Scenedesmus dimorphus endüstriyel açıdan önemli olan bir alg türüdür. Bu çalışmada S. dimorphus biyofilm kültürlerinde azot stresinin lipit üzerine etkisi incelenmiştir.
Çalışma içerisinde S. dimorphus türü üzerinde planktonik olarak gelişim gösterebileceği kültür ortamı oluşturulmuş, %100 N ve %25 N içeren besiyerinde inkübasyona bırakılmıştır. S. dimorphus mikroalginin biyofilm oluşturma ve buna bağlı olarak yağ depolama kabiliyetinin incelenebilmesi için, içerisinde %100 N içeren besiyeri ile % 25 N içeren besiyeri bulunan dönen algal biyofilm reaktörü kurulmuştur.
Optik dansite sonuçlarının değerlendirilmesi
Yapılan araştırmalar besinlerin kullanılabilirliğinin, mikroalglerin büyümesinde, geniş alanlara yayılım göstermesinde ve lipit üretim metabolizmasında çok önemli bir etkiye sahip olduğunu göstermektedir. Bununla birlikte besin stresine bağlı olarak lipit üretiminin arttığı, hücre bölünme sayısının giderek azaldığını rapor etmiştir (Thompson, 1996). Bu çalışmada S. dimorphus mikroalginin kültürlendiği 25 günlük çalışma sonucunda %100 N içeren planktonik formunun OD değerleri, %25 N içeren planktonik formun OD değerlerine göre daha yüksek olduğu gözlemlenmiştir. %100 N içeren planktonik formun en yüksek OD değeri 25. günde ölçülmüş ve 3,174±0,16 olarak belirlenmiştir. %25 N içeren planktonik formun en yüksek OD değerine 25. günde ulaşılmış ve 2,378±0,1 olarak belirlenmiştir. Planktonik form üzerinde yapılan bu çalışmada azot eksikliğinin OD değerlerini arttırıcı etkisinin olmadığı sonucuna varılmıştır. S. dimorphus mikroalginin kültürlendiği dönen algal biyofilm reaktöründe %100 N içeren formun OD değerleri, %25 N içeren biyofilm formunun OD değerlerine göre daha yüksek olduğu gözlemlenmiştir. %100 N içeren biyofilm formunun en yüksek OD değeri 15. günde ölçülmüş ve 0,828±0,12 olarak belirlenmiştir. %25 N içeren biyofilm formunun en yüksek OD değerine 15. günde ulaşılmış 0,419±0,015 olarak belirlenmiştir. 15. günden sonra, dönen algal biyofilm reaktörünün açık bir sistem olmasına bağlı olarak buharlaşma meydana gelmiştir. Bu nedenle 1/15 gün besi takviyesi yapılmıştır. %100-%25 N içeren planktonik formun OD değerlerinin, %100-%25 N içeren biyofilm formunun OD değerlerinden yüksek çıkmasının nedeni, Dönen Algal biyofilm reaktöründeki ölçümlerin teknenin içerisindeki solüsyondan yapılması ve S. dimorphus mikroalginin halatlara tutunarak biyofilm oluşturmasıdır. S. dimorphus mikroalginin kültürlenmesinin sağlandığı %100-%25 N içeren planktonik formunda yapılan kuru madde analizi sonucunda, %100 N içeren planktonik ortamın kuru madde miktarının daha yüksek olduğu yapılan hesaplamalar sonucunda belirlenmiştir. S.
dimorphus mikroalginin kültürlenmesi için oluşturulan dönen algal biyofilm reaktöründe uygulanan %100-%25 N içeren biyofilm formunda da %100 N içeren ortamdaki kuru madde miktarının %25 N içeren biyofilm formuna göre daha yüksek olduğu belirlenmiştir. Yapılan bir çalışmada, mikroalgler üzerinde azot stresinin uygulanması, bazı biyokimyasal bileşenlerin miktarını arttırırken, biyokütle verimliliğinde azalma meydana getirdiğini rapor etmişlerdir (Procházková, vd., 2013). %25 N içeren ortamların kuru madde miktarı belirlenen günlerde artış göstermiş olsa da, kuru madde miktarlarının %100 N içeren formlara göre daha az olmasının nedeni azot stresinin mikroalgler üzerinde hücre sayısını azaltıcı yönde etki göstermesidir ve elde ettiğimiz bu sonuçlar rapor edilen diğer sonuçlarla uyumludur.
