G‹R‹fi
Yaklafl›k 50 y›ld›r, otoimmun hastal›klar›n teflhisin-de ve tedavisinin takibinteflhisin-de otoantikor testleri kulla-n›lmaktad›r (4). ‹lk y›llarda otoantikor testlerinde kullan›lan malzemelerin bir ço¤u elde haz›rlan›r-ken, son y›llarda ticari firmalar›n bu alandaki girifli-miyle kitler gelifltirilmifltir (6;12). Günümüzde tica-ri kitler, elde haz›rlanandan daha ekonomik, daha kolay kullan›ma sahip ve daha standardize test im-kanlar› sunmaktad›r (4). Kitler genellikle otoantikor
testlerinin yap›labilmesi için gerekli tüm malzeme-leri içermektedir ve uygulanmas› bu nedenle laflt›r›lm›flt›r. Ancak, ticari kitlerin sa¤lad›¤› kolay-l›klar›n yan›nda, do¤ru sonucun verilebilmesi için kullan›lan teknoloji hakk›nda tecrübe sahibi olmak gerekmektedir (1).
Ticari otoantikor test kitleri, indirekt immunoflöre-san (IIF), immunodiffüzyon, immunoblotting, enz-yme-linked immunoassay (ELISA) ve son zaman-larda gelifltirilen lazer antijen ölçüm gibi teknoloji-leri sunmaktad›r (2;10). ELISA, otoantikor testteknoloji-leri aras›nda en fazla tercih edilenlerden bir tanesidir,
Anti-Nükleer Antikorlar›n (ANA) Araflt›r›lmas› ve
Saptan-mas›nda Kullan›lan Teknikler
(*) Kocaeli Üniversitesi T›p Fakültesi Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dal› (**) Kocaeli Üniversitesi T›p Fakültesi Klinik Bakteriyoloji ve ‹nfeksiyon Hastal›klar› Anabilim Dal›
Zeki YUMUK(*), fieyda ÇALIfiKAN(*), Sibel GÜNDEfi(**), Ayfle WILLKE(*)
ÖZET
Bu çal›flman›n amac›, otoantikor testleri konusunda elde edilen tecrübeleri, bu alanda çal›flan araflt›rmac›lara aktarmakt›r. Bu amaç için, yaklafl›k iki y›ll›k otoantikor test sonuçlar› retrospektif olarak de¤erlendirilmifltir. Laboratuvar›m›zda bu süre zarf›nda, 2869 serumda ANA testi çal›fl›lm›flt›r. Serumlar›n 810 tanesinde ANA pozitif (%28,2) bulunmufltur. ANA pozitif 208 serumda anti-ENA testi çal›fl›lm›flt›r, bunlardan 126 (%60,5) tanesinde antijen tipi belirlenebilmifltir. ANA negatif bulunan 313 olgunun ise yan-l›zca 4 (%1,3) tanesinde anti-ENA pozitif bulunmufltur. Otoantikor test sonuçlar›na zaman zaman güvensizlik olmakla birlikte, kli-nik ve laboratuvar aras›ndaki iletiflim ve testi de¤erlendiren hekimin deneyiminin bu güvensizli¤e çözüm getirebilece¤i düflünül-mektedir.
Anahtar Kelimeler: Antinükleer antikor SUMMARY
Investigation of Antinuclear Antibodies ( ANA) and Techniques for Detection
To report our experiences to the investigators in the field of testing autoantibodies is the aim of this study. Therefore, laboratory data collected durig two years has been evaluated retrospectively. In this period of time, 2869 sera have been tested for ANA exis-tence. Of these 810 (28.2%) sera were found to be ANA positive. Anti-ENA test was performed to 208 ANA positive sera, of those 126 (60.5%) were found to be positive. Anti-ENA test was also performed to 313 ANA negative sera, of those only 4 (1.3%) were found to be positive. Although, sometimes the results of ANA test were evaluated as distrustful, it is thought that the experiences of the physician interpreting the results could solve the inconvenicence situation.
