• Sonuç bulunamadı

Sigara kullanan ve sigara kullanmayan infertil erkeklerde sperm DNA hasarı ve apopitozis

N/A
N/A
Protected

Academic year: 2021

Share "Sigara kullanan ve sigara kullanmayan infertil erkeklerde sperm DNA hasarı ve apopitozis"

Copied!
98
0
0

Yükleniyor.... (view fulltext now)

Tam metin

(1)

T.C.

SELÇUK ÜNĠVERSĠTESĠ SAĞLIK BĠLĠMLERĠ ENSTĠTÜSÜ

SĠGARA KULLANAN VE SĠGARA KULLANMAYAN ĠNFERTĠL ERKEKLERDE SPERM DNA HASARI VE APOPĠTOZĠS

Fatma BAY

YÜKSEK LĠSANS TEZĠ

HĠSTOLOJĠ VE EMBRĠYOLOJĠ ANABĠLĠM DALI

DanıĢman

Prof. Dr. Ender ERDOĞAN

(2)
(3)

ii. ÖNSÖZ

Selçuk Üniversitesi Selçuklu Tıp Fakültesi Histoloji ve Embriyoloji ABD‟nda eğitimim süresince engin bilgi, beceri ve deneyimlerinden yararlandığım, hiçbir zaman güler yüzünü, destek ve imkânlarını esirgemeyen bölüm baĢkanımız, danıĢmanım Prof. Dr. Ender Erdoğan‟a ve tüm öğretim elemanlarına, tezin istatistiksel çalıĢmalarına olan katkılarından dolayı, S.Ü. Halk Sağlığı ABD BaĢkanı Yrd. Doç. Dr. Fatih KARA‟ya, Meram Tıp Fakültesi Histoloji-Embriyoloji ABD‟nda eğitimim süresince bana inanıp, bütün desteğiyle yanımda olan Prof. Dr. Murat Aktan‟a, her problemimde yanımda olan ve çalıĢmalarımda yardımlarını esirgemeyen S.Ü. Selçuklu Tıp Fakültesi Androloji Laboratuarı çalıĢanı Biyolog Rukiye Erdoğan‟a, hayatımı güzelleĢtiren sevgili eĢim Rasim, kızlarım Yağmur ve Zeynep Bahar ile her zaman desteklerini hissettiğim, yanımda olan ailem ve arkadaĢlarıma en içten teĢekkürlerimi sunarım.

(4)

ĠÇĠNDEKĠLER Sayfa SĠMGELER VE KISALTMALAR iv 1.GĠRĠġ VE AMAÇ 1 1.1. Spermin Yapısı 4 1.1.2. BaĢ Kısmı 6 1.1.3. Kuyruk Kısmı 7 1.2.Spermatogenezis 9 1.2.1.Spermatositogenez 10 1.2.2.Mayoz Bölünme 14 1.2.3.Spermiyogenez 16 1.3.Semen Analizi 19

1.4. Erkek Ġnfertilitesinin Değerlendirilmesi 41

1.5. Sperm DNA Hasarı ve Apoptozis 44

1.5.1.Spermatozoon DNA‟sı 44

1.5.2.Spermatozoon DNA‟sındaki Hasar ve Önemi 44

1.5.3.Apopitozis 46

1.5.4.TUNEL Yöntemi 50

1.6. Sigaranın Erkek Üreme Fonksiyonlarına Etkisi 50

1.6.1. Reaktif Oksijen Türleri 52

2.GEREÇ ve YÖNTEM 54 3.BULGULAR 57 4.TARTIġMA 75 5.SONUÇ VE ÖNERĠLER 82 6.KAYNAKLAR 83 7.EKLER 87

EK-A: Etik Kurul Kararı 87

EK-B: BilgilendirilmiĢ Olur Formu 88

(5)

iv. SĠMGELER VE KISALTMALAR

ABP Androjen Bağlayıcı Pebtid AMH Anti Müllerian Hormon ARS AĢırı rezidüel sitoplazma ATP Adenosine Triphosphate C1q Kollektin

cm Santimetre

CO2 Karbondioksit d/dk Devir/Dakika

DNA Deoksiribo Nükleik Asit EM Elektron Mikroskop

FSH Folikül Stümüle Edici Hormon

g g Kuvveti

HO2 Hidrojen Peraxide HOS Hipoozmotik ġiĢme

ICSI Ġntrastoplazmik Sperm Enjeksiyonu IM Hareketsizlik

IM IĢık Mikroskobu

IUI Ġntrauterin Ġnseminasyon IVF Ġn vitro fertilizasyon LPO Lipid Peroksidasyonu

MAR Karma Antiglobülin Reaksiyonu NP Yerinde Hareket ml Mililitre mm Milimetre µm Mikrometre µl Mikrolitre µg Mikrogram nl Nanolitre O2 Süperoksit Anyon

