3.1.1. Et Örnekleri
Bu çalışmada kullanılan taze sığır eti Tokat’ta bulunan marketlerden temin edilmiş ve aseptik koşullarda mikrobiyoloji laboratuarına getirilmiştir. Araştırma Gaziosmanpaşa Üniversitesi Mühendislik ve Doğa Bilimleri Fakültesi Gıda Mühendisliği Bölümü Gıda Mikrobiyolojisi Laboratuarında yapılmıştır.
3.1.2. Mikroorganizmalar ve Besiyerleri
Bakteriyosin üretici bakteri olarak daha önce laboratuarımızda Boza’dan izole edilen
Lactococcus lactis ssp. lactis BZ (Şahingil ve ark., 2011) kullanılmıştır. Lactococcus
lactis ssp. lactis BZ’nin geliştirilmesinde ve bakteriyosin üretiminde de Mann Rogosa
(MRS) (Fluka, Almanya) besiyeri kullanılmıştır. Test bakterisi olarak Listeria
monocytogenes ve bakteriyosin aktivitesinin belirlenmesinde indikatör bakteri olarak
Lactobacillus plantarum kullanılmıştır. Her iki bakteri de Refik Saydam Hıfzıssıhha
Enstirüsü’nden temin edilmiştir. Lactococcus lactis ssp. lactis BZ ve Lactobacillus
plantarum MRS besiyerinde 32°Cde; L. monocytogenes ise Brain Hearth Infusion (BHI)
(Merck, Almanya) sıvı besiyerinde 35-37°C’de geliştirilmiştir. Çalışmada kullanılan bakteriler -80°C’de %20 gliserol içeren besiyerinde muhafaza edilmiştir.
3.2. Yöntem
3.2.1. Bakteriyosinin Hazırlanması
Lactococcus lactis ssp. lactis BZ %0,1 oranında MRS besiyerine inoküle edilip 32°C’de
inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon işleminden sonra bakteri kültürü 7000 x g’de 20 dk süre ile santrifüj edilip filtrat kısmı toplanıp 0,45 µm gözenek çaplı membran filtresi ile steril edilmiştir. Hücre içermeyen süpernatantın pH’sı 10 N NaOH kullanılarak ayarlandıktan sonra dondurularak liyofilizatörde kurutulmuştur. Hazırlanan bakteriyosin örneği -80°C’de muhafaza edilmiştir.
21
3.2.2. Laktokoksinin Taze Sığır Etinin Mikrobiyolojik Kalitesi Üzerine Etkisi
Laktokoksin BZ’nin taze sığır etinin mikrobiyolojik kalitesi üzerine etkisini belirlemek amacıyla marketten temin edilen etler aseptik koşullarda Gıda Mühendisliği Mikrobiyoloji laboratuarına getirilmiştir. Aseptik koşullarda yaklaşık 5 g ağırlığında (1 cm3 büyüklüğünde) kesildikten sonra steril stomacher poşetlerine konmuştur. Daha sonra et örneklerine farklı konsantrasyonlarda (0, 200, 400, 800, 1600 ve 2500 AU/mL) hazırlanan laktokoksin BZ çözeltisinden 1 mL ilave edilip, buzdolabı koşullarında 12 gün muhafaza edilmişlerdir. Depolamanın belirli periyotlarında örnekler alınıp toplam mezofil ve psikrotrof aerobik bakteri, toplam koliform, fekal koliform, laktik asit bakterisi ve maya-küf analizleri yapılmıştır.
3.2.2.1. Mikrobiyolojik Analizler İçin Örnek Hazırlama
Steril stomacher poşetlerinde bulunan et örneklerine 20 mL peptonlu su eklenip stomacher cihazı (IUL707/470 Instruments, İspanya) kullanılarak 200 devirde 1 dk süreyle homojenize edilmiştir. Elde edilen bu homojenizattan peptonlu su (%1,0) kullanılarak dilüsyonlar hazırlanmıştır.
3.2.2.2. Toplam Mezofil Aerobik Bakteri Sayımı
Besiyeri olarak Plate Count Agar (PCA) (Merck, Almanya) kullanılmıştır. Hazırlanan dilüsyonlardan petri kutularına 0,1 mL aktarılıp yayma plak yöntemiyle ekim yapılmıştır. Petriler 30°C’de 24-48 saat süre ile inkübe edilmiş ve inkübasyon sonunda gelişen koloni sayımı yapılmış ve sonuçlar kob/g olarak verilmiştir (AOAC, 2000).