Keywords:Antinüclear antibody
‹letiflim : Zeki Yumuk
çünkü duyarl›, ekonomik ve az ekipman gerektiren bir test flekli sunmaktad›r (1). Ancak ELISA testle-rinin standardizasyonu için günümüze kadar çok az çal›flma yap›lm›flt›r, bu nedenle kalite kontrolü gibi ifllemlerin tamam› üretici firmaya b›rak›lm›flt›r. Farkl› firmalara ait ELISA kitleri kullan›larak elde edilen sonuçlar›n, IIF kitleri kullan›larak elde edilen sonuçlardan farkl› ç›kt›¤›n› gösteren çal›flmalar bu-lunmaktad›r (4). IIF teknolojisi, ELISA’dan daha çok tecrübe gerektirmektedir. IIF’da testin duyarl›-l›¤›, de¤erlendiren kiflinin tecrübesiyle do¤ru oran-t›l› olarak artmaktad›r. ELISA’dan farkl› olarak IIF standardizasyonu için bir çok de¤erli çal›flma yap›l-m›flt›r. ‹mmunoblotting ve laser teknolojisi, antije-nin belirlenmesine yönelik kullan›lmaktad›r (9). Bir çok araflt›rmac› taraf›ndan önerilen yöntem, IIF tek-nolojisi kullan›larak otoantikor varl›¤›n›n belirlen-mesi ve antijen tipinin ortaya ç›kart›lmas› için im-munblotting yönteminin kullan›lmas› fleklinde ol-mufltur (1). Laser teknolojisi, gelifltirilme aflamas›n-da oldu¤u için henüz yayg›n olarak tercih edilme-mektedir.
Bu konuda güçlük yaflanan di¤er bir özellik de sa¤-l›kl› bireylerde otoantikor test sonuçlar› pozitif ç›-kabilmesidir (1). Otoantikor pozitiflik oran›, bölge-ler, ülkebölge-ler, ›rklar, cinsiyetler aras›nda fakl›l›k gös-terebilmektedir (12). Bu nedenle, demografik kri-terlerin göz önüne al›nd›¤› otoantikor prevelans›n›n belirlenmesine yönelik çal›flmalar önem tafl›makta-d›r. Ancak ülkemizde bu yönde yap›lm›fl genifl kap-saml› bir çal›flma, yapt›¤›m›z literatür taramas›nda bulunamam›flt›r. Sa¤l›kl› kiflilerin %30’unda (1/40 dilüsyon) ANA testinin hiçbir otoimmün hastal›¤a ba¤l› olmadan pozitif olabilece¤i yurtd›fl› dergilerde yay›nlanm›flt›r (2), bu oran›n %40 civar›na ç›kt›¤›n› gösteren yay›nlar da bulunmaktad›r (11).
Bir kiflinin kan›nda belirli düzeylerde otoantikor bu-lunmas›, o kiflide otoimmün bir hastal›¤›n olabilece-¤ini düflündürmektedir veya otoimmün bir hastal›¤› olan kiflide hastal›¤›n fliddeti ve hastal›¤a karfl› geli-flen immün yan›t›n fliddeti hakk›nda bilgi vermekte-dir (5). Bu nedenle, otoanikor testleri önem kazan-m›flt›r. Her laboratuvar›n, otoanikor belirlemede kulland›¤› teknikleri, bu tekniklerin avantajlar›n› ve
dezavantajlar›n›, s›n›rlamalar›n› iyi araflt›rmas› ve klinikle birlikte en uygun yöntemi kendi bölgesi için seçmesi gerekmektedir (12). Gelifltirilen ve uy-gulana yöntemlerin detaylar›n›n yay›nlanmas›, elde edilen tecrübenin pekifltirilmesi aç›s›ndan önem ta-fl›maktad›r (4). Bu çal›flman›n amac›, otoantikor testleri konusunda elde edilen tecrübelerin, bu alan-da çal›flan araflt›rmac›lara aktarmakt›r. Bu amaç için, yaklafl›k iki y›ll›k otoantikor test sonuçlar› ret-rospektif olarak de¤erlendirilmifltir.
GEREÇ VE YÖNTEM
Bu çal›flmada, Kocaeli Üniversitesi T›p Fakültesi Hastanesi Merkez laboratuvar›, Ekim 2002-Haziran 2004 kay›tlar› otoantikor test sonuçlar› aç›s›ndan de¤erlendirilmifltir. Kay›tlardan, ANA test sonucu, pozitif sonuçlar›n dilüsyonu, anti-ENA sonucu, tes-tin istenildi¤i bölüm ve testes-tin çal›fl›lmas›nda kulla-n›lan ticari kit bilgileri al›nm›flt›r.