(6)

ODF Outer Dense Fiber (Yoğun DıĢ Lifler) OH Hidroksil Radikalleri

PAH Polisiklik Aromatik Hidrokarbonlar PBS Fosfat Tamponlu Tuz Solüsyonu PR Ġleri hareket

RNA Ribonükleik Asit ROC Reaktif Oksijen Türleri

SCSA Sperm Kromatin Yapısı Tayini SDI Spermatozoon Deformite Ġndeksi TAC Toplam Antioksidan Kapasite

TB Immunobead

TdT Terminal Deoksinükleotidil Transferaz TPMSS Toplam Motil Sperm Sayısı

TUNEL TdT-dUTP nick-end-labelling YÜT Yardımcı Üreme Teknikleri

(7)

ÖZET T.C.

SELÇUK ÜNĠVERSĠTESĠ SAĞLIK BĠLĠMLERĠ ENSTĠTÜSÜ

Sigara Kullanan ve Sigara Kullanmayan Ġnfertil Erkeklerde Sperm DNA Hasarı ve Apopitozis Fatma BAY

Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı YÜKSEK LĠSANS TEZĠ/ KONYA-2015

Ġnfertil çiftlerin yaklaĢık %20‟sinde sadece erkek faktörü temel nedendir. Son on yıllık süreçte sperm DNA bütünlüğünün rutin semen analizine göre daha iyi bir belirteç olabileceği hipotezi öne sürülmüĢtür. Erkek infertilitesinde sigaranın etkileri henüz kanıtlanmıĢ olmamakla birlikte, sigara infertilite için makul bir risk faktörü olarak kabul edilebilir. ÇalıĢmamızda sigara kullanan ve sigara kullanmayan infertil erkeklerde, TUNEL yöntemi ile DNA hasarı ve apopitozu değerlendirmeyi amaçladık.

Bu çalıĢma, Selçuk Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanesi Androloji Laboratuarına baĢvuran; infertilite kriterlerine uyan, sigara kullanan ve kullanmayan 25‟er, toplam 50 erkek vakaya ait semen örneği üzerinde yapıldı. Mikroskobik incelemeler ve morfolojik değerlendirmeler WHO 2010 kriterlerine uygun olarak yapıldı. Apoptozisi değerlendirmek için; TUNEL testi uygulandı ve apopitotik indeksleri hesaplandı. Elde edilen sayısal verilerin analizi Mann-Whitney U Testi ile yapıldı.

ÇalıĢmamızda: sigara kullanan grupta yaĢ infertilite süresi ile, konsantrasyon toplam motil sperm sayısı ile, toplam sperm sayısı toplam motil sperm sayısı ile, amorf baĢ büyük baĢ anomalisi ile ve teratozoospermi indeksi kuyruk anomalisi ile önemli derecede iliĢkili idi (p<0,01). Sigara kullanmayan grupta da yaĢ ve infertilite süresi ile, volüm ve total sayı, konsantrasyon ve total sayı, toplam motil sperm sayısı ve teratozoospermi indeksi, boyun-orta kısım anomalisi ve kuruk anomalisi, apopitotik indeks ve serbest baĢ anomalisi önemli derecede iliĢkili idi (p<0,01). Ancak sigara kullanan ve sigara kullanmayan gruplar arasında semen parametreleri ile apopitoz açısından istatistiksel bir fark yoktu (p>0,05).

Daha güvenilir sonuçların elde edilebilmesi için; aynı gruplarda ve genel popülâsyonda yapılacak büyük ölçekli çalıĢmalara ihtiyaç olduğu kanaatine varılmıĢtır.