Total yağ miktarlarının değerlendirilmesi
Mikroalgler ortam koşullarının değiştirilmesine cevap olarak lipit metabolizmasını etkili bir şekilde değiştirmektedirler. Olumsuz çevre koşulları varlığında ya da stres koşulları oluşturulduğunda kuru ağırlıklarının yaklaşık %20-50 kadarında triaçilgliserol formunda nötral yağ biriktirerek, bu koşullara dayanıklılıklarını arttırmaktadırlar (Sharma, vd., 2012). Bu çalışmadan elde ettiğimiz sonuçlarda %100-%25 N içeren planktonik formlarda günlük olarak total yağ miktarında artış olduğu gravimetrik hesaplamalarla belirlenmiştir. %100 N içeren planktonik formun en yüksek total yağ miktarı 25. günde ölçülmüş ve 188 mg/g olarak belirlenmiştir. %25 N içeren planktonik formun en yüksek total yağ miktarı 25. günde ölçülmüş ve 129,6 mg/g olarak belirlenmiştir. Planktonik formlarda yapılan total yağ miktarlarının % cinsinden değerleri ise %100 N içeren ortamda en yüksek %11,84, %25 N içeren ortamda ise %12,95 olarak saptanmıştır. Griffiths ve arkadaşlarının yapmış olduğu çalışma içerisinde, uyguladıkları azot stresi sonucunda C. vulgaris, Neochloris oleoabundans ve Scenedesmus sp.’de lipit içeriğinin arttığını ve özellikle C. vulgaris ve Scenedesmus sp.’de 14. günün sonucunda bile lipit içeriğinin artmaya devam ettiğini rapor etmişlerdir (Griffiths, vd., 2011). Bu değerlere bakılarak planktonik form üzerinde azot stresinin uygulanması, total yağ miktarını arttırıcı yönde etki ettiğini göstermektedir ve elde ettiğimiz verilerin yapılan diğer çalışmalarla uyumlu olduğu sonucuna varılmaktadır.
S. dimorphus mikroalginin kültürlenmesi için tasarlanan dönen algal biyofilm reaktörü üzerinde çalışılan %100-%25 N içeren ortamda total yağ miktarının günlük olarak artış gösterdiği saptanmıştır. %100 N içeren biyofilm formundaki en yüksek total yağ miktarı 25. günde ölçülmüş ve 120 mg/g olarak belirlenmiştir. %25 N içeren biyofilm formunda en yüksek total yağ miktarı 25. günde ölçülmüş ve 138,2 mg/g olarak belirlenmiştir. Biyofilm formunda
yapılan incelemede total yağ miktarının % cinsinden değerleri %100 N içeren ortamda en yüksek %12, %25 N içeren ortamda ise en yüksek %13,81 olarak hesaplanmıştır. Bu değerlerin sonucunda biyofilm formunun üzerinde azot stresinin uygulanması, total yağ miktarını arttırıcı yönde etki ettiğini göstermektedir. Aynı zamanda yapılan ölçümler sonucunda %100 N içeren planktonik formun kuru madde miktarının, %25 N içeren planktonik formun kuru madde miktarına göre daha fazla olduğu fakat %100 N içeren planktonik formun kuru madde miktarı arttıkça %25 N içeren planktonik forma oranla % total yağ miktarının daha az miktarda arttığı belirlenmiştir. %100N içeren planktonik formun 25. günde kuru madde miktarı 2,404 g/L olduğunda, total yağ miktarının %11,84, %25 N içeren planktonik formun kuru madde miktarı 1,828 g/L olduğunda total yağ miktarı %12,95 olarak bulunmuştur. %100 N içeren biyofilm formunda 25. günde yapılan ölçümlerde kuru madde miktarının 0,275 g/m2 olduğunda total yağ miktarının %12, %25 N içeren biyofilm formunun kuru madde miktarı 0,268 g/m2 olduğunda total yağ miktarı %13.81 olarak bulunmuştur. Gross ve arkadaşlarının C. vulgaris ile yapmış oldukları çalışmaya göre dönen algal biyofilm reaktöründe yapılan biyokimyasal ölçümler sonucunda, karbonhidrat miktarı planktonik forma göre daha fazlayken, lipit miktarının planktonik forma göre az olduğunu, bu sonuçların sebebinin biyofilm oluştururken üretilen karbonhidrat içerikli hücre dışı polimerik madde miktarının artışına bağlı olduğunu rapor etmişlerdir (Gross ve Wen, 2014). Bu çalışmada tasarlanan dönen algal biyofilm reaktöründen elde edilen total yağ miktarlarının hem %100 hem de %25 N içeren ortamda, planktonik forma göre daha yüksek çıktığı belirlenmiştir. Diğer çalışmalara göre, laboratuar ortamında tasarladığımız dönen algal biyofilm reaktöründeki total yağ miktarının fazla çıkmasının nedeninin kullandığımız mikroalg türünün farklı olması, kültürdeki mikroalgleri azot stresine maruz bırakmamız, dönen algal biyofilm reaktörünü tasarlarken kullandığımız kaplama materyalini farklı kullanmamız ve mikroalglerin kültürlendirilmesini sağlayan besiyeri çeşidinin farklı olmasından kaynaklandığı düşünülmektedir.