IIF Testi
Kay›tlar›n de¤erlendirildi¤i periyotta, Euroimmune (Almanya), Binding Site (‹ngiltere), Zeus (ABD) firmalar›na ait IIF kitleri kullan›lm›flt›r. Ekim 2002 – Haziran 2003 tarihleri aras›nda Euroimmune, Ha-ziran 2003 – fiubat 2004 tarihleri aras›nda Binding Site, fiubat – Haziran 2004 tarihleri aras›nda Zeus firmas›na ait kit kullan›larak ANA çal›fl›lm›flt›r. Tüm ticari kitlerde hasta serumlar› 1/100 oran›nda dilüe edilerek çal›fl›lm›flt›r. 1/100 dilüsyonda ANA pozitif ç›kan serumlar için 1/500 ve 1/1000 dilüs-yonda test tekrarlanm›flt›r. Tüm ticari kitlerin çal›fl-ma flekilleri birbirine benzer özellik tafl›çal›fl-maktad›r ve k›saca kitler flu flekilde çal›fl›lm›flt›r: Serum örnekle-ri fosfat tamponlu izotonik solüsyon (PBS) ile 1/100 oran›nda dilüe edilmifltir. Slayt üzerindeki her bir kuyucu¤a 70 ml dilüe edilmifl serum damlat›l-m›flt›r. Otuz dakika oda ›s›s›nda inkübe edilmifltir. ‹nkübasyon sonunda slaytlar 5 dakika aral›klarla iki defa PBS ile y›kanm›flt›r. Flöresan iflaretli anti-hu-man immünoglobulin (konjugat) ile kuyucuklar tek-rar doldurulmufl ve 30 dakika oda ›s›s›nda inkübe edilmifltir. PBS ile tekrar y›kanm›flt›r. Kuyucuklara mounting medium doldurularak lamel ile kapat›l-m›flt›r. Haz›rlanan slaytlar 400x büyütmede flöresan mikroskobunda incelenmifltir. Ekim 2002 – Kas›m
2003 tarihleri aras›nda çal›fl›lan testler Leica DML marka, Kas›m 2003 – Haziran 2004 tarihleri aras›n-da çal›fl›lan testler ise Olympus marka flöresan mik-roskop kullan›larak de¤erlendirilmifltir.
Anti-ENA testi
Anti-ENA testi Euroimmune firmas›na ait Euroli-ne®kiti kullan›larak yap›lm›flt›r, baflka yöntem veya
ticari kit çal›flmada kullan›lmam›flt›r. Bu kit Im-munblotting prensibine göre üretilmektedir. Testte kullan›lan her bir strip, nRNP/Sm (U1-nRNP), Sm, SS-A, Recombinant Ro-52 (Ro-52, 52kDa), SS-B, DNA-Topoisomerase I (Scl-70), PM-Scl, Histidyl-tRNA Synthetase (Jo-1), Centromer protein B (CENP B), Double-stranded DNA (dsDNA), Nuc-leosomes, Histones, Pyrutate-dehydrogenase comp-lex (AMA-2) antijenlerini içermektedir. Test üze-rindeki antijenler, insanda IgG s›n›f›nda bulunan otoantikorlar›n›n kalitatif de¤erlendirmesini yapabi-lecek nitelikte bulunmufltur. ‹lk reaksiyon basama-¤›nda 1/100 oran›nda dilüe edilmifl hasta serumlar› immünblot striplerle inkübe edilmifltir. ‹nkübasyon için firma taraf›ndan sa¤lanan kuvetler kullan›lm›fl-t›r. Test üzerindeki herhangi bir antijene karfl› var-sa antikor (pozitiflik), spesifik Ig G antikorlar› (Ig A ve Ig M dahil) karfl›l›¤› olan antijenik bölgeye ba¤-lanmaktad›r. Ba¤l› antikoru saptamak için renk re-aksiyonu oluflturma kapasitesi olan insan IgG (en-zim konjugat) iflaretli en(en-zim ile ikinci bir inkübas-yon yürütülmektedir. Sonuçlar ç›plak gözle de¤er-lendirilmifltir.
