveland ve ark., 2001; Papagianni, 2003; Chen ve Hoover, 2003). Hücre içinde iyonların ve metabolitlerin birikmesi ile ATP sentezi gibi sitoplazmik membranda enerjiye bağlı birçok hayati işlemleri yürüten proton itici gücün ortadan kalkması veya bozulması direkt olarak hücrenin lize olmasına neden olmaktadır (McAuliffe ve ark., 2001). Bu şekilde antimikrobiyal aktivite gösteren bakteriyosinlere sınıf I, sınıf II bakteriyosinleri örnek olarak gösterilebilir. Bunun yanı sıra bazı bakteriyosinler özellikle sınıf I tip Ib hücre duvarı (peptidoglukan) sentezini önleyerek (Diep ve ark., 2007), sınıf III bakteriyosinleri ise hücre duvarını parçalayarak bakterileri lize etmektedir. Sınıf I bakteriyosinlerinden nisin hem lipid II’ye bağlanarak sitoplazmada sentezlenen peptidoglukan ünitelerinin taşınmasına engel olarak bakteri hücre duvarı sentezini önleyerek hem de membranda gözenekler oluşturarak duyarlı bakterileri inhibe etmektedir (Şekil 2.1) (Cotter ve ark., 2005; Lopez ve Belloso, 2008).
9
2.4. Bakteriyosinlerin Etki Spektrumları
Bakteriyosinlerin etki spektrumları çok geniş olmayıp suş spesifik özellik göstermektedirler (O’Sullivan ve ark., 2002). Laktik asit bakterileri tarafından üretilen bakteriyosinler genellikle Gram pozitif bakteriler (Listeria, Staphylococcus, Clostridium, Enterococcus, Bacillus, Micrococcus, Leuconostoc, Lactobacillus vb.) üzerinde inhibitör aktiviteye sahiptirler (Soomro ve ark., 2002; Mojgani ve ark., 2006). Ancak, son yıllarda Enterococcus, Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc’un bazı suşları tarafından üretilen bazı bakteriyosinlerin Gram pozitif bakterilerinin yanı sıra Gram negaif bakterilere karşı inhibitör aktivite gösterdikleri belirlenmiştir (Ivanova ve ark., 2000; Lee ve Paik, 2001; de Kwaadsteniet ve ark., 2005; Todorov ve Dicks, 2005; Todorov ve Dicks, 2006; von Mollendorff ve ark., 2006; Todorova ve ark., 2007; Şahingil ve ark., 2011).
Gram negatif bakteriler dış membranlarından dolayı antimikrobiyal maddelere karşı daha az geçirgendir. Duyarlı olmayan Gram negatif bakterilerin şelatlaştırıcı maddeler, ısı ve donma işlemlerine maruz bırakıldıkları zaman bakteriyosinlere karşı duyarlı hale geldiği tespit edilmiştir (Galvez ve ark., 2007).
2.5. Laktokokların ve Laktokoksin BZ’nin Genel Özellikleri
Streptococcaceae familyasında yer alan Lactococcus cinsi L. garvieae (E. serolicida),
L. piscium, L. plantarum, L. raffinolactis (S. raffinolactis) ve L. lactis olmak üzere 5
farklı tür içermektedir. L. lactis türü de L. lactis ssp. cremoris, L. lactis ssp. hordniae (Lactobacillus hordniae) ve L. lactis ssp. lactis (Lactobacillus xylosus, Streptococcus
lactis) suşlarından oluşmaktadır. L. lactis iki alt tür ( L. lactis ssp. lactis, L. lactis ssp.
cremoris) ve bir biyovaryete (L. lactis ssp. lactis biovar. diacetylactis)’ye sahiptir
(Samarzija ve ark., 2001; Sakala ve ark., 2002).
Laktokoklar bakteriyosin üreticileridir. Laktokoklar tarafından üretilen bakteriyosinler genellikle sınıf I ve sınıf II bakteriyosinleri içinde yer alır ve bunlara örnek olarak nisin, laktokoksin R, laktokoksin 140, laktokoksin MMT24 ve laktisin 3147 verilebilir (Parente et al., 1994; Yıldırım ve Johnson 1998; Hill et al., 1999; Ghrairi et al., 2005). LAB bakteriyosinleri içinde en iyi tanımlanmış ve en yaygın kullanım alanına sahip
olan, bazı L. lactis ssp. lactis suşları tarafından üretilen nisindir. Nisinin antimikrobiyal spektrumu oldukça geniş olup Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Pediococcus, Leuconostoc, Micrococcus, Staphylococcus, Clostridium ve Listeria cinslerinin birçok türü ve suşu üzerinde antimikrobiyal aktiviteye sahiptir (Hauben ve ark., 1996).
Laboratuarımızda Tokat piyasasında satışa sunulan Boza’dan izole edilen L. lactis ssp.
lactis’in ürettiği laktokoksin BZ papain, pepsin, tripsin ve β -merkaptoetanole karşı
duyarlı, ancak pankreatin, katalaz, amilaz ve lipaz enzimlerine, organik çözücülere (etanol, metanol, hegzan, kloroform, aseton, etil eter, isopropil alkol, formaldehit), deterjanlara (sodyumdodesil sülfat, üre, tween 80, triton X-100) ve EDTA’ya karşı dayanıklıdır. Laktokoksin BZ’nin antimikrobiyal spektrumu geniş olup birçok Gram-pozitif ve Gram-negatif patojen bakterilere karşı inhibitör aktiviteye sahiptir. Laktokoksin BZ Lactobacillus, Enterococcus, Leuconostoc, Listeria, Bacillus,
Enterobacter, Esherichia, Rhodococcus, Hafniai, Salmonella, Yersinia,
Camphylobacter ve Citrobacter’in bazı suşlarına karşı inhibitör etki göstermektedir.