3.2.2.3. Toplam Psikrotrof Aerobik Bakteri Sayımı
Hazırlanan dilüsyonlardan PCA besiyeri içeren petrilere 0,1 mL aktarılıp yayma plak yöntemiyle ekim yapılmıştır. Petriler buzdolabı sıcaklığında 10 gün inkübe edilmiş ve inkübasyon sonunda gelişen koloniler sayılmıştır (AOAC, 2000).
3.2.2.4. Toplam Koliform ve Fekal Koliform Sayımı
Toplam koliform ve fekal koliform analizi en muhtemel sayım (EMS-3’lü tüp) yöntemi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. EMS yönteminde, durham tüpü içeren Lauryl Sulphate
Tryptose Broth (LSTB) (Merck, Almanya) bulunan 3 tüpe, daha önce hazırlanan örnek dilüsyonlarından 1 mL ilave edilmiş ve tüpler 37°C’de 24-48 saat inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon işlemi sonunda gaz pozitif tüpler belirlenmiş ve EMS tablosu kullanılarak koliform bakteri sayısı hesaplanmıştır. Olasılık testi sonuçlarını kanıtlamak için tüm gaz pozitif tüplerden durham tüpü içeren Brilliant Green Bile Broth (Merck, Almanya) besiyerine öze ile inokülasyon yapılmış ve tüpler 37°C’de 24-48 saat inkübasyona bırakılmıştır. Bu sürenin sonunda EMS tablosu kullanılarak ilk dilüsyonun 1 mL’sinde bulunan kanıtlanmış koliform bakteri sayısı saptanmıştır. Bu değer ilk seyreltmenin dilüsyon faktörü ile çarpılarak örneğin 1 gramında bulunan kanıtlanmış koliform bakteri sayısı hesaplanmıştır. Fekal koliform sayımı yapmak için, toplam koliform analizinde pozitif sonuç veren LSTB tüplerinde içinde durham tüpü bulunan
Escherichia coli (EC) Broth’a öze ile ekim yapılan tüpler 45±0,5°C’de 24-48 saat
inkübasyona bırakılmıştır. Bu sürenin sonunda gaz oluşumu gözlenen tüpler belirlenmiş, EMS tablosu kullanılarak ilk dilüsyonun 1 mL’sinde bulunan olası fekal bakteri sayısı saptanmıştır. Bu değer ilk dilüsyon faktörü ile çarpılarak gıdanın 1 gramında bulunan olası fekal koliform bakteri sayısı hesaplanmıştır (Feng ve ark., 1998).
3.2.2.5. Laktik Asit Bakteri Sayımı
Bu analiz için besiyeri olarak MRS agar kullanılmıştır. Hazırlanan dilüsyonlardan 0,1 mL alınarak MRS agar içeren petrilere yayma plak yöntemiyle ekim yapılmış ve 30°C’de 24-48 saat inkübasyon işlemine tabi tutulmuştur. İnkübasyon işleminin sonunda petri kutularındaki koloniler sayılarak sonuç kob/g olarak verilmiştir (Lee ve ark., 2006).
3.2.2.6. Maya-Küf Sayımı
Maya-küf sayımı için sterilize edilmiş %10 tartarik asit ilave edilen Patato Dextrose Agar (PDA) (Merck, Almanya) besiyeri kullanılmıştır. Hazırlanmış dilüsyonlardan 0,1 mL alınıp PDA içeren petri kutularına aktarılmış ve 28°C’de 4-5 gün süre ile inkübe edilmiştir. İnkübasyon sonunda gelişen tüm koloniler maya-küf olarak sayılıp ifade edilmiştir (Halkman, 2005).