BULGULAR
Ekim 2002-Haziran 2004 tarihleri aras›nda 2869 se-rumda ANA testi IIF yöntemi kullan›larak çal›fl›l-m›flt›r. Testlerin 1879 (%65,4) tanesi Euroimmune,
820 (%28,6) tanesi Binding Site, 170 (%6) tanesi ise Zeus ticari firmalar›na ait kitler kullan›larak ça-l›fl›lm›flt›r. De¤erlendirme, 2241 (%78,1) testte Lei-ca DML, 628 (%21,9) testte is Olympus marka flö-resan mikroskop kullan›larak yap›lm›flt›r. Serumla-r›n, 810 (%28,2) tanesinde ANA test sonucu pozitif bulunmufltur. Kullan›lan ticari kitlere göre pozitiflik oran› fiekil 1’de gösterilmifltir.
Tablo 1’de serumlar›n gönderildi¤i bölümler göste-rilmektedir. En fazla serum dermatoloji ve dahiliye bölümlerinden gönderilmifltir. Serum, bafllang›çta 1/100 oran›nda dilüe edilerek çal›fl›lm›flt›r. Bu dilüs-yonda pozitif bulunan serum daha sonra 1/500 ve 1/1000 oran›nda dilüe edilerek tekrar çal›fl›lm›flt›r. 1/100 dilüsyonda pozitif ç›kan 540 sonuç bir üst di-lüsyonda negatif ç›km›flt›r. Dilüsyonlarla birlikte 2869 serum için, toplam 3628 otoantikor testi har-canm›flt›r (Tablo 1). Anti-ENA testi, ANA pozitif bulunan 208, negatif bulunan 313 toplam 521 se-rumda çal›fl›lm›flt›r (Tablo 2). Bu çal›flmada 208 ANA pozitif bulunan serumda anti-ENA çal›fl›lm›fl ve 126 (%60,5) tanesinde pozitif sonuç bulunmufl-tur, buna ra¤men 313 negatif ANA sonucu için an-ti-ENA istenilmifl ve sadece 4 (%1,3) tanesinde
po-fiekil 1. ANA test sonuçlar›n›n kullan›lan ticari kitlere göre oranlar›.
1/100 (n: 2599) n % ANA 1/500 (n: 759) n % 1/1000 (n: 270) n % Dermatoloji (n: 1670) n % Pediatri (n: 214) n % Dahiliye (n: 1570) n % Di¤er* (n: 174) n % Pozitif 540 20.77 219 28.9 51 18.9 360 21.56 66 30.8 345 21.97 39 22.4 Negatif 2059 79.33 540 71.1 219 81.1 1310 78.44 148 69.2 1225 78.03 135 77.6 *Genel Cerrahi, Nöroloji, ‹nfeksiyon Hastal›klar›, KBB Bölümleri
Tablo 1. ANA pozitif sonuçlar›n›n dilüsyon ve bölümlere göre da¤›l›m›.
zitif sonuç bulunmufltur. TARTIfiMA
Otoimmün hastal›klar, erken teflhis edilmedi¤i za-man ölüme ve kal›c› sekellere neden olabilmektedir (5). Otoimmün hastal›klar›n teflhisinde, otoantikor testleri genellikle tercih edilmektedir (3). Güvenilir otoantikor test sonuçlar› hastan›n sa¤l›¤›na önemli katk›da bulunmaktad›r (12). Çal›fl›lan testin güveni-lir sonuçlar verebilmesi için laboratuvarda kullan›-lan yöntem konusunda bilgi ve tecrübe sahibi olun-mas›, testin istendi¤i kliniklerle iletiflim kurulolun-mas›, hasta ve hastal›¤a ait bilginin edinilmesi gerekmek-tedir (1).