Laktokoksin BZ yüksek ısıl işleme (90°C’de 30 dk), asidik ve nötral pH’lara (pH 2,0-9,0) karşı dayanıklı olup -20 ve -80°C’de depolama koşullarında uzun süre aktivitesini
korumaktadır. Laktokoksin BZ’nin molekül ağırlığı yaklaşık 5500 Da’dur. Besiyeri olarak MRS broth, inokülüm miktarı %0,1, besiyeri başlangıç pH’sı 6,0-7,0 ve inkübasyon sıcaklığı 25°C olduğu zaman L. lactis ssp. lactis BZ’nin maksimum düzeyde laktokoksin BZ ürettiği belirlenmiştir. Laktokoksin BZ, üretici bakterinin logaritmik gelişme fazında üretilmeye başlanmakta ve durgun fazın başında üretimi maksimum düzeye ulaşmaktadır (Şahingil ve ark., 2011)
2.6. Et Endüstrisinde Bakteriyosinojenik Laktik Asit Bakterileri ile Bakteriyosinlerinin Önemi ve Fonksiyonları
LAB’leri et ve et ürünlerinde bozulmaya neden oldukları gibi fermente et ürünlerinde starter ve koruyucu kültür olarak da kullanılmaktadırlar. Ticari et starter kültürlerinde yer alan LAB türleri; Lactobacillus sakei, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus
plantarum, Lactobacillus pentosus, Lactobacillus casei, Pediococcus pentosaceus ve
Pediococcus acidilactici’dir. LAB’leri son ürünün duyusal özellikleri ve güvenirliğini
11
ve diğer antimikrobiyal bileşenler bozulma etmeni ve patojen mikrofloranın gelişimini önleyici etkiye sahiptir. Gelişen asitlik rengin stabilizasyonu ve tekstürü iyileştirici etkilere de sahiptir. Fermantasyon sırasında oluşturdukları organik asitler, uçucu (alkol, keton, aldehit ve furanlar) ve uçucu olmayan bileşikler (amino asitler, peptitler vb.) ile lezzet, tat ve koku üzerinde etkilidirler (Hugas and Monfort, 1997; Lucke, 2000; Olaoye ve Onilude, 2009).
Et ürünlerin asidifikasyonu sırasında LAB’leri et proteinlerinin koagulasyonuna neden olarak son ürünün kesme stabilitesi ve sertliğinin artmasına neden olmaktadır. Nitritin nitrik aside indirgenmesine neden olarak etin tipik kırmızı-pembe renginin korunmasında rol oynar. Nitrik oksit miyoglobulinle reaksiyona girmektedir. pH değerinde hızlı bir azalış sosis ve sucukta biyojen aminlerin birikmesini de önlemektedir. Ancak, aşırı asit oluşumu renk hatalarına (koagulaz-negatif Staphylococ’lar) ve bazen de gaz oluşumuna neden olabilmektedir (Hugas and Monfort, 1997; Lucke, 2000).
LAB’lerin taze et ve ürünlerinde neden oldukları önemli bozulmalar: Lactobacillus,
Enterococcus, Weissella’nın neden olduğu mukoz madde (yapışkan yüzey); Weisella,
Leuconostoc, Enterococcus, Lactobacillus’un neden olduğu H2O2 yeşillenmesi;
Lactobacillus, Enterococcus, Leuconostoc’un neden olduğu ekşime; heterofermantatif
LAB’lerin (bazı Lactobacillus’lar ve Leuconostoc’lar) neden olduğu gaz oluşumudur (Nychas ve ark., 2008).
Taze ette antimikrobiyal aktiviteye sahip laktik asit bakterileri Şekil 2.2’de görüldüğü gibi koruyucu kültür olarak, fermantat olarak ya da bu fermantatın saflaştırılmasıyla elde edilen bakteriyosin gibi antimikrobiyal bileşiklerin ilave edilmesi şeklinde kullanılır.
Gıdaya sadece patojen ve bozulma etmeni mikroorganizmaları öldürmek ve ürünün raf ömrünü uzatmak amacıyla katılan antagonistik kültürlere koruyucu kültür denilmektedir. Taze et için koruyucu LAB kültürleri oluştururken göz önünde bulundurulması gereken hususlar;
Şekil 2.2. Antimikrobiyal aktiviteye sahip LAB’lerin taze ete uygulanma şekilleri
a) Et kaynaklı laktik asit bakterilerinin koruyucu kültür olarak kullanılmaları daha uygundur. Çünkü, ortama daha kolay adapte olup çoğalarak doğal flora ile rekabet edebilirler.
b) GRAS statüsünde olup sağlık riski oluşturmamalıdır.
c) Soğukta muhafaza sırasında yeterli miktarda laktik asit ve bakteriyosin gibi antimikrobiyal bileşikler oluşturarak patojen ve bozulma etmeni bakterilerin gelişimini önleyen psikrotrof laktik asit bakterileri seçilmelidir.
d) Et ve ürünlerinin duyusal özelliklerinde hiç veya çok az değişime neden olmalıdır.
e) Sürekli koruyucu aktiviteye sahip olmalıdır.
f) İstenmeyen mikroorganizmalarla rekabet edebilmelidir.
Et endüstrisi için geliştirilmiş ticari biyokoruyucu kültürlere örnek olarak Lactobacillus
sakei, Lactobacillus curvaticus, Leuconostoc carnosum’u içeren SafePro kültürleri
(Chr. Hansen, Danimarka) (Anonim, 2012a), Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus
crispatus, Pediococcus acidolactici, Lactococcus lactis’den oluşan Bovamine kültürleri
(NPC, USA) verilebilir (Anonim, 2012b).