23
3.2.3. Laktokoksin BZ’nin Ete Tutunan L. monocytogenes Üzerine İnhibitör Etkisi
Her bir yüzeyi ekim kabininde UV altında yaklaşık 1’er saat sterilize edilen et örnekleri (yaklaşık 5 g) yaklaşık 107
kob/mL ve 104 kob/mL düzeyinde L. monocytogenes içeren fosfat tamponun içerisine konulup 4 saat süre ile oda sıcaklığında bekletilmiştir. Bu sürenin sonunda örnekler 0, 400, 1600, 3200 AU/mL düzeyinde steril bakteriyosin içeren solusyonlarda 0, 5, 10, 30 dk tutulmuştur. Örnekler steril stomacher poşetine konulup üzerine 20 mL fosfat tamponu ilave edilip stomacher’da 1 dk parçalanmıştır. Yayma plak yöntemi ile Oxford Listeria Selective Agar (Merck, Almanya) besiyerine ekim yapıldıktan sonra 35-37°C’de 24-48 saat inkübe edilmiştir.
3.2.4. Tutunma Esnasında L. monocytogenes’in İnhibisyonu
UV ile sterilize edilen et örnekleri 0, 400, 800, 1600, 3200 AU/mL konsantrasyonlarında hazırlanan bakteriyosin çözeltileri içinde 10 dk bekletilmiştir. Örnekler daha sonra yaklaşık 104
ve 107 kob/mL L. monocytogenes bakteri solusyonunda 0, 5 ve 10 dk tutulmuştur. Bu sürelerin sonunda örnekler alınıp steril stomacher poşetine konularak ve 20 mL fosfat tamponu ilave edildikten sonra stomacher’da 1 dk parçalanmıştır. Yayma plak yöntemi ile Oxford Listeria Selective Agara ekim yapıldıktan sonra 35-37°C’de 24-48 saat inkübe edilmiştir.
3.2.5. Etin Buzdolabında Depolanması Sırasında L. monocytogenes Gelişimi
Üzerine Laktokosin BZ’nin İnhibitör Etkisi
Ekim kabininde UV altında sterilize edilen et örneklerine (yaklaşık 5 g) farklı konsantrasyonlarda L. monocytogenes (0, 102, 103, 104, 106 kob/mL) içeren kültürlerden 1 mL inoküle edilmiştir. İnokülasyondan yaklaşık 30 dk sonra örneklere 0, 200, 400, 800, 1600, 3200 AU/mL konsantrasyonlarında hazırlanan bakteriyosin çözeltisinden 1 mL ilave edilip buzdolabı koşullarında muhafaza edilmiştir. Depolama işleminin belirli periyotlarında (0., 1., 4., 8., 12. gün) örnekler alınıp steril stomacher poşetlerine konulmuştur. Bunu takiben et örneklerine 20 mL fosfat tamponu ilave edilmiş ve stomacher’da 1dk parçalandıktan sonra dilüsyonlar hazırlanmıştır. Oxford Listeria Selective Agar besiyerine yayma plak yöntemi ile ekim yapıldıktan sonra 35-37°C’de 24 saat inkübe edilmiştir.
3.2.6. Depolama İşleminin Bakteriyosin Aktivitesi Üzerine Etkisi
Steril stomacher poşetlerine konulan et örneklerine (yaklaşık 5 g, 1 cm3
) fosfat tamponunda hazırlanan 0, 400, 800, 1600 ve 3200 AU/mL bakteriyosin çözeltilerinden 1 mL ilave edilmiş ve buzdolabında muhafaza edimiştir. Depolamanın 0., 1., 4., 8. ve 12. günlerinde rastgele et örnekleri alınıp yaklaşık 104
-105 kob/mL düzeyinde L.
monocytogenes içeren kültürden 1 mL ilave edilmiş ve 10 dk bekletilmiştir. Daha sonra
et örneklerine 20 mL fosfat tamponu katılıp stomacher’da 1 dk parçalanmış ve dilüsyonlar hazırlanmıştır. Oxford Listeria Selective Agar besiyerine yayma plak yöntemi ile ekim yapıldıktan sonra 35-37°C’de 24 saat inkübe edilmiştir. İnkübasyon işleminin sonunda gelişen koloniler sayılıp sonuç kob/g olarak verilmiştir.
3.2.7. İstatistiksel Analiz
Her bir analiz üç kez yapılıp, ortalamaları hesaplanmıştır. Bakteri sayıları log kob/g olarak ifade edilmiştir. Ortalamaların karşılaştırılması için Tukey testi kullanılmıştır. Veri analizleri SAS istatistiksel paket programı kullanılarak gerçekleştirilmiştir.
25