Pozitif sonucun her zaman bir hastal›¤› yans›tmad›-¤›, yüksek dilüsyonlarda elde edilen pozitif sonucun otoimmün hastal›klar aç›s›ndan daha anlaml› olabi-lece¤i bilinmektedir (7). Buna ra¤men, sonuçlar›n de¤erlendirilmesi aflamas›nda klinisyen ANA pozi-tif sonucu herhangi bir otoimmün hastal›kla iliflki-lendiremedi¤i durumda testin yanl›fl çal›fl›ld›¤›n› düflünmektedir (12). Ülkemizde, toplumda pozitif ANA prevelans›n› gösteren bir çal›flma araflt›rmala-r›m›z sonucu bulunamam›flt›r. Baz› yurtd›fl› yay›n-larda bu oran›n %30-40 civar›nda olabilece¤i gös-terilmifltir (2;11). Hastanemiz kliniklerinden labora-tuvar›m›za gelen elefltirilerin bafl›nda, pozitif ANA sonuçlar›n›n yüksek oranda ç›kt›¤› fleklinde olmak-tad›r. Bu çal›flmada pozitif ANA oran› 1/100 serum
dilüsyonu kriter al›nd›¤›nda, çal›fl›lan 2869 testte %28,2 olarak bulunmufltur. Bu de¤er, hastanemiz kliniklerine tedavi amac›yla baflvuran hasta serum-lar›ndan elde edilmifltir ve normal toplumu yans›t-mamaktad›r. Normal popülasyonda, 1/40-1/80 se-rum dilüsyonu kriter al›narak yap›lan yurtd›fl› kay-nakl› çal›flmalarda, ANA pozitifli¤i %30-40 oran›n-da bulunmufltur. Otoantikor testlerinde genel olarak serumlar›n bafllang›ç dilüsyonu 1/80 olarak öneril-mektedir. Klinikten gelen elefltiriler dikkate al›na-rak, bizim laboratuvar›m›zda bu oran 1/100 olarak belirlenmifltir.
Otoantikor testlerinin en s›k dermatoloji ve dahiliye bölümlerinden istendi¤i bildirilmifltir (12), bu arafl-t›rmada da en s›k dermatoloji ve dahiliye bölümle-rinden otoantikor testleri istenmifltir. Klinik uygula-mada, ANA testi pozitif bulunduktan sonra anti-ENA testi istenmektedir. Ancak bazen, anti-anti-ENA ANA ile birlikte istenmifltir, bu flekilde testin güve-nilirli¤inin artt›r›lmas› amaçlanm›flt›r. IIF tekni¤in-de ANA varl›¤› Hep-2 hücreleri kullan›larak araflt›-r›lmaktad›r. Bu teknoloji arac›l›¤›yla bilinen ve bi-linmeyen tüm antijenlere karfl› var olan otoantikor-lar de¤erlendirilebil-mektedir. Anti-ENA testi ise sadece bilinen bir antijenin kullan›ld›¤› bir yöntem-dir. Bu nedenle, anti-ENA’n›n ANA testinden daha duyarl› olabilece¤i düflünülmemelidir (8;12). Di¤er yandan, anti-ENA testleri pahal›d›r ve çal›fl›lmas› zaman almaktad›r.
1/100 1/500 1/1000 Dermatoloji Pediatri Dahiliye Di¤er*
anti-nRNP/Sm (U1-nRNP) 13 2 7 11 2 9 0 anti-SS-A 17 7 9 15 5 11 2 anti-SS-B 4 1 3 3 1 3 1 anti-Scl-70 0 0 3 1 0 1 1 anti-CENP-B 4 3 0 4 0 4 0 anti-dsDNA 7 3 4 8 1 4 1 anti-nucleozom 6 3 2 4 0 5 2 anti-Histon 13 0 8 8 1 10 2 anti-AMA-M2 3 2 2 3 0 4 0
*Genel Cerrahi, Nöroloji, ‹nfeksiyon Hastal›klar›, KBB Bölümleri
**Anti-ENA, Euroline profilinde 13 antjien bulunmaktad›r, Sm, Ro-52, PM-Scl, Jo-1antijenlerine karfl› hiçbir serumda antikor bulunmam›flt›r. Tablo 2. Anti-ENA pozitif sonuçlar›n›n dilüsyon ve bölümlere göre da¤›l›m›.
D‹LÜSYON Anti-ENA**
Bir laboratuvar sonucunun baflka bir laboratuvarda tekrarlanmas›, klinisyenlerin nadiren de olsa baflvu-rabilece¤i güven artt›rma yöntemleri aras›nda bu-lunmaktad›r (1). Farkl› firmalara ait ELISA kitleri kullan›larak elde edilen sonuçlar›n, IIF kitleri kulla-n›larak elde edilen sonuçlardan farkl› ç›kt›¤›n› gös-teren çal›flmalar bulunmaktad›r (4). Otoantikor test-leri aç›s›ndan, bir sonucun laboratuvarlar aras›nda farkl› ç›kabilece¤i unutulmamal›d›r.