(8)

SUMMARY REPUBLIC of TURKEY SELÇUK UNIVERSITY HEALTH SCIENCES INSTITUTE

DNA Injury and Apoptosis in Smoker and Non Smoker Infertile Men Fatma BAY

Department of Histology and Embryology MASTER/KONYA-2015

Male factor is the main problem as approximately 20% of infertile couples. In the last decade, a hypothesis has been suggested that sperm DNA integrity may be a better marker than the routine semen analysis. Although not yet proven harmful effect, smoking is considered as a reasonable risk factor for male infertility. In our study, in smoker and non-smoker infertile man, we aimed to investigate the sperm DNA damage and apoptosis, using TUNEL method.

This study was performed on 25 smoker‟s and 25 non-smoker‟s of total 50 semen samples of male patient who conforming tocriteriaof infertility and admitted to Selcuk University Medical Faculty Hospital Andrology Laboratory. Microscopic examination and morphological evalution were performed according to WHO 2010 criteria. To evaluate apoptosis; TUNEL assays were performed and then apoptotic indexes were calculated. Statistically analysis of the obtained numerical data was performed using the Mann-Withney U test.

In our study, in the smoker group: age and duration of infertility, total motile sperm count and concentration, total sperm count and total motile sperm count, amorphous head abnormalities and big head abnormalities, teratozoospermy index and tail abnormalities was significantly associated (p<0,01). While in the non-smoker group: age and duration of infertility,volume and total count, concentration and total count, total motile sperm count and teratozoospermy index,middle part of the neck anomalies and tail abnormalities, apoptotic index and free head abnormalities was significantly associated (p<0,01). However between smoker and non-smoker groups, there was no statistical difference in semen parameters and apoptosis.

To obtain more reliable results; it was concluded that there is a need for large-scale studies; with the same groups in the general population.

(9)

1. GĠRĠġ

Ġnfertil çiftlerin yaklaĢık %20‟sinde sadece erkek faktörü temel nedendir. Kadın ve erkek faktörü birlikteliği de dahil edilirse bu oran %30-%40‟lara ulaĢmaktadır. Günümüzde, erkek infertilitesinin değerlendirilmesinde rutin semen analizi kullanılmaktadır. Ancak, infertil erkeklerin yaklaĢık %15‟inde semen analiz sonuçları normal olduğundan bu vakalarda fertilitenin kesin tanısı rutin semen analizi ile konulamamaktadır. Dolayısıyla fertil ve infertil erkeği kesin olarak birbirinden ayıracak, gebelik sonuçlarını öngörecek yeni belirteçlere ihtiyaç artmıĢtır ve dikkatler sperm DNA bütünlüğü üzerine yoğunlaĢmıĢtır (Koyuncu 2011).Son on yıllık süreçte, erkek infertilitesinde sperm nükleer DNA bütünlüğünün rolünü araĢtıran çalıĢmalar artmıĢtır. Bu çalıĢmalarda erkek infertiltesini öngörmede sperm DNA bütünlüğünün rutin semen analizine göre daha iyi bir belirteç olabileceği hipotezi savunulmuĢtur (Koyuncu 2011). Sperm apopitozisi (programlı hücre ölümü) ve sperm DNA'sında hasar erkek infertilitesinin potansiyel ve kullanıĢlı belirleyicileri olarak kabul edilir (Ricci ve ark 2002, Chen ve ark 2006, El-Melegy ve Ali 2011).

Hücresel apopitozis embriyonik geliĢme sonrasında ve esnasındaki normal bir olaydır. Germ hücreleri üzerinde hafiften orta dereceye kadar olan genotoksik ve sitotoksik etkiler apopitozu etkilemektedir. Somatik hücrelerden farklı olarak ejakülat sperminin apopitozise uğrama kapasitesi tam olarak bilinmemektedir (Ricci ve ark 2002, Chen ve ark2006). Son çalıĢmalar, apopitozun normal spermatogenezis sırasında germ hücre ölümünün mekanizmasının altında yatan nedenlerden biri olup, insanları da kapsayan pek çok memeli türünde spermatogenezisi düzenleyen önemli mekanizmalardan biri olduğunu göstermektedir (Ricci ve ark 2002). Yani apopitozis çeĢitli patolojilerin ve spermatogenez kontrol sistemlerinin kaldırılmasının sonucu olabilir (Gandini ve ark 2000). Yapılan bir çalıĢmada; DNA hasarı ve muhtemel DNA tamirinin azalan seviyeleri karĢısında apopitozisin, hatalı genetik bilginin embriyoya geçmesini engelleyen son basamak olduğu düĢünülmüĢtür (Singh ve ark2003). Apopitozis yoğun olarak testiste spermatogoniumlarda, spermatositlerde ve spermatidlerde incelenmiĢ ve pek çok apopitotik faktör tanımlanmıĢtır (Ricci ve ark 2002). Sperm DNA hasarının infertil erkeklerde fertil erkeklere oranla daha fazla