LAB’lerinin üretmiş oldukları antimikrobiyal aktiviteye sahip bileşiklerden uygulama alanına sahip olanlar; organik asitler, bakteriyosinler ve reuterindir. Bu antimikrobiyal bileşikler saf, yarı saf veya saflaştırılmamış şekilde koruyucu madde olarak ete veya ambalaj materyaline ilave edilerek kullanılabilir. Ancak, saf ya da yarı saf halde
13
kullanılmaları durumunda yasal düzenlemeler gerektiğinden çok tercih edilen bir yöntem değildir. En çok tercih edilen yöntem gıda bazlı ortamda (dektroz, şeker pancarı melası, süt, peynir altı suyu vb.) laktik asit bakterilerini geliştirip antimikrobiyal madde içeren fermantatı sıvı veya toz halde kullanmaktır. Ticari olarak üretilen MicroGARD® (Danisco, Danimarka) antimikrobiyal fermantata örnek olarak verilebilir. Et için uygun MicroGARD® 730’dur. Propionobacterium shermani’nin fermantatı olup
antimikrobiyal maddelerden asetik asit, propiyonik asit ve bakteriosin içermektedir. Gram-pozitif ve Gram–negatif bakteriler, mayalar ve küfler üzerinde etkilidir. FDA tarafından onaylanmıştır. Avrupa ve Amerika’da kullanımına izin verilmiştir (Anonim, 2012c).
Gıdalarda bakteriyosin uygulaması; raf ömrünü uzatması, uygun olamayan sıcaklık koşullarında ekstra koruma sağlaması, gıda zincirinde patojenlerin yayılımını azaltması, bozulmalardan kaynaklanan ekonomik kayıpları iyileştirmesi, kimyasal koruyucuların kullanımını azaltması, yüksek sıcaklık uygulamaları olmadığı için gıdaların besin değerlerini ve vitaminlerini, organoleptik özellikleriyle birlikte daha iyi koruması gibi avantajlar sağlamaktadır (Galvez ve ark., 2007).
Laktik asit bakterileri tarafından üretilen bakteriyosinlerin; doğal ve güvenli (GRAS statüsü) olmaları, ökaryotik hücreler üzerinde toksik etkiye sahip olmamaları, sindirim sisteminde proteolitik enzimler vasıtasıyla inaktif olmaları, genel olarak geniş pH ve sıcaklık aralığında biyolojik aktivitelerini korumaları, birçok gıda kaynaklı patojenleri ve bozulma etmeni mikroorganizmalara karşı antimikrobiyal aktiviteye sahip olmaları ve korunacak gıdaların fiziko-kimyasal yapılarında herhangi bir değişime neden olmadıkları için önemli biyokoruyuculardır (Galvez ve ark., 2007). Bakteriyosinlerin doğal gıda koruyucuları olarak kullanımını sınırlayan faktörler; genelde bozulma etmeni Gram-negatif bakteriler ile maya ve küflere karşı etkisiz olmaları veya çok az etkili olmaları ve söz konusu bakteriyosine duyarlı olmayan suşların ortamda gelişerek baskın hale geçmesi şeklinde sıralanabilir. Sonuncu faktör özellikle uzun süre depolanan gıdalar için önemli bir sorun olarak değerlendirilmektedir (O’Sullivan ve ark., 2002).
Kullanımına yasal açıdan bir gıda katkı maddesi olarak izin verilen ilk bakteriyosin nisindir. 1928’de bulunan nisin bugün yaklaşık 50 ülkede birçok gıdada biyokoruyucu
olarak kullanılmaktadır. Nisin çoğu laktik asit bakterileri ile gıda kaynaklı patojen ve bozulma etmeni bakteriye örneğin S. aureus, L. monocytogenes, Bacillus ve Clostridium karşı bakterisidal etkiye sahiptir (Soomra ve ark., 2002; Uehara ve Toride, 2006; Lopez ve Belloso, 2008; Ruiz-Larrea ve ark., 2010).
2.7. Ette Bakteriyosin Kullanımıyla İlgili Olarak Yapılan Araştırmalar
Yasal açıdan ilk kullanımına izin verilen bakteriyosin Lactoccocus lactis ssp. lactis tarafından üretilen nisin bugün günümüzde yaygın olarak bir çok gıdada kullanılmaktadır (Delves-Broughton ve ark., 1996). Ticari ismi nisaplindir. Bunun dışında Pediococcus acidilactici’nin sentezlediği pediosin PA-1/AcH’de ticari olarak üretilmekte (Alta) ve Avrupa’da yaygın olarak kullanılmaktadır. Nisinin taze ette uygulanabilirliği ile ilgili birçok çalışma mevcuttur. Araştırma sonuçları arasında çelişkiler mevcuttur. El-Khateib ve ark. (1993) ile Fang ve Lin (1994) et yüzeyine nisin uygulandığında L. monocytogenes sayısını etkili bir şekilde azalttığını belirtmesine karşın bir çok araştırmacı nisinin ette L. monocytogenes dahil olmak üzere patojen ve bozulma etmeni mikroorganizmalar üzerinde çok etkili olmadığını ifade edilmektedirler (Scott ve Taylor, 1981; Deegan ve ark., 2006; Taylor ve ark., 2007). Etin pH değerinde nisinin çözünürlüğünün düşük olması ve hidrofobisitesinin yüksek olması nisinin ette kullanımını sınırladığı (Stiles ve Hastings, 1991) ve hatta taze ette doğal olarak bulunan glutatiyon S-transferaz enzimi ve proteazların nisini inaktif ettiğinden bu bakteriyosinin taze ette kullanımını sınırladığı bazı araştırmacılar tarafından ortaya konulmuştur (Rose ve ark., 2000). Nisin dışında pentosin 31-1 (Lactobacillus pentasus 31-1)’in domuz etinde (Zhang ve ark., 2010), plantarisin UG1 (Lactobacillus plantarum UG1)’in sığır etinde (Enan ve ark., 2002) L. monocytogenes ve diğer mikroorganizmaların gelişmesini biraz yavaşlatmalarına karşın etkin bir şekilde azaltmadığı da ortaya konmuştur.
L. monocytogenes ve Cl. perfringens’e karşı Pediococcus acidilactici tarafından üretilen
bakteriyosinin inhibitör etkisinin araştırıldığı bir çalışmada 21o
C’de 72 saat depolama sonrasında bakterilerin sayısında sırasıyla 1,2 ve 3 log’luk, 4o
C’de 21 gün depolama sonununda ise 2,5 ile 3,5 log’luk bir azalma olduğu belirtilmektedir (Lozano ve ark., 2005).
