SCENEDESMUS DIMORPHUS BİYOFİLM KÜLTÜRLERİNDE AZOT AÇLIĞININ LİPİD ÜRETİMİ ÜZERİNE ETKİSİ
Fatma KAR Yüksek Lisans Tezi Biyoloji Anabilim Dalı
SCENEDESMUS DIMORPHUS BİYOFİLM KÜLTÜRLERİNDE AZOT AÇLIĞININ LİPİD ÜRETİMİ ÜZERİNE ETKİSİ
Fatma KAR
Kütahya Dumlupınar Üniversitesi
Lisansüstü Eğitim Öğretim ve Sınav Yönetmeliği Uyarınca Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalında
YÜKSEK LİSANS TEZİ Olarak Hazırlanmıştır.
Danışman: Prof. Dr. Tuba İÇA
Fatma KAR’ın YÜKSEK LİSANS tezi olarak hazırladığı “SCENEDESMUS DIMORPHUS BİYOFİLM KÜLTÜRLERİNDE AZOT AÇLIĞININ LİPİD ÜRETİMİ ÜZERİNE ETKİSİ” başlıklı bu çalışma, jürimizce Kütahya Dumlupınar Üniversitesi Lisansüstü Eğitim Öğretim ve Sınav Yönetmeliğinin ilgili maddeleri uyarınca değerlendirilerek kabul edilmiştir.
25/06/2019
Prof. Dr. Önder UYSAL ---
Enstitü Müdürü, Fen Bilimleri Enstitüsü
Prof. Dr. Hayri DAYIOĞLU ---
Anabilim Dalı Başkanı, Biyoloji Anabilim Dalı
Prof. Dr. Tuba İÇA ---
Danışman, Biyoloji Anabilim Dalı
Sınav Komitesi Üyeleri
Prof. Dr. Tuba İÇA ---
Biyoloji Bölümü, Kütahya Dumlupınar Üniversitesi
Doç. Dr. Ceylan AYADA ---
Temel Tıp Bilimi Bölümü, Kütahya Sağlık Bilimleri Üniversitesi
Doç. Dr. Cüneyt Nadir SOLAK ---
ETİK İLKE VE KURALLARA UYGUNLUK BEYANI
Bu tezin hazırlanmasında Akademik kurallara riayet ettiğimizi, özgün bir çalışma olduğunu ve yapılan tez çalışmasının bilimsel etik ilke ve kurallara uygun olduğunu, çalışma kapsamında teze ait olmayan veriler için kaynak gösterildiğini ve kaynaklar dizininde belirtildiğini, Yüksek Öğretim Kurulu tarafından kullanılmak üzere önerilen ve Kütahya Dumlupınar Üniversitesi tarafından kullanılan İntihal Programı ile tarandığını ve benzerlik oranının % 5 çıktığını beyan ederiz. Aykırı bir durum ortaya çıktığı takdirde tüm hukuki sonuçlara razı olduğumuzu taahhüt ederiz.
Prof. Dr. Tuba İÇA Fatma KAR
SCENEDESMUS DIMORPHUS BİYOFİLM KÜLTÜRLERİNDE AZOT AÇLIĞININ LİPİD ÜRETİMİ ÜZERİNE ETKİSİ
Fatma KAR
Biyoloji, Yüksek Lisans Tezi, 2019 Tez Danışmanı: Prof. Dr. Tuba İÇA
ÖZET
Bu çalışmada Scenedesmus dimorphus biyofilm kültürlerinde azot (N) stresinin lipid üretimi üzerine etkisi incelenmiştir. Yeşil alglerden (Chlorophyceae) S. dimorphus’ un planktonik ve biyofilm formu, %100 N ve %25 N içeren ortamlarda inoküle edilmiştir. Yapılan denemelerde N stresinin ve biyofilm oluşumunun, kuru madde (DCW), klorofil-a ve total lipit miktarlarına olan etkisi incelenmiştir. S. dimorphus mikroalginin biyofilm oluşturma becerisinin incelenebilmesi için laboratuar koşullarına modifiye edilerek Dönen algal biyofilm reaktörü (RABR) kurulmuştur. RABR’ ın tasarımında S. dimorphus mikroalginin biyofilm oluşturabilmesi için çeşitli tutunma materyalleri denenmiş ve en yüksek tutunma oranına ve hasat işleminin kolay olması gibi özelliklere sahip olmasından dolayı polietilen halat kullanılmasına karar verilmiştir. Deneme sonucunda elde edilen en yüksek kuru biyokütlenin 0,275 g/m2 olduğu ve bu sonucun %100 N içeren biyofilm formundan elde edildiği belirlenmiştir. Uygulanan azot stresinin total lipit miktarına olan etkisi incelendiğinde, en yüksek DCW içinde % total lipit miktarının 13,81 olduğu ve bu sonucun %25 N içeren biyofilm formundan elde edildiği belirlenmiştir.
Anahtar Kelimeler: Azot (N) stresi, Biyofilm, Biyoreaktör, Chloropyceae, Dönen algal biyofilm reaktörü (RABR), Klorofil-a, Kuru madde (DCW), Mikroalg, Planktonik form, Polietilen halat, Scenedesmus dimorphus, Total lipit
THE EFFECT OF NITROGEN STARVATION ON LIPID PRODUCTION OF SCENEDESMUS DIMORPHUS BIOFILM CULTURES
Fatma KAR
Biology, M.S. Thesis, 2019 Thesis Supervisor: Prof. Dr. Tuba İÇA
SUMMARY
This study investigated the effect of the for lipid production in the Scenedesmus dimorphus biofilm form cultivation under nitrogen (N) starvation. The formation of planktonic and biofilm in the species of gren algaes (Chlorophyceae) S. dimorphus was inoculated at environments with both %100 N and %25 N. The aim of this study was to experiment the effects of nitrogen starvation and biofilm formation on dry cell weight (DCW), chlorophyll-a and total lipid production. Under laboratory conditions were modified a Rotating algal biofilm reactor (RABR) in order to investigate the formation of biofilm at S. dimorphus microalgae. Design process of the RABR was important for the purposes of microalgae production by S. dimorphus. During the design process, multiple materials were tested for their adhesion quality. Polyethylene robe was chosen for this experiment for its highest adhesion percentage along with the simple harvesting process. The highest dry biomass data recorded after the experimentwas 0,275 g/m2 and this result came from a biofilm formation that contained %100 N. When the effects of the nitrogen stress on total lipid concentration was examined, it was found that the highest amount % total lipid in DCW was 13,81 and this result was obtained from biofilm form containing %25 N.
Keywords: Biofilm, Bioreactor, Chlorophyceae, Chlorophyll-a, Dry cell Weight (DCW), Microalgae, Nitrogen (N) stress, Planktonic form, Polyethylene robe, Rotating Algal Biyofilm Reactor (RABR), Scenedesmus dimorphus, Total lipid
TEŞEKKÜR
Öncelikle yüksek lisans öğrenimim süresince benden ilgisini ve desteğini hiç esirgemeyen, büyük bir sabır ve titizlikle bilgi ve tecrübelerini aktararak gelişmemi sağlayan, insani değerlerini ve eğitimci kişiliğini örnek edindiğim değerli danışman hocam Prof. Dr. Tuba İÇA’ ya saygılarımı sunuyor ve sonsuz teşekkür ediyorum.
Üniversitemizin ileri teknoloji özelliklerine sahip Zoonozlar Uygulama ve Araştırma Merkezi’nde çalışmama olanak sağlayan ve engin bilgileriyle yol gösteren hocam Prof. Dr. Anıl İÇA’ ya sonsuz teşekkürlerimi sunuyorum.
Tezimin laboratuar aşamalarında elinden gelen her türlü yardımı karşılıksız sunan, çok değerli arkadaşım Ersel ÇEÇEN’ e, Hasan İlkay YILMAZ’ a ve tez çalışmam boyunca destek ve yardımlarını esirgemeyen Zoonozlar Uygulama ve Araştırma Merkezi sekreteri Barış KÜÇÜKAKSOY’ a çok teşekkür ediyorum.
Son olarak bugün olduğum yere gelmemi sağlayan, beni hayatımın her döneminde koşulsuz şartsız destekleyen ve arkamda olan babam Ali KAR’ a, annem Pembe KAR’ a sevgili ablam Merve KAR’ a, sevgili ablam Bilge AYDEMİR’ e, sevgili ağabeyim Serkan AYDEMİR’ e ve hayatımı paylaştığım, müstakbel eşim Semih GÜMÜŞ’ e sonsuz minnet ve teşekkürlerimi sunarım.