(10)

görüldüğü ve sperm DNA hasarının bu hastalarda fertilite potansiyelini negatif etkilediği kanıtlanmıĢtır. DüĢük sayı, motilite ve anormal morfoloji gibi bozuk semen parametreleri sıklıkla yüksek sperm DNA hasarı ile birliktelik göstermektedir ancak normal semen paramaterelerine sahip hastaların %8‟inde sperm DNA hasarı olduğu da bilinmektedir. Ġlaveten, hasarlı DNA‟ya sahip spermlerin intrastoplazmik sperm enjeksiyonunda (ICSI) kullanımına bağlı potansiyel sonuçları konusunda kaygılar mevcuttur (Koyuncu 2011). Spermatozoada farkına varılan apopitotik belirteçlerin ejakulasyon sonrası baĢlatılan apopitozisin sonuçlarından mı yoksa ejakulasyon öncesi baĢlamıĢ baĢarısız bir apopitotik sürecin kalıntılarımı olup olmadığı açık değildir (Lachaud ve ark2004, Aziz ve ark2007). Testiküler fonksiyonlarla sperm sayısı ve morfolojisi iliĢkili olup DNA parçalanmaları atipik sperm formlarında daha aĢikardır (Ramos ve Wetzels 2001). Aziz ve arkadaĢlarının 2007 yılındaki yaptıkları çalıĢmada apopitotik spermatozoon sayısı, spermatozoon normal morfolojisi ve spermatozoon deformite indeksi (SDI), apopitotik olmayan popülasyona göre anlamlı olarak daha düĢük saptanmıĢtır (Aziz ve ark 2007).Erkek infertilitesinde apopitozisin anlamı üzerine kurulu bir fikir birliği yoktur. Bununla birlikte onun oluĢumunda tam mekanizmalarının araĢtırılmasına ihtiyaç vardır (Agarwal ve Said 2005, Aziz ve ark 2007).

Sigara dünyada en yaygın kullanılan potansiyel olarak tehlikeli sosyal alıĢkanlıklardan biridir. Kadınlara göre erkek nüfus arasında daha yaygındır. Sigara bilinen mutajenleri ve karsinojenleri içerir (Türk ve ark2006). Erkek üreme sistemi üzerine olumsuz etkilerinden dolayı endiĢe yaratmıĢtır. ÇeĢitli çalıĢmalarda tütün çiğneme, sigara içme ve semen kriterleri arasında iliĢki olduğu bulunmuĢtur. Ġnfertil Türk erkeklerinde yapılan bir çalıĢmada; günde yirmi adet ve daha fazla sigara içenlerde sperm kuyruk defektlerinin daha fazla olduğu gözlenmiĢ, ancak ilginç olarak günde yirminin üzerinde sigara içenlerde hafif içicilere göre ileri hareketliliğin daha fazla olduğu saptanmıĢtır (Özgür ve ark 2005). Erkek üreme sistemine lökositlerin büyük etkisi gösterilmiĢtir fakat seminal lökositlerin iĢlevi hala netlik kazanmamıĢtır. Spermatozoon apopitozisi semen kalitesiyle korelasyon göstermeyebilir. Ürogenital kanallardaki enfeksiyon yokluğunda; seminal lökositlerin asıl fonksiyonlarından biri, apopitotik spermatozoonları ortadan kaldırmak olabilir (Ricci ve ark 2002). Babanın