15
Nielsen ve ark. (1990) küp şeklinde kesilen (0,5 cm kalınlığında) ve gama ışını ile radrasyona (42 kGy) tabi tutulup sterilize edilen taze etleri, L. monocytogenes ile inoküle (yaklaşık 104
ve 107 kob/g) edip Pediococcus acidiactici’nin ürettiği bakteriyosinin bakterinin ete tutunma aşamasında ve tutunduktan sonraki aşamada inhibisyon etkisi araştırmışlardır. Araştırma sonucunda bakteriyosinin 10 dk içerisinde 107 kob/g ete tutunan L. monocytogenes sayısında 500 AU/mL kullanıldığında 1 log’dan az, 1000 AU/mL’de 1 log’dan biraz fazla, 5000 AU/mL’de ise 2 log azalttığı bulunmuştur. Listeria sayısındaki azalmanın ilk 2 dk içerisinde gerçekleştiği belirtilmiştir. Yaklaşık 104
kob/g düzeyinde L. monocytogenes içeren et örneklerinde ise bütün bakteriyosin konsantrasyonlarında 1 ile 2 log düzeyinde azalma olduğu ifade edilmiştir. Bakteriyosinin ete tutunma aşamasında 107
kob/g düzeyde listeria içeren et örneklerinde düşük (500 AU/mL) düzeyde uygulandığında yaklaşık 1 log, yüksek düzeyde (1000 ve 5000 AU/mL) uygulandığında ise 2 log’luk bir azalmaya neden olduğu belirlenmiştir. Düşük düzeyde listeria (105
kob/g) ile muamele edilen et örneklerinde bakteriyosin 500 AU/mL uygulandığında 1 log’dan fazla, yüksek düzeyde uygulandığında ise listeria sayısını tespit edilemeyecek düzeyin altında düşürdüğü belirlenmiştir. Bakteriyosinin antilisteriyal aktivitesinin bakterinin ete tutunma aşamasında daha yüksek olduğu sonucuna varılmıştır. Ayrıca çalışmada, bakteriyosin ete listeria inokülasyonundan önce uygulandığında antilisteriyal aktivitesinin daha yüksek olduğu da belirlenmiştir. Bakteriyosin 5000 AU/mL düzeyinde ete katıldığında depolamanın 21. gününde 2,7 log, 28. gününde ise 1,2 log’luk, 500 AU/mL kullanıldığında ise yalnızca depolamanın 14. gününde 0,5 log’luk azalmaya neden olduğu gözlenmiştir.
Yapılan bir araştırmada yaklaşık 7 log kob/g düzeyinde L. monocytogenes Scott A ile inoküle edilen sığır etleri nisin ve nisin-EDTA karışımından oluşan çözeltiye 10 dk daldırılmış ve 4°C’de 30 gün vakum altında depolanmışlardır. Depolama sonunda Listeria sayısının 7 log kob/g’dan 2,01 ve 0,99 log kob/g’a düştüğü belirtilmiştir (Zhang ve Mustapha, 1999).
Pediosin PA-1/pediosin AcH (P. acidolactici), karnobakteriyosin (Carnobacterium
piscicola L103), laktosin 705 (Lactobacillus casei) bakteriyosinlerinin ette L.
bakteri sayısında 3-4 log’luk bir azalmaya neden oldukları ve depolama süresince et örneklerinde bakteriyosin aktivitesinin korunduğu belirlenmiştir (Schöbitz ve ark., 1998).
Biftek etler (8 cm uzunluğunda, 1 cm kalınlığında) vakum poşetine konulduktan sonra yaklaşık 103
kob/mL/cm2’ye L. monocytogenes ve 100 AU/mL C. piscicola L103 tarafından üretilen bakteriyosinle inoküle edilmiştir. Daha sonra vakum paketlenip 4oC’de 21 gün depolanmıştır. Bakteriyosinin ette L. monocytogenes gelişimini etkili bir şekilde inhibe ettiği görülmüştür. L. monocytogenes sayısının depolamanın 7. gününde 3,3 log kob/cm2’den 0,6 log kob/cm2’ye düştüğü, 14. günde ise listeria gelişimini tamamen önlediği belirlenmiştir. Ancak, söz konusu bakterinin ette doğal olarak bulunan laktik asit bakterileri üzerinde etkili olmadığı ve dolayısıyla bakteriyosin içeren örneklerin renginde ve tadında 14 gün süresince bir değişimin olmadığı, bu süreden sonra sayıları hızla artan laktik asit bakterilerinden dolayı duyusal özelliklerinin olumsuz yönde etkilendiği bildirilmiştir (Schöbitz et al., 1999).
Vignolo ve ark. (1996) yaptıkları bir çalışmada ısıl işlem uygulanmış (120°C’de 15 dk) ve uygulanmamış stomacherde parçalanan et örneklerini 104
ve 107 kob/mL düzeyinde
Listeria monocytogenes ile inokule ettikten sonra 4200, 8400 ve 16800 AU/mL laktosin
705 ile muamele etmişler ve 20oC’de 24 saat inkübasyon işlemine tabi tutmuşlardır.
Analiz sonucunda laktosin 705’in ısıl işlem uygulanmış ve düşük düzeyde listeria içeren et örneklerinde daha etkili olduğunu bulmuşlardır. Bakteriyosinin inhibitör etkisinin inoküle edilen bakteri düzeyi ile bakteriyosin konsantrasyonuna bağlı olduğunu bulmuşlardır. Laktosin 705’in konsantrasyonu arttıkça L. monocytogenes sayısındaki azalma oranının da o kadar çok arttığını gözlemlemişlerdir.L. monocytogenes düzeyi
107 olan örnekte en yüksek laktosin 705 konsantrasyonun 1 log (%44,74), 104 kob/mL düzeyinde listeria içeren örnekte %93,43 düzeyinde azalma olduğunu bulunmuştur. Laktosin 705’in ısıl işlem uygulanmış ette daha etkili olmasının nedeni ette bulunan proteazların inaktif olmasından kaynaklandığı belirtilmiştir.