İÇİNDEKİLER
Sayfa ÖZET ... v SUMMARY ... vi ŞEKİLLER DİZİNİ ... x ÇİZELGELER DİZİNİ ... xiiSİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ ... xiii
1. GİRİŞ ... 1
2. LİTERATÜR ÖZETİ ... 5
2.1. Alglerin Tanımı ... 5
2.2. Alglerin Taksonomideki Yeri ... 5
2.3. Alglerin Evrimi ... 6
2.4. Alglerin Anatomik Yapıları ... 7
2.4.1. Hücre duvarı ... 7
2.4.2. Hücre organelleri... 7
2.5. Mikroalglerin Büyümesi Üzerine Etkili Olan Faktörler ... 8
2.5.1. Besin elementleri... 9
2.5.2. Işık... 10
2.5.3. Sıcaklık ... 11
2.5.4. pH değeri ... 11
2.5.5. Kültürlenme sistemleri ... 12
2.6. Mikroalglerin Fotosentez Tepkimeleri ... 16
2.7. Alglerin Lipit Üretim Mekanizmaları ve Lipit Kompozisyonu ... 20
2.8. Alglerin Lipit Üretim Mekanizmalarını İndükleyen Stres Koşulları ve Verdikleri Cevaplar ... 23 2.8.1. Azot stresi ... 23 2.8.2. Fosfor stresi ... 24 2.8.3. Işık stresi ... 25 2.8.4. Sıcaklık stresi ... 25 2.8.5. Tuz stresi ... 25
2.8.6. Mikroalglerin biyofilm formasyonu ... 26
İÇİNDEKİLER (devam)
Sayfa
2.9.1. Alglerden elde edilen biyoyakıtlar ... 29
2.10. Mikroalglerden Biyodizel Eldesi İçin Uygulanan Prosedürler ... 32
2.10.1. Mikro-emülsifikasyon ... 33
2.10.2. Piroliz ... 33
2.10.3. Transesterifikasyon ... 33
3. MATERYAL METOD ... 35
3.1. Materyal ... 35
3.1.1. 1.Kullanılan alg türü ve kültür ortamı ... 35
3.2. Metod ... 35
3.2.1. Kültür koşulları ... 35
3.2.2. Reaktörün tasarlanması ... 37
3.2.3. Optik dansitenin ölçülmesi ... 39
3.2.4. Klorofil-a tayini... 39
3.2.5. Kuru madde analizi (DCW - Dry Cell Weight) ... 40
3.2.6. Total lipit ekstraksiyonu... 40
4. BULGULAR ... 42
4.1. Kullanılan Alg Türünün Mikroskopisi ... 42
4.2. Dönen Algal Biyofilm Reaktöründe (RABR) Kullanılacak Materyalin Seçimi ... 42
4.3. Optik Dansite ... 45
4.4. Klorofil-a Tayini ... 48
4.5. Kuru madde analizi (DCW) ... 49
4.6. Total yağ miktarları ... 51
5. TARTIŞMA ... 60
6. SONUÇ VE ÖNERİLER ... 67
KAYNAKLAR DİZİNİ ... 68 ÖZGEÇMİŞ
ŞEKİLLER DİZİNİ
Şekil Sayfa
2.1. Açık havuz sistemi ... 14
2.2. Tübüler fotobiyoreaktör ... 15
2.3. Kapalı fotobiyoreaktör ... 15
2.4. Dönen Algal biyofilm reaktörü ... 16
2.5. Görünür ışık ... 18
2.6. Mikroalglerde lipit biyosentezinin basit bir şeması ... 23
2.7. Mikroalglerin biyofilm oluşturma şekilleri ... 27
2.8. Alglerden biyoyakıt elde etmenin farklı yolları ... 34
3.1. Planktonik form %100 N ve %25 N içeren besiyeri (orijinal). ... 36
3.2. Dönen algal biyofilm reaktöründe (RABR) kullanılan diskin ve motorun görünümü. ... 38
3.3. Dönen algal biyofilm (RABR) reaktörünün yan açıdan görüntüsü. ... 38
3.4. Dönen algal biyofilm reaktörünün (RABR) perspektif görüntüsü. ... 39
4.1. Scenedesmus dimorphus mikroalginin mikroskobik görüntüleri (Orijinal). ... 42
4.2. Disk üzerindeki biyofilm formasyonunun şekillenmesinde kullanılan materyaller (a. Pamuk ip, b. Naylon ip, c. Polietilen halat, d. Yumuşak seramik, e. Sert seramik f. Hava taşı) (Orijinal). ... 44
4.3. Jüt halatın üzerinde biyofilm oluşturan S. dimorphus mikroalginin SEM görüntüleri (Orijinal). ... 45
4.4. Planktonik formun OD değerlerinin karşılaştırılması. ... 46
4.5. Biyofilm formun OD değerlerinin karşılaştırılması. ... 47
4.6. %100 N içeren planktonik ve biyofilm formunun OD değerlerinin karşılaştırılması. ... 47
4.7. %25 N içeren planktonik ve biyofilm formun OD değerlerinin karşılaştırılması. ... 48
4.8. Normal koşullar (%100 N) ve azot eksikliği stresi (%25 N) sonrası planktonik formdaki klorofil-a miktarının karşılaştırılması. ... 49
4.9. Planktonik formasyonlarında azot eksikliğine bağlı kuru madde miktarları (g/L). ... 50
4.10. Biyofilm formasyonlarında azot eksikliğine bağlı kuru madde miktarları (g/m2). ... 51
4.11. Planktonik ve biyofilm formunda kuru hücre ağırlığın (DCW) normal koşullarda % yağ miktarı üzerine etkisi ... 52
4.12. Planktonik ve biyofilm formunda kuru hücre ağırlığın (DCW) azot eksikliği koşullarında % yağ miktarı üzerine etkisi ... 53
ŞEKİLLER DİZİNİ
Şekil Sayfa 4.13. %100 N içeren planktonik formun kuru madde (g/L) ve % total yağ miktarlarının
karşılaştırması ... 54 4.14. %25 içeren planktonik formun kuru madde (g/L) ve % total yağ miktarlarının
karşılaştırması ... 55 4.15. %100 N içeren biyofilm formun kuru madde (g/m2) ve % total yağ miktarlarının
karşılaştırması. ... 56 4.16. %25 N içeren biyofilm formun kuru madde (g/m2) ve % total yağ miktarlarının
karşılaştırması. ... 57 4.17. %100 N içeren planktonik formun klorofil-a ve % total yağ miktarlarının
karşılaştırılması. ... 58 4.18. %25 N içeren planktonik formun klorofil-a ve % total yağ miktarlarının
ÇİZELGELER DİZİNİ
Çizelge Sayfa
1.1. Bazı mikroalg türlerinin % yağ asidi miktarları (Demirbaş ve Demirbaş, 2010). ... 2
3.1. M3N-BBM besiyerinin içeriği. ... 36
3.2. Azot miktarı %25 olan M3N-BBM içeriği. ... 37
SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ
Kısaltma Açıklama
ACP Açil taşıyıcı protein
ADP Adenozindifosfat
AT Açil transferaz
ATP Adenozintrifosfat
CoA Koenzim A
DCW Dry Cell Wight (Kuru Hücre Ağırlığı)
DH Dehidrataz
DNA Deoksiribonükleik Asit
EPS Hücre dışı polimerik madde
ER Enoilredüktaz
FAS Yağ asidi sentaz
KAS 3-ketoaçil ACP senteaz
KR Ketoredüktaz
M3N - BBM Modified 3 - N Basal Bold Medium NADP Nikotinamid adenin dinükleotit fosfat
NADPH Nikotinamid adenin dinükleotit fosfat hidrojen
OD Optik Dansite
PGA Fosfogliserik asit
PSI Fotosistem I
PSII Fotosistem II
RABR Dönen Algal Biyofilm Reaktörü
RNA Ribonükleik asit
SFA Doymuş Yağ Asidi
1. GİRİŞ
Son 50 yılda dünya nüfusu iki katından fazla artış göstermiştir. Daha yüksek bir yaşam standardı ve sürekli artan bir ekonomi beklentisi, birincil enerji tüketiminde, özellikle fosil yakıt kaynaklı enerji kullanımında büyük bir artışa neden olmuştur. Dünya nüfusunun 2030 yılına kadar 1,4 milyar kişi daha artacağı ve dünyadaki kişi başı gelirin de artış göstereceği öngörüldüğünden, fosil yakıtların kullanımının artacağı tahmin edilmektedir (Jones ve Mayfield, 2012). Yerli sektörde ve endüstrileşen dünyadaki büyük enerji ihtiyacı nedeniyle fosil yakıtların kullanımının artmasıyla oluşan iklim değişiklikleri, yağış anormalileri, asit yağmurları, sağlık problemleri gibi sorunlar nedeniyle, yenilenebilir, daha düşük çevresel etkileri olan ve daha fazla enerji güvenirliği bulunan enerji kaynaklarının geliştirilmesi gerekmektedir (Soydemir, 2016).
Enerji kaynakları yenilenebilir ve yenilenemeyen olmak üzere iki kısma ayrılmaktadır. Yenilenemeyen kaynakların kullanımından gelen enerji sınırlıdır. Bunların keşfedilmesi, işlenmesi ve kullanılması çevre üzerinde ciddi derecede kötü etkiler yaratmaktadır. Günümüzde, dünyanın enerji ihtiyacını karşılayabilmek için kömür ve petrol gibi yenilenemeyen fosil yakıtlar kullanılmaktadır (Demirbaş ve Demirbaş, 2010). Ayrıca, 2069-2088 yılları arasında fosil yakıt rezervlerinin tamamen tükeneceği öngörülmektedir. Bu kaynaklara bağımlılığımız göz önüne alındığında, çevre için sürdürülebilir bir enerji kaynağına ihtiyaç vardır (Ishikaa, vd., 2017). Fosil yakıtların kullanımının azaltılması, üretilen karbondioksit ve diğer kirleticilerin miktarını önemli ölçüde azaltacaktır. Çevre kirliğiyle, daha az enerji kullanmak ya da fosil yakıtların yerine yenilenebilir enerji kaynaklarını kullanmakla mücadele edilebilir. Fosil yakıtların yerine geçebilecek alternatif yenilenebilir kaynaklar olarak algler, büyük ilgi görmektedir (Demirbaş ve Demirbaş, 2010).
Büyüyen nüfusun taleplerini karşılayabilmek için, ilk olarak yağ içeren bitkiler, birinci nesil yenilenebilir biyoyakıt kaynakları olarak kullanılmaya başlanmıştır. Ancak temiz su, ekilebilir arazi ve düşük enerji içeriği gibi problemlerden dolayı bu kaynaklar, biyoyakıt üretimini sınırlandırmıştır. İkincil nesil biyodizel olarak gıda dışı hammadde olarak isimlendirilen bitki ve orman kalıntıları, atıklar, özel hammaddeler ve kısa rotasyon ormanları kullanılmış, ancak düşük enerji yoğunlukları nedeniyle bu yöntem biyodizel üretimini sınırlandırmıştır. Üçüncü nesil yenilenebilir biyoyakıt olarak da fotootrofik mikroalgler kullanılmıştır ve diğer kaynaklara oranla daha yüksek oranda yağ bulundurduğu gözlenmiştir (Ishikaa, vd., 2017).
Mikroalgler fotosentez yapabildiğinden CO2‘ i kullanan mikroorganizmalardır. Bu yüzden alg bazlı teknolojiler, kömür yakıtlı elektrik santrallerinin karbon salınımını ve sera gazı emisyonlarını azaltılması için kullanılabilmektedir. Mikroalgler, biyodizel üretmek için kullanılan diğer ham maddelerden daha fazla yağ üretme potansiyeline sahiptirler ve bitkiler için uygun olmayan koşullarda da üreyebilmektedirler. Alglerden elde edilen yağ veriminin, en iyi performans gösteren bitki veya bitkisel yağlardan elde edilen yağ verimine göre 200 kat daha fazla olduğu bilinmektedir. Kültürlenen mikroalg türüne göre değişkenlik gösterse de mikroalgler, %2 ile %40 arasında yağ biriktirebilirler (Demirbaş ve Demirbaş, 2010). Bazı mikroalg türlerinin % yağ asidi miktarları Çizelge 1.1’ de verilmiştir.