Klorofil oluşumunun değerlendirilmesi
25 gün süren bu deneyde, %100-%25 N içeren planktonik form üzerinde yapılan klorofil-a ölçümlerinin sonucunda, %100 N içeren planktonik formun klorofil-a miktarının, %25 N içeren planktonik formun klorofil-a miktarından daha yüksek olduğu belirlenmiştir. Mikroalglerin kültür ortamlarındaki azot sınırlamasının hücre sayısı ve klorofil-a miktarlarında azalmaya neden olduğu gözlemlenirken, mikroalglerin biyokimyasal içeriğinde yağlar gibi organik bileşiklerin oranlarında artış elde edildiği bilinmektedir. Aynı zamanda mikroalgler üzerinde uygulanan azot eksikliği klorofil-a miktarını azaltırken karoten pigmentinin sayısını
arttırdığı için kültür ortamında sararmalar meydana getirdiği bilinmektedir (Shifrin ve Chisholm, 1981; Sukenik, vd., 1989). %25 N içeren planktonik formun klorofil-a miktarı %100 N içeren planktonik forma göre daha düşük çıkmış ve %100 N içeren planktonik formun en yüksek total yağ miktarı %11,84 olarak belirlenirken, %25 N içeren planktonik formun en yüksek total yağ miktarı %12,95 olarak belirlenmiştir. Daha önceki çalışmalarda alglerin besi ortamındaki azot miktarının azaltılmasıyla klorofil-a miktarının azaldığı fakat lipit miktarının arttığı rapor edilmiştir (Chu, vd., 1996;Geider, vd., 1998; Zhila, vd., 2005). Yapılan morfolojik gözlemlerde ise %25 N içeren planktonik formun renginde sararmalar meydana geldiği gözlemlenmiştir. Bu durum %25 N içerikli planktonik formun yağ miktarının %100 N içeren planktonik forma göre daha fazla olabileceğini düşündürmektedir. Bu sonuçlar doğrultusunda, besin ortamına eklenen azot miktarının azaltılmasının, lipit üretimini arttırdığı ve bu konuda daha önce yapılan çalışmalarla da uyumlu olduğu belirlenmiştir.
Dönen algal biyofilm reaktörünün ve S. dimorphus türünün biyofilm oluşturma
becerisinin değerlendirilmesi
Gross ve arkadaşlarının yapmış olduğu çalışmada, düşük maliyetli hasat işlemi ve yüksek biyokütle üretkenliği nedeniyle, dönen algal biyofilm sisteminin, süspansiyon bazlı kültür sistemlerine kıyasla alternatif bir alg yetiştirme sistemi olarak kullanılabilir özellikte olduğunu rapor etmişlerdir (Gross ve Wen, 2014). Büyük çaplı endüstriyel alg üretiminde hasat işleminin sonucunda elde edilen biyokütle miktarının önemli olmasından, kapalı bir ortam olan planktonik formun yerine biyofilm reaktörlerinin kullanılmasının daha kazançlı bir tercih olacağı düşünülmektedir. Aynı zamanda endüstriyel üretim açısından hasat işlemi de çok önemlidir. Bu çalışmada yapılan planktonik formun hasat işlemi çok yoğun santrifüj işlemi gerektirmiştir ve maliyeti fazladır. Biyofilm reaktörlerinde hasat işlemi planktonik kültürlenmeye göre daha kolaydır ve daha az miktarda santrifüj işlemi ile gerekli hasat elde edilebilmektedir. Bu yüzden büyük ölçekli endüstriyel alg üretiminde biyofilm reaktörlerinin kullanılması, biyokütle hasadının maliyetini düşürebileceği öngörülmektedir ve deneme sonucunda elde edilen veriler, daha önce rapor edilmiş bilgiler ile aynı doğrultudadır.