Euroimmune kitlerine ait slaytlar›n her bir kuyucu-¤unda 4 doku (Hep-2 hücresi, primat karaci¤eri, s›-çan böbrek ve mide dokusu) bulunmaktad›r. Bin-ding Site ve Zeus kitlerine ait slaytlar›n her bir ku-yucu¤unda Hep-2 dokusu bulunmaktad›r ve çal›fl-mada bu kitler kullan›larak ANA testi çal›fl›lm›flt›r. Bu çal›flmada, yans›t›lan tecrübenin önemli bölümü Euroimmün kiti çal›fl›larak elde edilmifltir. Test ku-yucu¤unda bulunan 4 doku sonuca bütünlük kat-maktad›r. Ayn› serum ve testte ANA ve ASMA so-nucu birlikte çal›fl›labilmektedir. Binding Site kitin-de kuyucuklarda sakitin-dece Hep-2 dokusu bulunmakta-d›r ve dokunun daha büyük olmas› de¤erlendirme-sinde güven vermektedir.
Otoantikor testleri, IIF ticari kitlerin içinden ç›kan k›lavuz arac›l›¤›yla kolayl›kla çal›fl›labilmektedir. Ancak elde edilen sonucun güvenilir olabilmesi için tecrübe ve klinikle koordinasyon gerekmektedir (1). Bu çal›flmada, laboratuvar›m›zda elde edilen tecrü-be yans›t›lm›flt›r. Bölgemizde ve ülkemizde otoanti-kor testlerine daha fazla önem verilmesi gerekti¤i düflünülmektedir. Ülkemizde, normal toplumda ANA prevelans›n› ortaya koyacak çal›flmalar›n ya-p›lmas› gerekmektedir.
KAYNAKLAR
1. Bradwell AR. Immunofuorescent antinuclear antibody tests. “Rose NR, ed. Manual of Clinical Laboratory Im-munology.” 6 edn, p.922 , ASM Press, Washington, DC (2002).
2. Egner W. The use of laboratory tests in the diagnosis of SLE. J Clin Pathol 53: 424 (2000).
3. Fritzler MJ, Salazar M. Diversity and origin of rhe-umatologic autoantibodies. Clin Microbiol Rev 4: 256 (1991).
4. Fritzler MJ, Wiik A, Fritzler ML, Barr SG. The use and abuse of commercial kits used to detect autoantibodi-es. Arthritis Res Ther 5: 192 (2003).
5. Leslie D, Lipsky P, Notkins AL. Autoantibodies as predictors of disease. J Clin Invest 108: 1417 (2001). 6. McFarlane IG. The relationship between autoimmune markers and dIIFerent clinical syndromes in autoimmune hepatitis. Gut 42: 599 (1998).
7. Mohan C, Alas E, Morel L, Yang P, Wakeland EK. Genetic dissection of SLE pathogenesis. Sle1 on murine chromosome 1 leads to a selective loss of tolerance to H2A/H2B/DNA subnucleosomes. J Clin Invest 101: 1362 (1998).
8. Paulus HE, Wiesner J, Bulpitt KJ et al. Autoantibo-dies in early seropositive rheumatoid arthritis, before and during disease modifying antirheumatic drug treatment. J Rheumatol 29: 2513 (2002).
9. Peene I, Van Ael W, Vandenbossche M, Vervaet T, Veys E, De Keyser F. Sensitivity of the HEp-2000 subs-trate for the detection of anti-SSA/Ro60 antibodies. Clin Rheumatol 19: 291 (2000).
10. Pollock W, Toh BH. Routine immunofluorescence detection of Ro/SS-A autoantibody using HEp-2 cells transfected with human 60 kDa Ro/SS-A. J Clin Pathol 52: 684 (1999).
11. Rosenberg AM, Semchuk KM, McDuffie HH et al. Prevalence of antinuclear antibodies in a rural population. J Toxicol Environ Health A 57: 225 (1999).
12. Tan EM, Feltkamp TE, Smolen JS et al. Range of antinuclear antibodies in “healthy” individuals. Arthritis Rheum. 40: 1601 (1997).