Çizelge 1.1. Bazı mikroalg türlerinin % yağ asidi miktarları (Demirbaş ve Demirbaş, 2010).
Mikroalg Türü Protein Karbonhidrat Yağ Nükleik
Asit Scenedesmus obliquus Scenedesmus quadricauda Scenedesmus dimorphus Chlamydomonas rheinhardii Chlorella vulgaris Chlorella pyrenoidosa Spirogyra sp. Dunaliella bioculata Dunaliella salina Euglena gracilis Prymnesium parvum Tetraselmis maculata Porphyridium cruentum Spirulina platensis Spirulina maxima Synechoccus sp. Anabaena cylindrica % 50-56 47 8-18 48 51-48 57 6-20 49 57 39-61 28-45 52 28-39 46-63 60-71 63 43-56 % 10–17 - 21–52 17 12–17 26 33-64 4 32 14-18 25-33 15 40-57 8-14 13-16 15 25-30 % 12-14 1,9 16-40 21 14-22 2 11-21 8 6 14-20 22-38 3 9-14 4-9 6-7 11 4-7 % 3-6 4-5 1-2 2-5 3-4,5 5 -
Mikroalgler tatlı, acı ve tuzlu suda gelişim gösterebilen fotosentetik mikroorganizmalardır. Bu mikroorganizmalar, bir biyokütle oluşturabilmek ya da transesterifikasyon ile biyodizele dönüştürülebilen triaçilgliserolleri (TAG) biriktirebilmek için güneş ışığını kullanırlar (Gour, vd., 2016). Mikroalglerden üretilen lipitler, transesterifikasyon işleminin ardından, yağ içeren tohumlar kullanılarak üretilen diğer lipitlere benzerler ve biyodizelin kaynağını oluştururlar. Transesterifikasyon işleminin optimize edilmesi, alglerden
biyodizel üretiminin maliyetini düşürmek için büyük fayda sağlayacağı düşünülmektedir (Jones ve Mayfield, 2012).
Her ne kadar mikroalgler biyodizel üretimi için büyük umutlar vaat ediyor olsa da, ticari olarak üretilebilmesi için bazı iyileştirme çalışmaları yapılması gerekmektedir (Cheng ve He, 2014). İyileştirme çalışmaları aşağıdaki gibi özetlenebilir:
Biyodizel üretirken en iyi sonucu alabilmek için çalışmada kullanılacak mikroalg suşunun iyi seçilmesi,
Biyomühendislik çalışmaları ile biyoyakıt üretimi için tüm koşulların optimize edilmesi,
Büyük ölçekli mikroalg üretimi için gerekli olan biyoreaktörün tasarlanması, Üretim sonrası kullanılacak işleme teknolojilerinin belirlenmesi,
Üretim maliyetlerini ve tüketeceği enerji miktarını planlanması gerekmektedir (Chen vd., 2018).
Mikroalg bazlı biyodizelin ekonomik fizibilitesini arttırabilmek için, biyokütle, lipit ve karbonhidrat verimliliği optimize edilmelidir. Mikroalglerin biyokütle verimliliğinin arttırılması ya da istenilen biyokimyasal bileşenlerin üretilebilmesi için ortam koşullarını ya da ortam içeriklerini değiştirmek yeterli olabilmektedir. Mikroalglerin lipit ve karbonhidrat içeriği, azot ve fosfat eksikliği veya tuzluluk stresi gibi kimyasal uyarıcılar, kültür pH' ındaki değişiklikler, sıcaklık ve ışık yoğunluğu veya fotoperiyotlar gibi fiziksel uyarıcılar ile arttırılabilmektedir (Pancha vd., 2014).
Bu besin maddelerinin eksikliğinde birçok farklı türün alg biyokütlesi içindeki lipit konsantrasyonlarının önemli ölçüde artırabileceği ortaya konulmuştur.
Rodolfi vd. (2009), deniz yosunu Nannochloropsis sp. 3 günlük azot açlığından sonra lipit konsantrasyonunu 4 kat (~% 15 ila ~ 60) arttırdığını belirtmiştir (Schnurr, vd., 2013).
Griffiths vd. (2011), C.vulgaris’ in belirli suşlarında azot sınırlandırılması yaparak 7. günde %39, 14. günde %57 ye ulaşan lipit birikiminin olduğunu gözlemlediğini rapor etmiştir (Griffiths, vd., 2011).
Wang vd. (2012), Scenedesmus dimorphus türünde yaptığı çalışmalarda azot konsantrasyonlarını değiştirerek, azotun hiç olmadığı koşullarda lipit birikiminin en fazla olduğunu rapor etmiştir (Wang, vd., 2012).
Çakmak (2013), yedi ve on günlük inkübasyon sonrasında N, S, K, P, Mg, Ca, Zn ve Fe element açlıklarına cevap olarak Chlamydomonas reinhardtii hücrelerinin nötral lipit içerikleri sırasıyla; %22-95, %87-128, %37-42, %137-407, %99-253, %44-30, %15-79 ve %60-151 oranlarında artış gösterdiğini rapor etmiştir (Çakmak, 2013).
Bu nedenle, besin açlığı biyokütle hasadından önce nötr lipitlerin verimini kontrol etmek ve arttırmak için önemli bir endüstriyel strateji olabilir.
Mikroalgler, çeşitli biyokimyasallar ve biyoyakıt üretimi açısından gelecek vaad etmektedir. Ancak bu ürünlerin üretimi sonrası sucul ortamlardan izole edilmesi ve yoğunlaştırılması kısaca biyokütlenin hasatlanması ciddi ekonomik sıkıntılar yaratmaktadır (Christenson ve Sims, 2011; Uduman, vd., 2010). Mikroalglerin sıvı ortamda planktonik olarak kültürlendiği sıradan yetiştirme teknikleri, düşük biyokütle üretkenliği, hasat işleminin zorluğu, yüksek kurulum ve işletme maliyeti, yüksek su gereksinimleri vb. gibi birçok sıkıntı yüzünden yapılan çalışmaları sınırlandırmaktadır. Günümüzde biyofilm bazlı yetiştirme sistemleri oldukça ilgi görmektedir. Bunun sebebi ise sistemde harcanan su ve enerji miktarlarının oldukça düşük olmasıdır. Her ne kadar mikroalglerin biyofilmlerini oluşturduğu yüzeylerin tıkanması bir sıkıntı olarak görülse de, mikroalglerin katı bir yüzeye bağlı olarak kültürlendirildiği, yenilikçi bir teknoloji olarak ortaya çıkmıştır. Bu teknik, geleneksel kültürlenme sistemlerine kıyasla avantajlı görünmektedir (Mantzorou ve Ververidis, 2019). Bu yüzden alglerin ve lipitlerin ticari üretimini sağlamak ve ekonomik maliyeti azaltmak için, biyofilm sistemlerinin kullanılması alternatif bir yöntem olarak düşünülmektedir. Ancak bu konu üzerine yapılan çalışmaların sayısı oldukça sınırlıdır (Christenson ve Sims, 2012; Irving ve Allen, 2011; Johnson ve Wen, 2010; Ozkan, vd., 2012).
Bu çalışmada biyokütle işleme maliyetlerini azaltmak için geleneksel süspansiyon kültüründen farklı olarak alglerin biyofilm formunda üretilmesi ve bu üretimde besin stresi yaratmanın biyofilm ve lipit oluşumu üzerine etkileri araştırılmıştır.
2. LİTERATÜR ÖZETİ
2.1. Alglerin Tanımı
Thallophytes olarak da tanımlanan algler, tek hücreli veya çok hücreli formlarda olabilen basit, fotosentetik sucul organizmalardır. Başlangıçta algler sucul bitkiler olarak tanımlanıyorken, yüksek bitkiler gibi kökleri, embriyoları ve vasküler sistemi olmadığından bitkilerden ayrı bir yerde kategorize edilmektedir (Sankaran, vd., 2018). Alglerin çoğu tatlı su ve deniz ortamlarında yaşayan ototrof canlılardır. Siyanobakteriler ve diyatomlar gibi küçük tek hücreli mikroalglerden, kelp yosunu gibi büyük çok hücreli makroalglere kadar çeşitlilik göstermektedirler (Bule, vd., 2018). Boyutları 3-10 µ’ dan 70 cm uzunluğuna çıkabilir ve günde 50 cm’ e kadar uzayabilirler (Aktar ve Cebe, 2010).
Algler her yerde gözlemlenebilen birer canlı olsalar da, bazı özgün türler belirli habitatlarda yaşarlar. Bazı algler, bitkiler gibi katı bir zemine bağlanır, bazıları hayvanlar gibi hareket eder, bazıları su içinde asılı, bazıları toprakta, ağaçlarda ve hayvanlara bağlı olarak büyürken, bazıları diğer organizmalar ile simbiyotik ilişki içerisindedir (Richmond, 2013).
2.2. Alglerin Taksonomideki Yeri
Alglerin tek bir monofiletik grupları yoktur ve bundan ötürü kolayca tanımlanamazlar (Richmond, 2013). Algler ve bitkiler aynı depolama bileşiklerini üretmekte, ayrıca avcılara ve parazitlere karşı benzer savunma stratejileri kullanmaktadır. Bazı algler ve bitkiler arasında güçlü bir morfolojik benzerlik vardır; bununla birlikte algleri bitkilerden ayırmak oldukça kolaydır çünkü algler ve bitkiler arasındaki benzerlikler, farklılıklarından çok daha azdır. Bitkilerin kökleri, yaprakları, ksilem ve floem olarak adlandırılan iletim demetlerini içeren çok gelişmiş bir vasküler sistemleri vardır. Dahası, üreme tüm bitkilerde bir haploid gametofit ve bir diploid sporofit arasında bir geçiş ile bir digenetik yaşam döngüsüne sahiptir ve embriyo oluştururlar. Alglerin ise kökleri, gövdeleri, yaprakları, iyi tanımlanmış bir vasküler sistemi yoktur ve embriyo oluşturamazlar. Ayrıca algler, mikroskobik tek hücreli, makroskobik çok hücreli serbest veya biyofilm oluşturan grupları, keçeleşmiş veya dallanmış koloniler gibi farklı biçimlerde ortaya çıkmaktadırlar. Sonuç olarak, algler ile bitkiler aynı grup içerisinde değerlendirilemezler (Barsanti ve Gualtieri, 2005).