Dönen algal biyofilm reaktörünün tespit edilmiş iki tane dezavantajı vardır. Bunlardan birincisi açık bir sistem olduğundan başka alg türlerinin ve bakterilerin kontaminasyonuna açık olması, ikincisi ise besiyerinin buharlaşarak miktarının azalmasıdır. Bu yüzden sistem kurulduğunda istenilen biyokütleyi elde etmek için besiyeri miktarına dikkat edilmeli ve kritik sınırı aştığında mutlaka besiyeri takviyesi yapılması gerekmektedir. Gross ve arkadaşları, dönen
algal biyofilm reaktörünün, yüksek oranda biyokütle üretimi ve hasat işleminin kolay olması yönünden, açık havuzlara ve fotobiyoreaktörlere oranla daha fazla avantajlara sahip olan bir reaktör olduğunu belirtmişlerdir (Gross ve Wen, 2014). Bunlardan en önemlisi sisteme aşılanan mikroalglerin ışığa ve besiyerine eşit oranda maruz kalmalarıdır. Reaktör çalıştırıldığında ve disk dönmeye başladığında teknenin içerisinde giren kısım besiyeri bakımından zenginleşirken üste kalan kısım ışık ihtiyacını karşılar ve disk sürekli olarak belirli hızda döndüğünden halat üzerinde biyofilm oluşturmuş biyokütle eşit oranda besi ortamından ve ışıktan faydalanabilmektedir. Laboratuar ortamına uyarlanacak olan dönen algal biyofilm reaktöründe dikkat edilmesi gereken en önemli olay disk üzerine kaplanacak materyalin iyi seçilmesidir. Gross ve arkadaşlarının yapmış olduğu çalışmada son beş yıl içerisinde biyofilm bazlı kültürlenme gerçekleştirmek için kurulan reaktörlerin daha çok laboratuar ortamında kurulduğunu ve kaplama için kullanılan materyallerin pamuk bazlı malzemelerden, bozunmaz polimer tabakalara kadar değişkenlik gösterdiğini rapor etmişlerdir (Gross ve Wen, 2014). Daha önce yapılan çalışmalarda cam, polistiren köpük, tülbent bez, poliüretan köpük, vermikülit, jüt, polyester, karton, polilaktik asit, cam elyafı, pamuk kanalı, pamuk ipi gibi mikroalglerin biyofilm oluşturmasının denendiği materyaller rapor edilmiştir (Gross, vd., 2013; Johnson ve Wen, 2010; Shen, vd., 2014). Yapılan başka bir çalışmada ise, kaplama malzemeleri seçilirken dikkat edilmesi gereken başlıca özelliğin dayanıklılık ve yeniden kullanabilirliğin yanı sıra hücrelerin tutunma kabiliyetlerinin olması gerektiğini vurgulamışlardır (Gross, vd., 2013). Eğer bu materyal denemeleri yapılmazsa istenilen biyokütleyi elde etmek mümkün olmayacaktır ve büyük ölçekli endüstriyel biyokütle üretim maliyetini arttıracaktır. Mantzorou ve arkadaşlarının daha önce yapmış oldukları bir çalışmada, biyofilm oluşumunu destekleyici olan malzemenin dokusunun ve pürüzlü yüzeyinin hücrelerin yapışmasında kilit bir rol oynadığının kanıtlandığını belirtmişlerdir (Mantzorou ve Ververidis, 2019). Bu çalışmada denenen en pürüzlü yüzey olan hava taşında mikroalglerin tutunma oranlarının yüksek olduğu fakat hasat işlemini gerçekleştirirken çok fazla biyokütle kaybının yaşandığı sonucuna varılmıştır ve bu yüzden tercih edilmemiştir. Dönen algal biyofilm reaktörüne sardığımız polietilen halat ise hava taşına göre kısmen daha az pürüzlüdür fakat tutunma oranı ve hasat işleminin kolaylığı nedeniyle biyofilm oluşumunun sağlanabilmesi için substrat yüzeyi olarak tercih edilmiştir. Cui’ nin yapmış olduğu çalışmada S. dimorphus mikroalginin, çelik, naylon ve cam yüzeylerde biyofilm oluşturma oranlarını karşılaştırmış ve en yüksek tutunma oranının naylonda olduğunu rapor etmiştir (Cui, 2013). Bu çalışma içerisinde S. dimorphus mikroalginin farklı substratlara tutunma oranlarını incelerken naylon ip de kullanılmış fakat hasat işlemi sırasında ipin kıvrımlarının arasındaki biyokütlelerin toplanmasında sıkıntı yaşandığı için tercih edilmemiştir.