L. monocytogenes ile inoküle edilen taze domuz etine 500, 1000 ve 5000 AU/mL
Pediococcus acidilactici’nin ürettiği bakteriyosinin uygulandığında 15°C’de 72 saat
depolanan et örneklerinde listeria sayısında 1, 2 ve 3 log kob/ml düzeyinde azalma olduğu belirlenmiştir. 1000 ve 5000 AU/mL bakteriyosin uygulanan ve 4°C’de 21 gün
17
depolanan örneklerde ise L. monocytogenes sayısında 2,5 ve 3,5 log kob/mL düşme olduğu saptanmıştır (Nieto-Lozana ve ark., 2006).
Pediosin AcH ile yapılan bir çalışmada söz konusu bakteriyosinin ette L.
monocytogenes gelişimini kontrol altına aldığı, 4ºC’de 28 gün depolama sonunda
bakteri sayısında 3 log’luk bir azalmaya neden olduğu ve depolama süresince et örneklerinde bakteriyosin aktivitesinin korunduğu belirlenmiştir (Motlagh ve ark., 1992).
Laktosin 705 (L. casei CRL705, 17000 AU/mL), enterosin CRL35 (E. faecium CRL35, 17000 AU/mL) ve nisin (2000 IU/mL)’in parçalanmış (kıyma haline getirilmiş) et örneklerinde L. monocytogenes (5,89 log kob/mL) üzerindeki antimikrobiyal etkisinin belirlendiği bir çalışmada, her üç bakteriyosinin listeria sayısında yaklaşık 1 log’luk azalmaya neden olduğu bulunmuştur. Ancak, bakteriyosinler kombine olarak kullanıldıklarında daha fazla inhibitör etki gösterdikleri saptanmıştır. En yüksek inhibitör etkiyi içinde nisin bulunan kombinasyonun olduğu ifade edilmiştir. Üç bakteriyosin birlikte kullanıldığında 24 saatlik inkübasyon sonrasında örnekte patojen bakterilere rastlanılmadığı belirtilmiştir (Vignolo ve ark., 2000).
Pediosin PA-1/AcH ve PO2 et yüzeyine uygulandığında L. monocytogens ve
Clostridium perfringenes’i inhibe ettiği saptanmıştır. İnek karkas yüzeyine nisin
uygulandığında aerobik mikroorganizma sayısında 2-2,5 log kob/ml düzeyinde azalmaya neden olduğu ifade edilmiştir (Siragusa, 1995).
Brochothrix thermosphacta, Carnobacterium divergens ve Listeria innocua ile 4
kob/cm2 düzeyinde inoküle edilen taze parça etler su ve nisin püskürtülerek yıkama işlemine tabi tutulmuştur. Araştırma sonucunda, nisin (5000 AU/cm2
) uygulanan örneklerde 0. günde 1,79-3,54 log kob/cm2, 1. günde ise 1,97-3,60 log kob/cm2 azalma olduğu, suyla muamele edilen örneklerde ise bakteri sayısında önemli azalmanın olmadığı (1 log kob/cm2’den daha az) tespit edilmiştir (Cutter ve Siragusa, 1994).
Psikrotrofik ve mezofil bakteri sayısı 3,56 ve 5,34 log kob/mL olan taze parça et
mezofil ve psikrotrof bakteri sayısının kontrol altına alındığı ve %6 laktik asit çözeltisine daldırılan örneklere göre daha düşük olduğu tespit edilmiştir. Kontrol ve laktik asit çözeltisiyle muamele edilen et örneklerinin 9. günde bozulma noktası olarak kabul edilen mezofil bakteri sayısının 7 log kob/mL’den daha yüksek bir düzeye ulaştığı ancak bakteriyosin çözeltisi ile muamele edilen örneğin 15. günde bile bu düzeye ulaşmadığı belirlenmiştir. Bakteriyosin uygulamasının etin raf ömrünü 9 gün arttırdığını saptamışlardır (Fiorentini ve ark., 2001).
Zhang ve ark. (2010) Lactobacillus pentosus 31-1 tarafından üretilen pentosin 31-1’in domuz etinin mikrobiyolojik kalitesini belirlemek amacıyla yaptıkları bir çalışmada et örneklerini L. monocytogenes ve Pseudomonas fluorescens (5x105 kob/mL) ile kontamine ettikten sonra bakteriyosin çözeltisine (40 ve 80 AU/mL) daldırmışlardır. Analiz sonucunda, depolamanın ilk 6 günü içinde pentosinin söz konusu bakterilerin gelişimini düşük düzeyde inhibe ettiği, 18 günlük depolama süresince bakteriyosin uygulanan örneklerde kontrol örneğine göre bakterilerin gelişiminin çok yavaş olduğu bulunmuştur. Araştırmacılar pentosinin 80 AU/mL düzeyinde uygulandığında domuz etinin mikrobiyolojik kalitesini iyileştirdiği sonucuna varmışlardır.
Lactobacillus sakei tarafından üretilen sakasin P’nin tavuk etinde L. monocytogenes
gelişimini inhibe ettiği belirlenmiştir. Sakasin P yüksek dozda (3,5 µg/g) kullanıldığında 4 haftalık depolama süresince inhibitör etkisinin bakteriyostatik, düşük dozda (12 ng/g) kullanıldığında ise L. monocytogenes’in düşük oranda et örneklerinde gelişme gösterdiği belirlenmiştir (Katla ve ark., 2002).
Yapılan başka bir çalışmada nisin tek başına veya ticari olarak mevcut olan et bağlama sistemine (Fibrimex) katılıp inek karkas yüzeyine uygulandığında bozulma etmeni
Brochothrix thermosphacta’nın gelişimini önlediği ve karkasın buzdolabı koşullarında
depolama süresini arttırdığı tespit edilmiştir (Cutter, 1998).