Bitkilerinin dışında kalan fotosentetik ökaryotlar ya da protistler olarak basitçe tanımlanabilen algler, şaşırtıcı bir hücre morfolojisi ve yaşam döngüsü dizisine sahiptir ve çok sayıda habitatta yaşamaktadır (Bhattacharya ve Medlin, 1998). Algler, makroalg ve oldukça
fazla çeşidi olan mikroorganizmal mikroalg olarak sınıflandırılabilen, fotosentetik sucul organizmalardır (Demirbaş, 2010; Barsanti ve Gualtieri, 2005). Algler, Chlorophyta (yeşil algler), Rhodophyta (kırmızı algler), Glaucocystophyta, Euglenophyta, Chlorarachniophyta, Heterokonta, Haptophyta, Cryptophyta ve dinoflagellatlar olarak sınıflandırılabilmektedir. Son dört gurubu basit bir şekilde kromofit algleri olarak isimlendirilir. Bunun sebebi klorofil-a, klorofil-b, sarı veya kahverengi görünmelerini sağlayan ksantofil pigmentlerini bulundurmalarıdır (Bhattacharya ve Medlin, 1998). Mikroalgler, tuzlu ve tatlı su ortamlarında yaşayabilen, fotosentez yapan mikroskobik canlılardır. Mikroalgler, özellikle içerdikleri pigmentlere, yaşam döngülerine ve hücresel yapılarına göre çeşitli sınıflara ayrılmaktadır (Demirbaş, 2010). Günümüzde bilinen alg sayısının 30,000 ile 1 milyondan fazla tür arasında değişim gösterdiği tahmin edilmektedir (Barsanti ve Gualtieri, 2005).
2.3. Alglerin Evrimi
Algler ve karasal bitkiler arasındaki ilişki, filogenetik sınıflandırmanın henüz ortaya çıkmadığı zamanlardan beri bilinmektedir. Bulunan fosillerin morfolojik tanısı ve moleküler çalışmalardan elde edilen verilerin yardımıyla alglerle, karasal bitkilerin arasındaki evrimsel bağlantılar ortaya konulmuştur (Aktar ve Cebe, 2010).
Yapılan çalışmalara göre alglerin bir buçuk milyon yıl önce ortaya çıktığı düşünülmektedir ve karasal bitkilerin bu soydan ayrılması 425-490 milyon yıl önce gerçekleşmiştir. Suların çekildiği Siluriyen devrinin şartlarından dolayı, kıyılardaki alglerin kuru ortama ve diğer ekstrem şartlara dayanabilecek şekilde evrimleştiği düşünülmektedir. Gerçekleşen doğal seçilim, bitki evriminin yeni bir yol girmesine neden olmuştur (Aktar ve Cebe, 2010)
Prokaryotik siyanobakterilerin fosilleri, bazı bölgelerin çökeltilerinde bulunmuştur ve bu fosillerin yaklaşık 3,8 milyar yıl öncesine ait olduğu düşünülmektedir. Canlılığın başladığı tarihten bu yana, dünyanın oksijen ihtiyacını karşılayan fotosentezin gerçekleştiği bilinmektedir. Ökaryotik alglerin kökeni kesin olarak bilinmemekle birlikte, yaklaşık 2 milyar yıl önce ortaya çıkmış olabileceği düşünülmektedir (Richmond, 2013).
Ökaryotik alglerin tek bir soyu olmadığı ve bu nedenle alglerin tek bir monofiletik bir grubunun olmadığı bilinmektedir. Bununla birlikte, plastid yapısı ökaryotik algleri fotosentetik protistalardan ayırmaktadır ve alglerde bulunan plastid genomunun kökeni primer endosimbiyosis olarak adlandırılan olaya kadar uzanmaktadır. Primer endosimbiyosis, yaklaşık
2 milyar yıl önce fotosentetik olmayan bir ökaryotun siyanobakteriyi içine almasıyla başlamaktadır. Ökaryot canlı yuttuğu bu siyanobakteriyi sindirmek yerine bir nevi köle olarak kullanmaya başlamıştır. Zamanla bu köleleştirilmiş hücrenin konakçı içine yerleşmiş olabileceği ve bir kloroplasta dönüştüğü düşülmektedir (Richmond, 2013).
2.4. Alglerin Anatomik Yapıları
Alglerin yapısının, hayvan ve bitki hücrelerinden çok daha çeşitli olduğu bilinmektedir. Bu geniş filogenetik çeşitliliğini, çevreye olan adaptasyonları ve 3,5 milyar yıllık evrimsel değişimleri sağlamaktadır. Siyanobakteriler nispeten daha basit hücrelere sahiptir ve daha çok bakterilere benzemektedirler. Ökaryotik hücrelerin yapıları çok daha karmaşıktır, evrimsel tarihi yaklaşık 1,5-2 milyar yıl arasındadır ve bu yapılar alg sınıfları ve kendi içerisinde önemli ölçüde farklılık gösterir. Ökaryotlar çok sayıda organel içerir ve bunlar özelleşmeyi sağlayan önemli metabolik bölümlerdir. Ökaryotik alglerin bir çekirdeği ve genellikle bir veya daha fazla kloroplastları vardır; Ayrıca mitokondri, golgi cisimciği, endoplazmik retikulum gibi tipik ökaryotik organallere sahiptirler (Richmond, 2013).
2.4.1. Hücre duvarı
Alglerin hücre duvarı, sitoplazmayı tamamen saran ve turgor basıncının artmasına bağlı olarak hücrenin patlamasına engel olmayı sağlayan oldukça sağlam bir yapıdır. Hücre duvarının biyokimyasal yapısı alg grupları arasında farklılık göstermektedir. Siyanobakteriler, genellikle fibril tabakaları ile birlikte peptidoglikandan oluşan bir hücre duvarına sahiptirler. Yeşil Alglerde ise hücre duvarı selüloz, hemiselüloz, pektin içeren bileşikler ve glikoproteinden oluşur. Bu maddeler, hücrenin çoğu kısmını kapsayan fakat her tarafını sarmayan ince organik bir katmandır. Selülozik malzemeler, silikat cam veya kalsiyum karbonat kristalleri olabilmektedir. Öglenaların kabukları, kriptofitlerin periplastları ve birçok çeşitte müsilajlı salgılar gibi değişik şekilde hücre kaplamaları vardır (Richmond, 2013).
2.4.2. Hücre organelleri
Kloroplast, ökaryotik alglerin baskın organelidir ve tabaka benzeri tilakoidlerinde, zara bağlı fotosentez için ışık yakalayan pigmentler bulunmaktadır. Tilakoid düzenek alg grupları arasında tutarlıdır fakat şekilleri gruplar arasında farklılık gösterir ve sadece yeşil algler fotosentatlarını kloroplastları içinde depolar. Bu nedenle, yeşil alglerin plastidlerinin içinde nişasta taneciklerine rastlanır. Ancak diğer tüm alglerde karbonhidrat veya lipit depolaması plastidin dışındadır. Alglerde lipit birikimi çok yaygındır ve bu lipitlerin görünümleri genellikle
alglerin fizyolojik veya çevresel koşulları ile ilgilidir. Örneğin; hücreler yüksek ışık stresi veya besin eksikliği altındayken lipit cisimlerinin sayısı ve büyüklüğü artar (Ball, vd., 2011). Kloroplastın kendi deoksiribonükleik asidi (DNA) tipik olarak dairesel formdadır ve bununla birlikte bu DNA sadece az sayıda geni kodlar, çünkü çoğu gen çekirdekte kodlanmıştır (Richmond, 2013).
Alglerdeki mitokondrinin çeşitliliği hayvanlar ve bitkilerden daha fazladır. Yeşil ve kırmızı algler, bitki veya hayvanlarınki gibi yassılaşmış mitokondriyal kristaya sahiptir. Golgi cisimciği ve endoplazmik retikulum gibi organeller genellikle yapı olarak ökaryotlarınkiyle benzerdir. Algler bu organelleri organik silikat ve kalsiyum karbonat bileşiklerin yanı sıra flagella ve diğer yapıları üretmek için kullanırlar. Ökaryotik hücreler bir veya daha fazla tipte vakuol içerebilirler. Sert ve eksiksiz hücre duvarı bulunduran hücrelerin vakuolleri, tipik bitki vakuolüne az derecede benzer ve vakuol organizmal bütünlüğü koruyan pozitif bir ozmotik basıncın muhafaza edilmesi için işlev görür. Bazı algler, hücre elemanlarının parçalanmasından veya yeniden şekillendirilmesinden elde edilen yan ürünlerin depolanması için vakuolleri kullanır (Richmond, 2013).
Ökaryotik flagella, su içerisinde alglerin hareketini sağlayan bir hücre elemanıdır. Alglerde bulunan temel flagella yapısı değişkenlik gösterebilmektedir. Su içerisindeki bir algin flagellası hücre iskeletine büyük bir kuvvet uygular bu yüzden flagella hücreye çok sağlam bir şekilde bağlıdır. Flagella oluşturulurken birçok aşamadan geçer. Flagella ilk oluşturulduğunda olgunlaşmamış flagella olarak adlandırılır. Hücre bölündüğünde bu olgulaşmamış flagella geri çekilir ve yerini olgunlaşmış flagella alır. Bu süreç “flagellar dönüşüm” olarak adlandırılmaktadır. Alglerde flagella ile ilişki içerisinde olan göz lekeleri bulunur ve bu göz lekeleri ışığın yönünü tespit eder buna bağlı olarak flagella ile birlikte çalışarak fototaksis olayının gerçekleştirilmesini sağlar (Richmond, 2013).
2.5. Mikroalglerin Büyümesi Üzerine Etkili Olan Faktörler
Alglerin büyüme hızı fiziksel, kimyasal ve biyolojik faktörlerden etkilenir. Fiziksel faktörlerin en önemlileri ışık ve sıcaklık iken, kimyasal faktörlerin başında besinlerin bulunabilirliği ve karbondioksit konsantrasyonu gelmektedir. Biyolojik faktörlere ise, türler arasındaki rekabet ve virüs enfeksiyonları örnek olarak verilebilir (Larsdotter, 2006). Mikroalglerin büyümesi üzerine etkili olan faktörlerin başında besin elementlerinin varlığı ve bunların miktarları, sıcaklık, ışık ve pH değerleri gelmektedir (Çakmak, 2013). Çalışma faktörleri ise yukarıda belirtilen tüm faktörleri etkileyen bir faktördür ve biyoreaktör tasarımı,
karıştırma ve seyreltme oranı bu çalışma faktörlerine örnek olarak verilebilmektedir (Larsdotter, 2006).