Bununla birlikte daha önce yapılan çalışmalarda biyofilm oluşturmada kullanılabilecek standart bir substratın henüz rapor edilmediğini belirtmişlerdir (Mantzorou ve Ververidis, 2019). Bu yüzden dönen algal biyofilm reaktöründe biyofilm oluşumunu desteklemek için daha fazla substrat denemelerinin yapılmasına ihtiyaç vardır. Ayrıca Mantzorou ve arkadaşlarının yapmış olduğu çalışmada planktonik ortamda kültürlenen biyokütlelerin hasat işleminde birçok sorun meydana geldiğini, biyofilm sistemlerinde ise hasat işleminin tutunma materyallerinden sıyrılarak gerçekleştirilebilen basit bir işlem olduğunu rapor etmişlerdir (Mantzorou ve Ververidis, 2019). Dönen algal biyofilm reaktöründe diskin üzerinde biyofilm oluşturan algleri, kaplamanın türüne göre kazıma ya da sıvı içinde çalkalama yöntemi kullanarak izole etmek mümkündür. Deneme ve gözlem sonucunda elde ettiğimiz veriler yapılan diğer çalışmalar ile paralellik göstermektedir.
Katarzyna ve arkadaşlarının yapmış olduğu bir çalışmada, her mikroalg türünün farklı özellikleri ve davranış şekilleri olduğunu, bu yüzden bazıları biyofilm oluşturarak gelişim gösterebilirken, bazılarının ise planktonik formda gelişim gösterebileceğini ve buna bağlı olarak da biyofilm sistemlerinin kurulumunda dikkat edilmesi gereken en önemli faktörün uygun alg türünün seçilmesi olduğunu rapor etmişlerdir (Katarzyna, vd., 2015). Yapılan bir diğer çalışma içerisinde Chlorella vulgaris ve Scenedesmus obliquus mikroalglerinin steril ve steril olmayan koşullardaki biyofilm oluşturma yetenekleri karşılaştırmış ve bu karşılaştırma sonucunda S. obliquus mikroralginin her iki koşulda da C. vulgaris’ e göre daha kalın biyofilm oluşturduğunu rapor etmişlerdir (Irving ve Allen, 2011). Bu çalışma için laboratuar koşullarına modifiye edilerek tasarlanmış olan dönen alg biyofilm reaktörüyle yapılan deneylerde S. dimorphus mikroalginin biyofilm oluşturma yeteneği incelenmiştir ve polietilen halatının üzerinden hasat edilen kuru madde miktarı baz alınarak S. dimorphus türünün yüksek biyofilm oluşturabilme yeteneğinin olduğu belirlenmiştir.
Azot stresinin lipit üretim mekanizması üzerine etkisinin değerlendirilmesi
Griffiths ve arkadaşlarının yapmış olduğu çalışmada azot sınırlamasının, depolanan lipit miktarının arttırılması için en sık kullanılan yöntem olduğunu ve sebebinin ise ucuz ve kolay uygulanabilir olduğunu belirtmişlerdir (Griffiths, vd., 2011). Bu çalışmada, planktonik ve biyofilm formunun üzerinde uygulanan, stres koşullarından biri olan azot eksiltme işlemi sonucunda elde edilen lipit miktarının arttığı sonucuna varılmıştır. Griffiths ve arkadaşlarının yapmış oldukları bir diğer çalışmada lipit verimliliğinin arttırılması, biyodizel üretim oranını belirleyen en önemli parametre olduğunu rapor etmişlerdir (Griffiths ve Harrison, 2009). Elde
ettiğimiz bu verilere bakıldığında azot stresinin uygulanması lipit verimini artırdığı sonucu çıkmaktadır ve bu sonuçlar daha önce yapılan çalışmaların sonuçlarıyla uyumludur. Stres koşullarında üretilen lipitler, biyodizel üretimi için kullanılabilir özelliktedir (Sharma, vd., 2012).