(11)

sigara içmesi DNA hasarlı spermatozoa oranında önemli bir artıĢ ve çocukluk çağı kanser ve doğum defektlerinde yüksek risk ile iliĢkili bulunmuĢtur. Öte yandan az sayıdaki araĢtırmalarda sperm nükleer DNA hasarı ya da sperm fonksiyonu, sperm kalitesi arasında hiçbir iliĢki bulunamamıĢtır (Saleh ve ark2002,Türk ve ark2006). Erkek infertilitesi üzerinde sigaranın etkileri sonuçsuz kalmasına rağmen, sigara makul bir infertil risk faktörü olarak kabul edilebilir ki, semen parametleri üzerinde sigaranın olumsuz etkilerinin kanıtları bunu düĢündürmektedir. Özellikle marjinal ya da anormal semen parametreleri açıkça belgelendiği zaman, tekrarlayan gebelik kayıpları ya da infertilite öyküsü olan çiftlerde hem erkek hem bayan partnerlerde sigaradan vazgeçilmesi gerekmektedir (Colagar ve ark2007).

Aktif sigara ve sperm DNA fragmantasyonu, ayrıca aksonemal hasar ve sperm sayısında azalma arasında pozitif iliĢki olduğu rapor edilmiĢtir. Sigara kullananlardaki spermde kullanmayanlara göre asitle indüklenen DNA denaturasyonuna önemli ölçüde fazla duyarlı olduğu bulunmuĢtur. Çünkü sigara kullananların sperminde DNA zincir kırılmalarının daha yüksek seviyelerde olduğu görülmüĢtür (Makker ve ark 2009).

Seminal plazmada mevcut reaktif oksijen türlerinin (ROS) yüksek düzeyleri kötü morfoloji, motilite ve düĢük sperm sayısı ile iliĢkili bulunmuĢtur (Lopes ve ark 1998). ROS‟un (reaktif oksijen türleri) sebep olduğu DNA hasarı hücrelerin apopitozisini hızlandırmaktadır. Bu da infertiliteye sebep olan spermatozoa sayısının azalması ile ilgili olarak, üreme üzerine olumsuz bir etki yapmaktadır (Türk ve ark2006).ROS eğri analiz bulguları, TUNEL (TdT-dUTP nick-end-labelling) testi ile ölçülen sperm DNA fragmantasyonunun fertil ve infertil popülasyonu ayırmada iyi bir prediktif parametre olduğunu göstermiĢtir. Fertillerle infertil hastaları ayırmada TUNEL testinin tanısal değeri oldukça yüksek görünmektedir (Sergerie ve ark 2005).

Bu çalıĢmada sigara kullanan ve sigara kullanmayan infertil erkeklerde TUNEL yöntemi ile sigaranın DNA hasarı ve apopitozis yapıcı etkileri olup olmadığını araĢtırmayı amaçladık.

(12)

Erkek üreme hücresi ilk kez Johan Hamm ve Leeuwenhook (1677) tarafından gözlenmiĢ ve mikroskobik görünümü tarif edilmiĢtir. Ancak bu araĢtırmacılar spermlerin fertilizasyondaki rolünü yanlıĢ anlamıĢlardır. Onlara göre spermler minyatür insan Ģekillerini taĢımakta ve bunlar kadın üreme yollarında büyümekteydi.

Erkek üreme hücresi baĢlangıçta bir hayvancığa benzetilmiĢ ve Karl Ernst V. Baer (1827) tarafından spermatozoon adı verilmiĢtir(Hassa 2003).

Ġnsan spermlerinin değiĢken morfolojisi değerlendirmeyi zorlaĢtırmakla birlikte, kadın reprodüktif traktindan, özellikle postkoital endoservikal mukustan ve yine zona pellusida yüzeyinden alınan (bkz.Resim 1.1) spermlerin gözlenmesi, fertilizasyon potansiyeline sahip (morfolojik olarak normal) spermlerin görünümünü tanımlamaya yardımcı olmuĢtur. Sperm morfolojisinin belli kriterlerinin kati bir Ģekilde uygulanmasıyla, normal spermlerin yüzdesiyle değiĢik fertilite sonuçları arasındaki fertilite prognozu açıĢından yararlı olabilen iliĢkiler (gebelige kadar geçen süre, in vivo ve in vitro gebelik oranları) belirlenmiĢtir. Burada tanımlanan sınıflandırmanın temel felsefesi, endoservikal mukusta mevcut fertilizasyon potansiyeline sahip spermatozoa alt popülâsyonuna göre, nelerin normal olduğunu tanımlamayla sınırlıdır.