2.5.1. Besin elementleri
Mikroalglerin fotootrofik üretimlerinde gerekli olan besinler makro elementler, mikro elementler ve vitaminlerdir. Alglerde en az 56 elementin var olduğu yapılan çalışmalar ile ortaya konulmuştur. Bu elementlerden Azot (N), Fosfor (P), Potasyum (K), Kükürt (S), Sodyum (Na), Magnezyum (Mg) ve Kalsiyum (Ca) gibi elementler çokça bulunmaktadır (Chisti, 2007).
Makro elementlerden biri olan azot, en fazla gereksinim duyulan element olup aminoasitler ve nükleik asitler dâhil birçok hücre bileşenin temelini oluşturur. Bu nedenle azot eksikliği, mikroalglerin gelişimlerini önemli ölçüde etkileyen bir faktördür. Çeşitli çalışmalardan elde edilen sonuçlar ışığında ise, yağların biyosentezi ve depolanması, azotun sınırlı olduğu ve hiç azot olmayan durumlarda başarılmıştır (Chisti, 2007). Mikroalgler azot kaynağı olarak nitrit, nitrat, amonyum ya da üreyi kullanırlar. Bu azot tuzlarının kullanımındaki öncelik sırası amonyum > üre > nitrat > nitrit şeklindedir (Elcik ve Çakmakçı, 2017).
Fosfor elementi, hücrede gerçekleşen metabolik reaksiyonlarda, mikroalglerin büyümesi ve gelişmesi için gerekli olan bazı yapısal ve fonksiyonel maddeleri oluşturmak üzere önemli bir rol oynar. Fosfor, ortamda fosfor tuzları K2HPO4, KH2PO4, Na2HPO4.12H2O, Na2HPO4.7H2O, NaH2PO4.7H2O şeklinde bulunmaktadır. Fosfor eksikliğinin, mikroalglerde lipit birikimini indüklediği bilinmektedir (Çakmak, 2013). Ayrıca fosfor, hücre gelişimi ve mikroalglerin metabolizmal reaksiyonları için gerekli bir makro elementtir. Enerji üretimi, hücre içi sinyal iletimi, fotosentez ve solunum reaksiyonları gibi metabolik reaksiyonlarda önemli rol oynamaktadır (Elcik ve Çakmakçı, 2017).
Kükürt, azot ile birlikte proteinlerin yapıtaşlarını oluşturur. Kükürt ayrıca tiamin ve biotin gibi vitaminlerin yapısında da bulunmaktadır. Canlı bir hücrede moleküler kükürt, organik kükürde çevrilir ve sülfat iyonu halinde hücrede yeniden kükürt bileşikleri üretebilmek üzere biriktirilir (Çakmak, 2013).
Potasyum, organizmalarda eriyebilir tuzlar şeklinde bulunur. Hücrelerin ozmotik basıncının düzenlenmesinde önemli görevi vardır ve özellikle erimiş halde K+ katyonu şeklinde bulunup turgor basıncının oluşturulmasını sağlar. Ayrıca solunum ve fotosentez enzimlerinin aktifleştirilmesinde de kofaktör olarak görev yapar (Çakmak, 2013).
Kalsiyum, Ca+2 iyonları şeklinde bulunup, hücre çeperinin üretim aşamalarında görev alır. Hücre zarının görevlerini yerine getirebilmesi için kalsiyum çok gereklidir ve canlının çevresel etkilere gösterdiği çeşitli tepkilerin oluşturulmasında sekonder haberci rolü oynadığı bilinmektedir (Çakmak, 2013).
Magnezyum, hücrelerde Mg+2 iyonları şeklinde solunum reaksiyonlarında, fotosentezde, DNA ve Ribonükleik asit (RNA) sentezlenmesinde görevli olan enzimlerin aktifleştirilmesinde kofaktör olarak görev almaktadır. Ayrıca magnezyumun, klorofil molekülünün yapısını oluşturan önemli bir element olduğu bilinmektedir (Çakmak, 2013).
2.5.2. Işık
Işık, fotosentetik organizmaların canlılığını sürdürmeleri için zorunlu olan bir faktördür. Fotosentetik büyüme, her bir hücrenin kullandığı ışık enerjisi ile doğru orantılı olduğundan, biyokütle üretim ve işlemlerinde ışığın en uygun düzeyde uygulanması gerekmektedir. Işık yoğunluğunun artması ile birlikte fotosentetik organizmaların büyüme hızları da artmaktadır. Ancak ışık yoğunluğu belirli bir düzeyin üzerine çıktığında ise büyüme sınırlanabilmektedir. Yüksek ışık etkisi uzun süre devam eder ise organizmanın fizyolojik dengesi bozulabilmekte hatta organizmada geri döndürülemez zararlar meydana gelebilmektedir (Richmond, 2013).
Fotosentetik mikroalgler, karbondioksit ve ışığı kullanarak fotosentez reaksiyonlarını gerçekleştirmektedir. Işık kaynağına bağlı olarak absorbe edilen enerjiyi, adenozintrifosfat (ATP) ve nikotinamid adenin dinükleotit fosfat (NADP) gibi kimyasal bileşenlere dönüştürürler. Fotosentez etkinliği, ışık spektrumuna göre farklılık göstermektedir. Mikroalgler genellikle, 400-700 nm dalga boyundaki ışığı kullanarak fotosentez reaksiyonlarını gerçekleştirirler. Absorbe edilen ışığın dalga boyu mikroalg türüne bağlı olarak değişkenlik göstermektedir. Örneğin; yeşil mikroalgler fotosentez sırasında klorofil pigmentleri ile en iyi 450-475 nm ve 630-675 nm aralığındaki ışığı absorbe etmektedir. Mikroalg kültürlerinde, ışığın hangi şiddet aralığında yeterli doygunluğa ulaştığı, ışık kullanım verimliliğinin belirlenmesinde dikkat edilmesi gereken bir faktördür. Genel olarak, birçok fotosentetik mikroorganizmanın doygunluğa ulaştığı aydınlatma düzeyi 200 µmol·m-2·s-1 olduğu rapor edilmiştir (Elcik ve Çakmakçı, 2017)
Mikroalgler, ışığı fotosistemlerindeki anten kompleksi olarak adlandırılan sistemler ile yakalamaktadırlar. Antenler, fotosentez reaksiyonlarının gerçekleşmesinde rol alan yapılardır. Bu antenler, fotonları tutarak reaksiyon merkezlerine göndermekle görevlidirler. Mikroalgler
farklı ışık konsantrasyonlarına adapte olabilmek için fotosistem sayılarında ve antenlerinin boyutlarında değişkenlik meydana getirebilirler. Kültür ortamları için kullanılan ışık kaynağı doğal ya da yapay olabilir. Laboratuar ortamında yapay aydınlatma olarak floresan lambalar kullanılmaktadır. Farklı türdeki floresan lambaların yaydıkları ışık miktarları da farklı olduğu için, kullanılan lambanın özelliklerine dikkat edilmelidir. Kullanılan ışığın kültür ortamına ısı yaymasından kaçınılmalıdır (Çakmak, 2013).
2.5.3. Sıcaklık
Sıcaklığın biyokimyasal reaksiyonlar üzerindeki etkisi onu, alglerin biyokimyasal bileşimini etkileyen en önemli çevresel faktörlerden biri haline getirmektedir. Büyüme sıcaklığını optimal seviyenin altına düşürmek, membran sistemlerindeki lipitlerin doymamışlık derecesini arttırmaktadır. Hücresel membranların, özellikle tilakoid membranların, artan stabilitesi ve akışkanlığı, fotosentetik canlıyı düşük sıcaklıklarda ortaya çıkan foton inhibisyondan korumaktadır (Richmond, 2013).
Büyüme sıcaklığının optimal değerin altına düşürülmesinin, fotosentez ve solunum oranlarını korumak için uyarlanabilir bir mekanizma olarak enzim üretiminin arttırılmasına neden olabileceği de tespit edilmiştir. Bunun yanında, düşük sıcaklıklar, aminoasitlerin ve aminoasit türevlerinin, uygun çözünen maddeler halinde hücre içerisinde birikimini indükler. Bu olay, mikroalglerin soğuğa duyarlılığına veya toleransına katkıda bulunabilir. Büyüme için optimal bir sıcaklık, minimum hücre büyüklüğüne, hücresel karbon ve azot içeriğine sahip alg hücrelerin oluşmasına yol açarken, optimal seviyenin altında veya üstünde bir sıcaklık, hücre hacminde ve biyokimyasal içerikte artışlara yol açabilmektedir (Richmond, 2013).
Doğada bulunan alglerden bazıları yüksek sıcaklıkta yaşayabilirken bazıları yüksek sıcaklıklarda canlılığını devam ettirememektedir. Bu nedenle üretimi yapılacak alg türünün gelişim gösterdiği optimum sıcaklık aralığına dikkat edilmelidir. Genel olarak mikroalg türlerinin kültür koşullarında 16-27°C arasındaki sıcaklık değerleri tercih edilmektedir. Zira 16°C’ den düşük sıcaklıklar üremeyi minimuma indirirken, 35°C’ den yüksek sıcaklıklar ise genellikle öldürücü etki göstermektedir (Çakmak, 2013).
2.5.4. pH değeri
pH değeri, mikroalglerin metabolik olaylarını gerçekleştirmesinde önemli olan bir faktördür. pH değeri, besin alınımı ile doğrudan ilişkilidir. Mikroalglerde biyokütle gelişimi, pH 10-11’ in üzerine çıktığında inhibe olmaktadır. Birçok alg türünün gelişimi için gereken
optimum pH değeri 7-9 arasındadır. Ancak, bazı türler asidik veya alkali şartlarda da optimum gelişim gösterebilirler. Mikroalgler fotosentez yaparak CO2’ i kullanırlar ve bu olay sonucunda ortamın pH’ ı yükselir. Yükselen pH’ ı kontrol etmek için hidroklorik asit veya asetik asit kullanılır. Asetik asit, aynı zamanda karbon kaynağı olarak mikroalglerin gelişimine katkı sağladığı için hidroklorik aside göre daha avantajlıdır (Elcik ve Çakmakçı, 2017).