Ariyapitipun ve ark. (2000) nisin (400 IU/ml), düşük moleküler ağırlıklı polilaktik asit (%2, PLA) ve laktik asit (%2, LA) tek başlarına ve nisinle kombine olarak L.
monocytogenes Scott A ile kontamine edilen inek etine uygulayıp vakum
19
PLA-nisin, LA-nisin ve nisinin L. monocytogenes Scott A’ya karşı hemen bakterisidal etki gösterdiği ve sırasıyla kontrol örneğine (5,33 log kob/cm2) kıyasla 1,22, 1,56, 1,57, 1,94, ve 1,64 log’luk azalmaya neden olduğu belirlenmiştir. Depolamanın sonunda söz konusu örneklerde canlı L. monocytogenes Scott A sayısının 1,21, 0,36, 2,21, 0,84 ve 0,89 log kob/cm2olduğu gözlenmiştir.
Lactococcus lactis subsp. lactis tarafından üretilen laktokoksin R 800, 1600 ve 3600
AU/mL düzeyinde Listeria monocytogenes ile inoküle (6,5 log kob/g) edilen tavuk göğsü etine uygulandığında bakterisidal etki gösterdiği saptanmıştır. Buzdolabı koşullarında muhafaza edilen 800 AU/mL laktokoksin uygulanan et örneklerinde 0. ve 21. günde listeria sayısının 1,62 ve 3,62 log azaldığı, 1600 ve 3200 AU/mL uygulanan et örneklerinde ise depolamanın 21 ve 28. günlerinde belirlenemeyecek seviyenin altına düştüğü bulunmuştur. Ayrıca, oda sıcaklığında muhafaza edilen et örneklerinde de listeria sayısında önemli düzeyde azalmaya neden olduğu belirlenmiştir (Yıldırım ve ark., 2007).
3. MATERYAL VE YÖNTEM 3.1. Materyal
3.1.1. Et Örnekleri
Bu çalışmada kullanılan taze sığır eti Tokat’ta bulunan marketlerden temin edilmiş ve aseptik koşullarda mikrobiyoloji laboratuarına getirilmiştir. Araştırma Gaziosmanpaşa Üniversitesi Mühendislik ve Doğa Bilimleri Fakültesi Gıda Mühendisliği Bölümü Gıda Mikrobiyolojisi Laboratuarında yapılmıştır.
3.1.2. Mikroorganizmalar ve Besiyerleri
Bakteriyosin üretici bakteri olarak daha önce laboratuarımızda Boza’dan izole edilen
Lactococcus lactis ssp. lactis BZ (Şahingil ve ark., 2011) kullanılmıştır. Lactococcus
lactis ssp. lactis BZ’nin geliştirilmesinde ve bakteriyosin üretiminde de Mann Rogosa
(MRS) (Fluka, Almanya) besiyeri kullanılmıştır. Test bakterisi olarak Listeria
monocytogenes ve bakteriyosin aktivitesinin belirlenmesinde indikatör bakteri olarak
Lactobacillus plantarum kullanılmıştır. Her iki bakteri de Refik Saydam Hıfzıssıhha
Enstirüsü’nden temin edilmiştir. Lactococcus lactis ssp. lactis BZ ve Lactobacillus
plantarum MRS besiyerinde 32°Cde; L. monocytogenes ise Brain Hearth Infusion (BHI)
(Merck, Almanya) sıvı besiyerinde 35-37°C’de geliştirilmiştir. Çalışmada kullanılan bakteriler -80°C’de %20 gliserol içeren besiyerinde muhafaza edilmiştir.
3.2. Yöntem
3.2.1. Bakteriyosinin Hazırlanması
Lactococcus lactis ssp. lactis BZ %0,1 oranında MRS besiyerine inoküle edilip 32°C’de
inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon işleminden sonra bakteri kültürü 7000 x g’de 20 dk süre ile santrifüj edilip filtrat kısmı toplanıp 0,45 µm gözenek çaplı membran filtresi ile steril edilmiştir. Hücre içermeyen süpernatantın pH’sı 10 N NaOH kullanılarak ayarlandıktan sonra dondurularak liyofilizatörde kurutulmuştur. Hazırlanan bakteriyosin örneği -80°C’de muhafaza edilmiştir.
21
3.2.2. Laktokoksinin Taze Sığır Etinin Mikrobiyolojik Kalitesi Üzerine Etkisi
Laktokoksin BZ’nin taze sığır etinin mikrobiyolojik kalitesi üzerine etkisini belirlemek amacıyla marketten temin edilen etler aseptik koşullarda Gıda Mühendisliği Mikrobiyoloji laboratuarına getirilmiştir. Aseptik koşullarda yaklaşık 5 g ağırlığında (1 cm3 büyüklüğünde) kesildikten sonra steril stomacher poşetlerine konmuştur. Daha sonra et örneklerine farklı konsantrasyonlarda (0, 200, 400, 800, 1600 ve 2500 AU/mL) hazırlanan laktokoksin BZ çözeltisinden 1 mL ilave edilip, buzdolabı koşullarında 12 gün muhafaza edilmişlerdir. Depolamanın belirli periyotlarında örnekler alınıp toplam mezofil ve psikrotrof aerobik bakteri, toplam koliform, fekal koliform, laktik asit bakterisi ve maya-küf analizleri yapılmıştır.
3.2.2.1. Mikrobiyolojik Analizler İçin Örnek Hazırlama
Steril stomacher poşetlerinde bulunan et örneklerine 20 mL peptonlu su eklenip stomacher cihazı (IUL707/470 Instruments, İspanya) kullanılarak 200 devirde 1 dk süreyle homojenize edilmiştir. Elde edilen bu homojenizattan peptonlu su (%1,0) kullanılarak dilüsyonlar hazırlanmıştır.