2.5.5. Kültürlenme sistemleri
Mikroalglerin kültivasyonu için kullanılan iki ana sistem vardır. Bunlar kapalı ve açık sistemler olarak adlandırılmaktadır. Kapalı sistemler, büyüme koşullarının daha iyi kontrol edilmesine izin verirken, açık sistemler hava ile temas ettiğinden dış faktörlerden büyük ölçüde etkilenmektedir. Bununla birlikte, açık sistemlerin kurulumu ve işletilmesi kapalı sistemlere oranla daha basittir ve bu ekonomik nedenlerden dolayı açık sistemler daha çok tercih edilmektedir (Larsdotter, 2006).
Açık sistemler
Ticari olarak alg yetiştiriciliğinde, kültürleri karıştırmak için dönen kolu ve yuvarlak olukları olan bir havuz veya dairesel göletler kullanılır (Şekil 2.1). Oluklu havuzlar, kıvrımları olacak biçimde hazırlanır ve düşük kesme kuvvetine sahip kürek şeklindeki çarklar ile karıştırılır. Fakültatif havuzlar ise genellikle bir metreden daha derindir ve algler genellikle yüzeye yakın yerlerde bulunur, bunun sebebi havuzun dibinin anoksik olmasıdır. Öte yandan, yüksek oranlı alg havuzları bir metreden daha derindir ve hafifte olsa sürekli olarak karıştırıldığı için havuzun her yeri oksijen bakımından zengindir (Larsdotter, 2006).
Açık sistemlerde maliyeti en aza indirmek için mikroalglerin atmosferdeki karbondioksiti ve güneş ışığı kullanması sağlanmaktadır. Fakat güneş ışığının kalitesi veya mevsimsel farklılıklardan dolayı mikroalgler bu çevresel şartlardan olumsuz etkilenebilmektedirler. Çoğu açık havuz sistemlerinde ve oluklu kanallarda, mikroalglere yeterli güneş ışığı sağlamak için genellikle 0,2-0,3 m derinliği olan sistemler kurulur. Açık sistemlerde olukların sterilizasyonunu sağlamak imkânsız olduğu için mikrobiyal kontaminasyon engellenememektedir. Açık havuzlar ve oluklar, fotobiyoreaktörlere kıyasla bazı avantajlara sahip olsa da, genel olarak düşük verimlilikleri yüzünden de büyük bir dezavantaja sahiptir (Gong ve Jiang, 2011).
Kapalı sistemler
Fotobiyoraktörler, içerisinde fotootrofların yetiştirildiği veya bir fotobiyolojik reaksiyonun gerçekleştirilmesi için kullanılan reaktörlerdir. Günümüzde fotootrofik mikrobiyal biyokütlelerin ticari üretimi, açık havuzlarda yetiştirilebilen birkaç mikroalg türü ile sınırlıdır. Mikroalglerin çoğu, mantar, bakteri ve protozoa ile kontaminasyon riski ve inoküle edilen orijinal türden bağımsız olarak baskın olma eğiliminde olan diğer mikroalglerin rekabeti nedeniyle dış mekânda kurulan açık sistemlerde yeterince uzun süre korunamaz. Fotobiyoreaktörler, çevresel etkenlerden, rakip mikroorganizmaların istilasından korunabileceği, nispeten daha güvenli olan ve koşulların istenen türlerin baskınlığını sağlamak için daha iyi kontrol edilebileceği kapalı bir kültür ortamı sunmaktadır. Bu nedenle fotobiyoreaktörler, bilinen 50,000 den fazla mikroalg türünün kültürlenmesine izin veren sistemlerdir (Richmond, 2013).
Fotobiyoreaktörler, ışığın büyük bir kısmının doğrudan kültür yüzeyine çarpmadığı, ancak kültürde olan hücrelere ulaşmak için şeffaf bir biçimde tasarlanan reaktör duvarlarından geçmesi gereken fotootroflar için kullanılan kültür sistemleri olarak tanımlanabilir. Fotobiyoreaktörler, kültür ve atmosfer arasında doğrudan gazların ve diğer kirleticilerin geçişine izin vermez ve bunu gerçekleştirirken kültür ortamındaki biyokütle gelişimini sınırlandıran bir etki göstermez (Richmond, 2013). Kapalı fotobiyoreaktörler, yüksek biyokütle üretkenliği ve kültür koşullarının daha kolay kontrol edilmesi nedeniyle büyük ilgi görmüştür (Gong ve Jiang, 2011).
Farklı amaçlar için tasarlanmış çeşitli fotobiyoreaktörler bulunmaktadır. Kapalı fotobiyoreaktörler, kapalı kanallar ve tübüler reaktörler olmak üzere iki ana sınıfa ayrılabilir (Şekil 2.2 ve Şekil 2.3). Geniş aydınlatma yüzeyine sahip olan tübüler fotobiyoreaktörlerde düz plakalar, mikroalglerin dış mekânlarda kültürlenmeleri için daha uygundur. Tübüler fotobiyoreaktörler, mikroalg biyokütlelerinin büyük ölçekli endüstriyel üretimleri için uygun olan reaktörlerdir. İç mekânlarda kurulan kapalı fotobiyoreaktörlerde, doğal güneş ışığı ya da metal halojenür lambalar kullanılabilirken, dış mekânlarda kurulan fotobiyoreaktörlerde ise, doğal güneş ışığı ya da güneş enerjisini toplayan cihazlar kullanılır. Dış mekan fotobiyo reaktörlerindeki mikroalglerden optimum fotosentetik verim alabilmek ve kültür ortamının karıştırılmasını sağlayabilmek için hava pompaları veya mekanik pompalar kullanılmaktadır. Fotobiyoreaktörlerin üretkenlikleri, ışık ve CO2 kaynaklarından, sıcaklık değişimlerinden, pH' dan, çözünmüş O2 kültür seviyelerinden ve seçilen mikroalg türlerinin performansından
etkilenir. Biyokütle ölçümleri veya büyüme hızı değerlendirmeleri, fotobiyoreaktörlerin potansiyelini ve alg suşlarının performansını değerlendirmede kritik öneme sahiptir. Mikroalglerin büyüme hızı, ortalama aydınlatma süresi, ışık doygunluğu sabiti ve biyokütle konsantrasyonundan etkilenebilmektedir. Optimal kültür koşullarında mikroalglerden yüksek verimlilik sağlanabilir. Taşıtların yakıt ihtiyacını karşılayabilmek için büyük ölçekli biyodizel üretimi, uygun kültür sistemleri tarafından yeterli biyokütle üretimi ile sağlanabilecektir (Gong ve Jiang, 2011).
Açık havuzların aksine, fotobiyoreaktörler düşük kirlenme, yüksek verimlilik, minimum buharlaşma, ulaşılabilir yüksek mikroalg yoğunlukları veya biyokütle konsantrasyonları, düşük CO2 kayıpları ve kültür koşulları üzerinde daha iyi kontrol avantajlarına sahiptir. Fotobiyoreaktörlerin en büyük dezavantajı kurulumu, işletme ve bakım maliyetlerinin yüksek olmasıdır. Bunlar daha yüksek üretkenlik ile kısmen telafi edilebilse de, maliyetli olması biyodizel üretimi için gerekli olan ölçekte mikroalg biyokütlesinin etkin üretimini sınırlandırmaktadır (Gong ve Jiang, 2011).
Şekil 2.1. Açık havuz sistemi (http://www.isfikirleri-girisimcilik.com/alg-ciftligini-az-sermayeyle-kurabilirsiniz).
Şekil 2.2. Tübüler fotobiyoreaktör (http://algler.biyokimyalab.org/kultur-sistemleri/).
Şekil 2.3. Kapalı fotobiyoreaktör (http://docplayer.biz.tr/47567865-Sifir-karbon-bgnalara-ulagmada-anahtar-bgr-cephe-onergsg.html).
Dönen algal biyofilm reaktörü (RABR)
Dönen algal biyofilm reaktörü (RABR), kısmen suyun içine batan bir silindir ve bu silindirin dışına tutturulmuş kaplama materyalinden oluşan biyofilm bazlı bir reaktör sistemidir (Şekil 2.4). Dönen algal biyofilm reaktörü, mikroalgal biyokütleyi hem suyun içine hem de dışına doğru döndürerek ışığa ve besin kaynağına eşit oranda maruz kalmasını sağlar ve hem alglerden hem de bakterilerden oluşan alg bazlı fotosentetik bir biyofilm üretir. Diğer biyofilm sistemlerine kıyasla bu reaktör, polimer, sedimantasyon ve santrifüjleme ihtiyacını ortadan kaldırarak ek faydalar sağlar ve bu nedenle, geleneksel büyüme sistemlerindeki gibi maliyetli hasat işlemlerini minimuma indirir. Hasat edilen biyofilmlerden biyoplastik, biyoyakıt, değerli farmasötik bileşikler ve zengin besi değeri olan hayvan yemleri gibi maddeler üretilebilir (Fica
ve Sims, 2016). Dönen algal biyofilm reaktörü, yüksek biyokütle üretimi, kolay hasat ve gelişmiş ışık kullanımı da dâhil olmak üzere geleneksel açık havuzlara ve fotobiyoreaktörlere oranla daha fazla avantajlara sahip olduğu bilinmektedir (Gross ve Wen, 2014).
Dönen algal biyofilm reaktörünün eşsiz geometrisi, kanal havuzlarına kıyasla mekân kullanımlarını sınırlandırmaz. Kanallı havuzlarda, alan sadece iki boyutlu olarak kullanılabilir, çünkü göletin derinliği nüfuz oranın hafifletilmesi için sığ olmalıdır. Dönen algal biyofilm reaktörleri ise dikey olarak mikroalg üretebilir ve bu üç boyutlu olabilme özelliği, alan kullanımı büyük ölçüde arttırır. Bu üç boyutlu olma özelliği, alanın sınırlı olduğu bölgelerde ekim yapılırken büyük avantaj sağlar (Gross, vd., 2015). Bu çalışmada, yapılan tüm araştırmaların ışığında, dönen algal biyofilm reaktörünü (RABR) laboratuar ortamına göre modifiye ederek, lipit birikim oranlarının üzerine etkisi araştırılmıştır.
Şekil 2.4. Dönen Algal biyofilm reaktörü (http://hardnewscafe.usu.edu/?attachment_id=8006).
2.6. Mikroalglerin Fotosentez Tepkimeleri
Fotosentez, güneş ışığının enerji dönüşümünü temsil eden bir olaydır. Bu işlemde, fotoototroflar tarafından güneş ışığı ve inorganik bileşikler kullanılarak, organik maddeler üretilmektedir. Dünyadaki tüm yaşam formları, metabolizmaları ve büyüme reaksiyonlarının gerçekleşebilmesi için doğrudan ya da dolaylı olarak fotosenteze ihtiyaç duyarlar (Richmond, 2013).
Ökaryotik ototrof mikroalgler, içerdikleri ışık yakalayan fotosentetik pigmentlerine göre ayrılmaktadır; Rhodophyta (kırmızı alg), Chrysophyceae (altın alg), Phaeophyceae (kahverengi alg) ve Chlorophyta (yeşil alg). Bu fotosentetik pigmentleri, kloroplast adı verilen özelleşmiş organellerinin içindeki tilakoid zarlarda ve kloroplastların sıvı fazı olan stromasında bulunabilir (Richmond, 2013).
Oksijenik fotosentez, karbondioksitin ve suyun karbonhidrata dönüştürülmesi için klorofil tarafından absorbe edilen ışığında yardımcı olduğu bir redoks tepkimesi olarak isimlendirilebilmektedir. Fotosentez temel olarak, ışığa bağımlı reaksiyonlar ve ışıktan bağımsız reaksiyonlar olmak üzere iki aşamada gerçekleşir. Işığa bağımlı reaksiyonlarda fotosentetik membranlar ışık enerjisini, Nikotinamid adenin dinükleotit fosfat hidrojen (NADPH) ve yüksek enerjili bir bileşik olan Adenozin trifosfata (ATP) dönüştürür. Stromada gerçekleşen ışıktan bağımsız reaksiyonlarda ise, karbondioksitin karbonhidratlara indirgenmesinde ışığa bağımlı reaksiyonlarda üretilen ATP ve NADPH kullanılır (Richmond, 2013).
Fotosentezdeki enerji ışıktan karşılanır. Günümüzde yapılan çalışmalarla ışığın foton adı verilen paketler halinde yayıldığı bilinmektedir. Fotosentetik pigmentler, fotonlarda bulunan bu enerjiyi absorbe eder ve fotokimyasal reaksiyonların gerçekleştiği merkezlerine aktarır. Fotondaki elektronları klorofil pigmentinden ayırmak ve yük ayrılmasını başlatabilmek için bir miktar enerjiye ihtiyaç vardır (Richmond, 2013).
Görünen ışığın dalga boyu, 380 nm mavi-mor renkten, 750 nm’ deki kırmızı renge kadar değişmektedir (Şekil 2.5). Enerji, dalga boyuyla ters orantılı olduğundan mavi ışığın bir fotonu, kırmızı ışıktaki bir fotondan daha fazla enerjiye sahiptir (Richmond, 2013). Bu yüzden fotosentetik etkinliğin, ışığın dalga boyuyla ilişkisinin olduğu söylenebilmektedir. Mikroalgler fotosentez için genellikle 400-700 nm dalga boyundaki ışığı kullanırlar ve bu absorbe edilen ışığın dalga boyu mikroalglerin türüne göre farklılık gösterebilmektedir (Elcik ve Çakmakçı, 2017).
Şekil 2.5. Görünür ışık (http://www.biyolojiportali.com/konu-anlatimi/8/18/Fotosentezin-Canlilar-Icin-Onemi-Gerceklestirdigi-Yapilar-ve-Isik).
Tüm fotosentetik organizmalar, ışık enerjisini absorbe edebilmek için organik pigmentlere ihtiyaç duyar. Organik pigmentler klorofil, karotenoid ve fikobilinler olmak üzere üç ana sınıfta incelemektedir. Klorofiller (yeşil renkli pigment) ve Karotenoidler (sarı ve turuncu renkli pigmentler) lipofilik iken, fikobilinler hidrofilik özelliktedir (Richmond, 2013).
Klorofil molekülü, merkezinde bir Mg atomu bulunduran tetrapirol bir halkadan ve uzun zincirli alkolden oluşur. Yapısal olarak birbirinden farklı a, b, c, d olarak adlandırılan klorofil çeşitleri vardır. Tüm klorofil çeşitleri, mavi veya mavi-yeşil (450–475 nm) ve kırmızı (630–675 nm) dalga boyundaki ışığı absorbe ederler. Klorofil-a, tüm fotootroflarda ortada ve reaksiyon merkezindeki kompleks moleküllerin bir parçası olarak bulunmaktadır. Işığın yakalandığı reaksiyonlarda ise klorofil-b veya c görev almaktadır. Anten pigmentleri olan klorofil-b, c veya d ışığın absorbsiyon aralığının genişletilmesinde görevlidir (Richmond, 2013). Klorofillerin ve karotenoidlerin miktar tayini metanol, etanol gibi organik çözücüler içerisinde ekstrakte edilerek yapılabilmektedir. Ekstraktın absorbansı spektrofotomerik olarak belirlenebilmekte ve belirli matematiksel formüller kullanarak hesaplanabilmektedir (Lichtenthaler ve Wellburn, 1983).
Fotosentezin ışığa bağımlı reaksiyonları kloroplastların tilakoid zarlarında gerçekleşir. Yüksek bitkilerin kloroplastlarında, grana adı verilen üst üste istiflenmiş tilakoid zarlar bulunur ve bu granalar stromal lamella adı verilen köprülerle birbirine bağlıdır. Buna karşılık çoğu alg suşunda tilakoidler üçlü paketler halinde dizilenmiştir. Bu tilakoid zarlar beş ana kompleks yapı
içermektedir. Bu yapılar, ışığı toplayan anten kompleksi, fotosistem II (PS II) ve fotosistem I (PS I), sitokrom b6/f, fotosentetik elektron taşınmasını ve fotofosforilasyonu sağlayan ATPsentaz pompasıdır (Richmond, 2013).
Işığa bağımlı reaksiyonlarının fotosentezdeki asıl görevi, karbon asimilasyonu için gerekli biyokimyasal indikatör olan NADPH ve ATP’ nin üretilmesini sağlamaktır. Işığa bağımlı reaksiyonlarda ışık, PSI ve PSII olarak isimlendirilen pigment-protein kompleksi olan sistem tarafından tutulur. Bu fotosistemler, Z şeklinde tasarlanmış bir elektron taşıma sistemi zinciriyle birlikte çalışır. Işığın tutulmasının ardından tilakoid boşlukta H2O parçalanır, sudan gelen 2 elektron ve hidrojenler sayesinde NAPDH üretilir. Aynı zamanda bir taraftan tilakoid boşlukta bir pH gradiyenti oluşturabilmek için protonlar pompalanır. Kemiozmotik hipoteze göre ATPsentaz pompası olarak adlandırılan yapı kullanılarak, pompalanan protonlar sayesinde ATP üretir (Richmond, 2013).
Işıktan bağımsız evre reaksiyonlarında CO2’ nin asimilasyonu için, iki molekül NADPH ve üç molekül ATP gerekmektedir. Karbon fiksasyonun reaksiyon mekanizması Calvin ve Benson tarafından 1940’ larda keşfedilmiştir ve CO2’ in şekere dönüşümün dört ayrı aşamada gerçekleştiğini açıklamışlardır. Karbondioksit ilk olarak Rubisko adı verilen bir enzimle katalize edilir ve bunun sonucunda oluşan 6 C kararsız ara bileşikten karbon eksiltmek için iki aşamada da NAPDH ve ATP kullanılarak gliseraldehit (PGAL) oluşturulur. Oluşturulan bu molekülün bir kısmı sirkülasyonun devam edebilmesi için ribulozbifosfat’ a dönüştürülür ve bu dönüşüm olaylarının her bir basamağı birer enzimatik reaksiyon dizisidir. Bu aşamanın sonucunda üretilen birincil ürün karbonhidratlar olarak kabul edilir ancak yağ asitleri, aminoasitler ve organik asitler de fotosentezin CO2 fiksasyonunda sentezlenir (Richmond, 2013).
Yağ asitlerinin ve triaçilgliserollerin sentezinin gerçekleşmesi, fotosentezdeki karbon yakalama reaksiyonlarıyla gerçekleşmektedir. Bu reaksiyonun gerçekleşme süreçleri, bir organizma için yağ asitleri öncüllerinin bulunmasını, dolayısıyla triaçilgliserollerin üretilme ve depolama özelliklerini değiştirebilmektedir. Yağ asitlerinin üretilmesi Asetil CoA’ nın karboksilasyonu ile başlar ve Asetil CoA karboksilaz olarak adlandırılan bir enzim tarafından katalize edilir. Malonil CoA oluşabilmesi içinde bir molekül ATP harcanır. Daha sonra üretilen Malonil CoA, bir taşıyıcı açil proteine transfer edilir, bu döngünün sürekli olarak gerçekleşmesiyle açil protein zinciri uzar ve kloroplasttan çıkar. Bu olay sonucunda üretilen yağ asitleri kloroplastı terk ettikten sonra tekrar Asetil CoA olarak endoplazmik retikuluma girer. Burada farklı lipitlere dönüşmeden önce bazı işlemlere tabi tutulurlar. İşlemler sona erdiğinde
üretilen yağ asitleri istenilen lipitlere dönüştürülür ya da lipitlere dönüştürülünceye kadar burada depolanır. Hücreler triaçilgliserolleri çoğunlukla enerji rezervuarları olarak ya da yapı taşları olarak kullanmak için depolar ve enerjiye ihtiyaç duyduğunda ya da membran yapısını yenilemek istediğinde bu molekülleri kullanır (Schuhman, vd., 2014).
Mikroalglerdeki triaçilgliseroller, transesterifikasyon yoluyla kolayca biyodizele dönüşebilme özelliğine sahiptir. Mevcut tarımsal ürünlerden elde edilen hasat dışında yüksek miktarda organik karbon üretebilecek yeni teknolojiler geliştirilmeye çalışılmaktadır. Büyük ölçekli mikroalglerin kültivasyonu, diğer biyoyakıt üretilen ürünlerden, 10-20 kat daha verimli olabilme potansiyeline sahiptir. Fotosentez ise CO2’ i yüksek enerji içeriğine sahip organik bileşiklere dönüştürülebilen ve böylece sürdürülebilir bir biyodizel üretimi için kaynak sağlayabilecek tek işlem olarak kabul edilmektedir (Sharma, vd., 2012).