3.2.2.2. Toplam Mezofil Aerobik Bakteri Sayımı
Besiyeri olarak Plate Count Agar (PCA) (Merck, Almanya) kullanılmıştır. Hazırlanan dilüsyonlardan petri kutularına 0,1 mL aktarılıp yayma plak yöntemiyle ekim yapılmıştır. Petriler 30°C’de 24-48 saat süre ile inkübe edilmiş ve inkübasyon sonunda gelişen koloni sayımı yapılmış ve sonuçlar kob/g olarak verilmiştir (AOAC, 2000).
3.2.2.3. Toplam Psikrotrof Aerobik Bakteri Sayımı
Hazırlanan dilüsyonlardan PCA besiyeri içeren petrilere 0,1 mL aktarılıp yayma plak yöntemiyle ekim yapılmıştır. Petriler buzdolabı sıcaklığında 10 gün inkübe edilmiş ve inkübasyon sonunda gelişen koloniler sayılmıştır (AOAC, 2000).
3.2.2.4. Toplam Koliform ve Fekal Koliform Sayımı
Toplam koliform ve fekal koliform analizi en muhtemel sayım (EMS-3’lü tüp) yöntemi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. EMS yönteminde, durham tüpü içeren Lauryl Sulphate
Tryptose Broth (LSTB) (Merck, Almanya) bulunan 3 tüpe, daha önce hazırlanan örnek dilüsyonlarından 1 mL ilave edilmiş ve tüpler 37°C’de 24-48 saat inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon işlemi sonunda gaz pozitif tüpler belirlenmiş ve EMS tablosu kullanılarak koliform bakteri sayısı hesaplanmıştır. Olasılık testi sonuçlarını kanıtlamak için tüm gaz pozitif tüplerden durham tüpü içeren Brilliant Green Bile Broth (Merck, Almanya) besiyerine öze ile inokülasyon yapılmış ve tüpler 37°C’de 24-48 saat inkübasyona bırakılmıştır. Bu sürenin sonunda EMS tablosu kullanılarak ilk dilüsyonun 1 mL’sinde bulunan kanıtlanmış koliform bakteri sayısı saptanmıştır. Bu değer ilk seyreltmenin dilüsyon faktörü ile çarpılarak örneğin 1 gramında bulunan kanıtlanmış koliform bakteri sayısı hesaplanmıştır. Fekal koliform sayımı yapmak için, toplam koliform analizinde pozitif sonuç veren LSTB tüplerinde içinde durham tüpü bulunan
Escherichia coli (EC) Broth’a öze ile ekim yapılan tüpler 45±0,5°C’de 24-48 saat
inkübasyona bırakılmıştır. Bu sürenin sonunda gaz oluşumu gözlenen tüpler belirlenmiş, EMS tablosu kullanılarak ilk dilüsyonun 1 mL’sinde bulunan olası fekal bakteri sayısı saptanmıştır. Bu değer ilk dilüsyon faktörü ile çarpılarak gıdanın 1 gramında bulunan olası fekal koliform bakteri sayısı hesaplanmıştır (Feng ve ark., 1998).
3.2.2.5. Laktik Asit Bakteri Sayımı
Bu analiz için besiyeri olarak MRS agar kullanılmıştır. Hazırlanan dilüsyonlardan 0,1 mL alınarak MRS agar içeren petrilere yayma plak yöntemiyle ekim yapılmış ve 30°C’de 24-48 saat inkübasyon işlemine tabi tutulmuştur. İnkübasyon işleminin sonunda petri kutularındaki koloniler sayılarak sonuç kob/g olarak verilmiştir (Lee ve ark., 2006).
3.2.2.6. Maya-Küf Sayımı
Maya-küf sayımı için sterilize edilmiş %10 tartarik asit ilave edilen Patato Dextrose Agar (PDA) (Merck, Almanya) besiyeri kullanılmıştır. Hazırlanmış dilüsyonlardan 0,1 mL alınıp PDA içeren petri kutularına aktarılmış ve 28°C’de 4-5 gün süre ile inkübe edilmiştir. İnkübasyon sonunda gelişen tüm koloniler maya-küf olarak sayılıp ifade edilmiştir (Halkman, 2005).
23
3.2.3. Laktokoksin BZ’nin Ete Tutunan L. monocytogenes Üzerine İnhibitör Etkisi
Her bir yüzeyi ekim kabininde UV altında yaklaşık 1’er saat sterilize edilen et örnekleri (yaklaşık 5 g) yaklaşık 107
kob/mL ve 104 kob/mL düzeyinde L. monocytogenes içeren fosfat tamponun içerisine konulup 4 saat süre ile oda sıcaklığında bekletilmiştir. Bu sürenin sonunda örnekler 0, 400, 1600, 3200 AU/mL düzeyinde steril bakteriyosin içeren solusyonlarda 0, 5, 10, 30 dk tutulmuştur. Örnekler steril stomacher poşetine konulup üzerine 20 mL fosfat tamponu ilave edilip stomacher’da 1 dk parçalanmıştır. Yayma plak yöntemi ile Oxford Listeria Selective Agar (Merck, Almanya) besiyerine ekim yapıldıktan sonra 35-37°C’de 24-48 saat inkübe edilmiştir.
3.2.4. Tutunma Esnasında L. monocytogenes’in İnhibisyonu
UV ile sterilize edilen et örnekleri 0, 400, 800, 1600, 3200 AU/mL konsantrasyonlarında hazırlanan bakteriyosin çözeltileri içinde 10 dk bekletilmiştir. Örnekler daha sonra yaklaşık 104
ve 107 kob/mL L. monocytogenes bakteri solusyonunda 0, 5 ve 10 dk tutulmuştur. Bu sürelerin sonunda örnekler alınıp steril stomacher poşetine konularak ve 20 mL fosfat tamponu ilave edildikten sonra stomacher’da 1 dk parçalanmıştır. Yayma plak yöntemi ile Oxford Listeria Selective Agara ekim yapıldıktan sonra 35-37°C’de 24-48 saat inkübe edilmiştir.
3.2.5. Etin Buzdolabında Depolanması Sırasında L. monocytogenes Gelişimi
Üzerine Laktokosin BZ’nin İnhibitör Etkisi
Ekim kabininde UV altında sterilize edilen et örneklerine (yaklaşık 5 g) farklı konsantrasyonlarda L. monocytogenes (0, 102, 103, 104, 106 kob/mL) içeren kültürlerden 1 mL inoküle edilmiştir. İnokülasyondan yaklaşık 30 dk sonra örneklere 0, 200, 400, 800, 1600, 3200 AU/mL konsantrasyonlarında hazırlanan bakteriyosin çözeltisinden 1 mL ilave edilip buzdolabı koşullarında muhafaza edilmiştir. Depolama işleminin belirli periyotlarında (0., 1., 4., 8., 12. gün) örnekler alınıp steril stomacher poşetlerine konulmuştur. Bunu takiben et örneklerine 20 mL fosfat tamponu ilave edilmiş ve stomacher’da 1dk parçalandıktan sonra dilüsyonlar hazırlanmıştır. Oxford Listeria Selective Agar besiyerine yayma plak yöntemi ile ekim yapıldıktan sonra 35-37°C’de 24 saat inkübe edilmiştir.
3.2.6. Depolama İşleminin Bakteriyosin Aktivitesi Üzerine Etkisi
Steril stomacher poşetlerine konulan et örneklerine (yaklaşık 5 g, 1 cm3
) fosfat tamponunda hazırlanan 0, 400, 800, 1600 ve 3200 AU/mL bakteriyosin çözeltilerinden 1 mL ilave edilmiş ve buzdolabında muhafaza edimiştir. Depolamanın 0., 1., 4., 8. ve 12. günlerinde rastgele et örnekleri alınıp yaklaşık 104
-105 kob/mL düzeyinde L.
monocytogenes içeren kültürden 1 mL ilave edilmiş ve 10 dk bekletilmiştir. Daha sonra
et örneklerine 20 mL fosfat tamponu katılıp stomacher’da 1 dk parçalanmış ve dilüsyonlar hazırlanmıştır. Oxford Listeria Selective Agar besiyerine yayma plak yöntemi ile ekim yapıldıktan sonra 35-37°C’de 24 saat inkübe edilmiştir. İnkübasyon işleminin sonunda gelişen koloniler sayılıp sonuç kob/g olarak verilmiştir.
3.2.7. İstatistiksel Analiz
Her bir analiz üç kez yapılıp, ortalamaları hesaplanmıştır. Bakteri sayıları log kob/g olarak ifade edilmiştir. Ortalamaların karşılaştırılması için Tukey testi kullanılmıştır. Veri analizleri SAS istatistiksel paket programı kullanılarak gerçekleştirilmiştir.
25
4. BULGULAR ve TARTIŞMA
4.1. Laktokoksin BZ’nin Taze Sığır Etinin Mikrobiyolojik Kalitesi Üzerine Etkisi
Laktokoksin BZ’nin taze sığır etinin mikrobiyolojik kalitesine etkisini ortaya koymak amacıyla yaklaşık 5 g ağırlığında küp şeklinde kesilen etlere farklı konsantrasyonlarda 0, 200, 400, 800, 1600 ve 2500 AU/mL düzeyinde bakteriyosin uygulanmış ve buzdolabı sıcaklığında (4-5°C) 12 gün depolanmıştır. Depolamanın belirli periyotlarında örnek alınıp canlı toplam mezofilik aerobik bakteri (TMAB), toplam psikrotrof aerobik bakteri (TPAB), toplam koliform (TK), fekal koliform (FK), laktik asit bakteri (LAB) ve maya-küf sayısı belirlenmiştir. Bakteriyosin uygulanmayan et örneği de kontrol olarak kullanılmıştır.
4.1.1. Toplam Mezofil Aerobik Bakteriler Üzerine Etkisi
Analiz sonucunda laktokoksin BZ içermeyen kontrol örneğinde TMAB sayısının 12 günlük depolama süresince arttığı ve bu artışın depolamanın 1. gününden itibaren istatistiki olarak önemli (P<0,001) olduğu belirlenmiştir (Şekil 4.1). Kontrol örneğinin TMAB sayısı 7,23 log kob/g’dan 12,58 log kob/g’a yükseldiği gözlenmiştir. Laktokoksin BZ içeren örneklerde ise uygulanan konsantrasyona bağlı olarak TMAB sayısının azaldığı ve gelişiminin kontrol altına alındığı belirlenmiştir (Şekil 4.1). TMAB sayısındaki azalmanın laktokoksin BZ konsantrasyonunun artmasıyla arttığı belirlenmiştir. Depolamanın birinci gününde 200, 400, 800, 1600 ve 2500 AU/mL uygulanan örneklerde sırasıyla 1,42, 1,52, 1,86, 2,73 ve 3,952 log’luk azalma olduğu ve bu azalmaların da istatistiki olarak önemli (P<0,001) olduğu tespit edilmiştir. Laktokoksin BZ düzeyi 200 AU/mL olan et örneklerinde istatiksel olarak önemli olmasa da (P>0,05) TMAB sayısındaki azalmanın depolamanın 4. gününe kadar, 400 ve 800 AU/mL düzeyinde laktokoksin içeren örneklerde ise 8. gününe kadar devam ettiği, ancak bundan sonraki depolama süreçlerinde TMAB sayısının et örneklerinde düşük düzeyde de olsa arttığı (P>0,05) tespit edilmiştir. Depolamanın 12. gününde 200 AU/mL laktokoksin uygulanan örnekte TMAB sayısının 6,95 log kob/g, 400 ve 800 AU/mL içeren örneklerde 6,11 ve 5,37 log kob/g’a ulaştığı görülmüştür. Verilerden de anlaşılacağı üzere söz konusu örneklerde TMAB sayısının başlangıçtaki et örneklerinin TMAB sayısına (7,23 log kob/g) ulaşmadığı görülmektedir. Laktokoksin düzeyi 1600 ve 2500 AU/mL olan et örneklerinde ise istatiksel olarak önemli (P>0,05) olmasa da