2.7. Alglerin Lipit Üretim Mekanizmaları ve Lipit Kompozisyonu
Mikroalglerde fotosentez, bitkilere çok benzerdir ancak mikroalglerin daha yüksek fotosentez hızı ve daha hızlı büyüme oranları vardır. Buna bağlı olarak bitkilere göre daha yüksek miktarlarda lipit biriktirilebilirler (Gour, vd., 2016). Mikroalglerde üretilen lipitler, temel olarak doymuş yağ asitlerinden oluşan polar olmayan lipitler ve yapısal polar lipitler olmak üzere iki kategoride incelenebilmektedir (Luna, 2016). Besin yoksunluğu gibi stres koşulları altında birçok mikroalg türü, önceden oluşturulmuş membran lipitlerini ve yağ asitlerini, membran lipitlerinden, triaçilgliserollere dönüştürerek büyük miktarda lipit birikimini sağlayabilmektedir. Çoğu ökaryotik hücrede, depolanmış lipitler, basit yağ damlacıkları olarak depolanır (Xu, vd., 2016). Depolanan lipitler, ağırlıklı olarak doymuş yağ asitlerinden ve biyodizel yapımında transesterifikasyon işlemine tabi tutulabilen bazı doymamış yağ asitlerinden (TAG) oluşur. Yapısal lipitler ise suda yaşayan hayvanlar ve insanlar için gerekli olan doymamış yağ asitleri içeren lipitlerdir. Polar lipitler ve steroller, hücre ve organeller için seçici geçirgen özellik gösteren zarın yapısına katılırlar (Sharma, vd., 2012).
Mikroalglerin birçoğu, ortam koşullarının değişikliliğine cevap olarak lipit metabolizmasını etkili bir şekilde değiştirebilmektedir. Olumsuz çevre koşulları ya da stres altındayken mikroalgler kuru ağırlıklarının yaklaşık %20-50 kadarında triaçilgliserol formunda nötral lipit biriktirerek, bu koşullara dayanıklılığını arttırmaktadır. Stres koşullarında üretilen bu lipitler, biyodizel üretimi için uygundur. TAG’ ların oluşumu ve içeriği, mikroalglerin türüne özgüdür (Sharma, vd., 2012).
Çoğu mikroalgde lipit, çoğunlukla doymuş ve tekli doymamış C14-C20 yağ asitlerinden oluşur, bu nedenle lipit bazlı biyodizel üretimi için umut verici bir alternatif kaynak olarak kabul edilmektedir. Mikroalglerde biyodizel üretiminde kullanılan lipitlerin sentez yolları, yağ asidi sentaz (FAS) ve triasilgliserol (TAG) biyosentez yoluna dayanır. Genel olarak, yağ asidi sentaz enzim kompleksi, lipit bazlı biyodizel üretimi için doymuş yağ asitlerini (SFA) sentezler. Son yıllarda, yağ asidi ve TAG biyosentezi yolunda yer alan çeşitli anahtar enzimler ve fonksiyonel alanlar tanımlanmış ve spesifik lipit içeriğini arttırmak için genetik mühendisliğin yaklaşımlarıyla lipit üretimin indüklenebilmesi için bir potansiyel olarak görülmeye başlanmıştır. Bu nedenle, herhangi bir metabolik mühendislik stratejisi tasarlanmadan önce, belirli mikroalg türlerinde aktif olan biyosentetik yolun tipini belirlemek gereklidir (Sun, vd., 2018).
Doymuş ve tekli doymamış yağ asitleri (C12: 0, C14: 0, C16: 0, C16: 1, C18: 0 ve C18: 1) biyodizel üretimi için en uygun yağ asitleridir. Mikroalgler C14: 0, C16: 0 ve C18: 0 da dâhil olmak üzere doymuş yağ asitlerini sentezlemek için asetil-CoA karboksilaz (ACCase) ve tip II yağ asidi sentazı kullanabilmektedir (Sun, vd., 2018). Alglerin kloroplastlarındaki yağ asitleri, tip II yağ asidi sentaz tarafından sentezlenir. Malonil CoA, yağ asidi biyosentezi sırasında metabolik bir iskele görevi gören açil taşıyıcı protein (ACP) üzerine yüklenir ve ve ilk önce apo-ACP’ yi holo formuna dönüştüren bir fosfopantetiniltransferaz (PPTase) tarafından translasyon sonrası modifikasyona tabi tutulur. Bu modifikasyonun sonucunda oluşan “kol” yağ asidi biyosentezi boyunca büyüyen yağ asidini tioester bağı ile bağlar. ß-ketoaçil –ACP sentaz III, açil-ACP üzerinde, ß-keton uzatılmış 2-karbon birimi oluşturabilmek için asetil-CoA’ yı malonil-ACP ile yoğunlaştırır. Bu daha sonra ketoredüktaz (KR), dehidrataz (DH) ve enoilredüktaz (ER) enzimleriyle doymuş metilen birimlerine tamamen indirgenir. Bu döngü C4-C16’ yı uzatan KASI ve C4-C16’ dan C18’ i oluşturan KASII ile yedi kez tekrar eder. Olgun bir yağ asidi istenilen uzunluğuna ulaştığında, ya membran lipitlerine aktarılmak üzere açil-transferaz (AT) üzerindeki gliserol-3-fosfat’ a prokaryotik yol vasıtasıyla iletilir ya da ökaryotik yol vasıtasıyla yağ asidini FAS’ tan plastide göndermek için tioesteraz bölgesinin etkisiyle sitozole aktarılırlar. Bitkilerde, yağ asitleri tioesterazlar tarafından ACP’ den hidrolize edildikten sonra, plastid zarfın içine yayılırlar ve bir CoA ligaz enzimi tarafından koenzim A ile esterlenirler, buradaki yağ açil-CoA, membran fosfolipidleri ve depolama trigliseritleri içeren hücresel lipitlere dâhil olmak için kloroplasttan ayrılır (Blatti, vd., 2013).
Yağ asitleri kloroplastın dışına taşındıktan sonra bir açil-CoA sentetaz tarafından tekrar CoA’ ya transfer edilir ve endoplazmik retikuluma girer. Burada TAG, fosfatidilkolin ve
fosfatidiletanolamin de dâhil olmak üzere gliserollü lipitlerinin biyosentezi için merkezi metabolit olan fosfatidik asidi vermek üzere gliserol-3-fosfata aktarılmadan önce, daha fazla uzama ve desatürasyon gibi çeşitli modifikasyonlara maruz kalabilirler. Bu ürünler, açil transferazların etkisiyle açil kısımlarını değiştirebilir, böylece gliserollü lipitlerin çeşitliliğini arttırabilir ve hücrenin yağ asitlerini depo lipitlerinin üretimi için membranlardan geri dönüştürmesini sağlayabilir. Triaçilgliseroller hücre tarafından ihtiyaç duyulana kadar bir enerji ve yağ asidi kaynağı olarak depolandıkları lipit cisimlerine veya damlacıklarına taşınırlar (Şekil 2.6) (Schuhmann, vd., 2014).
Bitkilerdeki tioesterazlar (TE), prokaryotik ve ökaryotik lipit sonlandırma yolları arasındaki karbon akışını belirler ve lipit biyosentezinde metabolik bir bekçi görevi görür. Bitkilerdeki bu enzimlerin benzerleri mikroalglerde de tanımlanmıştır ve bu nedenle mikroalglerin de iki yol arasında yaptıkları ayrımın, bitkiler ile benzer bir mekanizma olması muhtemeldir. TE, fonksiyonel olarak yağ asidi kimliğini belirlediğinden ve bitkilerde yağ asidi bileşimini modifiye etmek için kullanıldığından, alg suşlarında gelişmiş biyodizel kalitesi için algal yağ asidi zincir uzunluğunu tasarlama çabalarında ön plandadır (Blatti, vd., 2013).
Laboratuar koşullarında veya dış ortamda mikroalg yetiştirebilmek ve yüksek lipit içeriği elde edebilmek için, dış stres koşullarına ve lipit indüksiyon tekniklerinin uygulanmasına ihtiyaç vardır. Lipit ve yağ asitleri bileşimindeki önemli değişikliklerin eşlik ettiği büyük miktarlarda TAG’ ların sentezi ve birikmesi, tek tek veya kombinasyon halinde tasarlanan kimyasal veya fiziksel çevresel uyaranların dayattığı stres koşulları altında gerçekleşebilmektedir. Mikroalglerde lipit indüksiyon teknikleri üzerinde azot veya fosfor açlığı, ışık, pH, sıcaklık, ağır metaller ve diğer kimyasallar dâhil olmak üzere besin stresinin kullanılması gibi çok çeşitli çalışmalar yapılmıştır (Sharma, vd., 2012).
Şekil 2.6. Mikroalglerde lipit biyosentezinin basit bir şeması (https://www.research gate.net/figure/A-simplified-scheme-proposed-for-the-lipid-biosynthesis-pathway-in-themicro algae_fig4_235396878).
2.8. Alglerin Lipit Üretim Mekanizmalarını İndükleyen Stres Koşulları ve
Verdikleri Cevaplar
Mikroalglerin biyokütle olarak arttırılması için, sıcaklık, ışık yoğunluğu, pH gibi çeşitli çevresel koşulların optimum hale getirilmesi gerekmekteyken, mikroalglerde lipit üretiminin arttırılması için azot, fosfat, sıcaklık, tuzluluk, pH ve ağır metaller gibi stres koşullarının yaratılması gerekmektedir (Wong, vd., 2016).
2.8.1. Azot stresi
Azot, klorofil ve protein sentezi için gerekli olan ana bileşendir (Wong, vd., 2016). Azot sınırlaması, lipit içeriğinin arttırılması için en sık kullanılan yöntemdir, çünkü ucuz, kullanımı kolaydır ve birçok türdeki lipit içeriği üzerinde güvenilir ve güçlü bir etkiye sahiptir (Griffiths, vd., 2011). Azot mikroalglerde, lipit metabolizmasını etkileyen en kritik besin maddesidir (Wong, vd., 2016). Azot eksikliği, düşük biyokütle verimliliği ve fotosentez oranı