Ġnsan zona pellusudası, morfolojik olarak benzer sperm alt popülasyonunu seçer. Ancak bu, „zonanın tercih ettiği‟ spermler çok çeĢitli morfolojik tipler göstermektedir. Zonanın tercih ettiği morfolojiye sahip babalardan gelen semendeki hareketli spermlerin yüzdesi de düĢüktür (%8–25) (Kadıoğlu ve ark2011).

(13)

Resim 1.1. Morfolojik olarak “normal” spermatozoa(a, b) In vitro ortamda zona

pellusida‟dan alınmıĢ ve Shorr boyasıyla boyanmıĢ spermler. (c) Postkoitalendoservikal mukustan alınmıĢ ve Papanicolaou boyasıyla boyanmıĢ spermler. Sperm baĢı, ortasegmenti veya gövdesinde çok az sayıda defekt gözlenmektedir. Kuyruklar kıvrımlı olabilmesinerağmen keskin açılar oluĢturmamaktadır(Kadıoğlu ve ark 2011).

Spermatozoalar oldukça özelleĢmiĢ ve yoğunlaĢmıĢ hücreler olup büyümezler ya da bölünmezler. Pek çok somatik hücre özelliği gibi spermatozonun büyük bir nükleusu vardır ancak büyük sitoplâzması eksiktir. Erkekler memeliler arasında ejekulatta bulunan spermatozoanın morfolojik heterojenite derecesi açısından tektir (Oehninger ve Kruger 2009).

Spermatozoa morfolojik olarak baĢ ve kuyruk olmak üzere iki kısımda incelenir. BaĢ bölgesi akrozomal ve postakrozomal olmak üzere iki, kuyruk ise boyun, orta kısım, esas kısım ve son kısım olmak üzere dört bölümde incelenmektedir(bkz.Resim 1.2) (Kahraman 2008).

(14)

Resim 1.2. Ġnsan spermatozoasının ıĢık ve elektron mikroskopik Ģemaları

(Sönmez S).

1.1.2. BaĢKısmı

Ġnsan spermiumunun baĢı, önden bakıldığında oval, yandan bakıldığında armut biçimindedir. 4-5 µm uzunluğunda, 2,5-3,5 µm geniĢliğindedir(Kahraman 2008).

BaĢ bölümünün büyük kısmını içerisinde paternal DNA‟nın olduğu yoğun ve kompakt yapıdaki çekirdek kaplamaktadır. Bu yapıları saran akrozom bulunmaktadır. Akrozom, baĢ ve ekvatoryal bölge olmak üzere iki kısma ayrılmaktadır. Boyama yoğunluğuna bağlı olarak akrozom, sperm baĢında nükleusun %40-70‟ini kaplayan oval yapıda görülmektedir (bkz.Resim 1.2). Spermatidin Golgi cisimciğindenoluĢan akrozomal yapı, fertilizasyon için gerekli hyaluronidaz ve proakrozin gibi hidrolitik enzimler içermektedir. Ovumun fertilizasyonu sırasında akrozomal membranın oosit plazma membranı ile birçok bölgeden birleĢmesi ile akrozom reaksiyonu oluĢmakta ve enzimatik yapıserbestleĢmektedir. Akrozomal bölgede vakuoller de bulunmaktadır(Erdemir 2011).

Hücredeki tüm kromatin, nükleus Ģekillenmesi sırasında homojen, koyu boyanan bir yapıya dönüĢür(Aksoy ve ark 2009).

(15)

Akrozomun arkasında hücre zarıyla çekirdek arasında ince yoğun bir tabaka yer alır, buna postakrozomal dens lamina denir. Kimyasal yapısı bilinmemekle birlikte iĢlevsel önemi olmalıdır, çünkü sperm baĢı oolemmayla ilk olarak bu bölgede kaynaĢır. Bu tabakanın arka kenarında çekirdek, posterior ring ile çevrelenir. Burası hücre zarıyla çekirdek kılıfının dairesel olarak kaynaĢtığı hattı oluĢturur(Hassa 2003).

1.1.3. Kuyruk Kısmı

Spermin hareketini sağlayan kuyruk kısmı 45 µm uzunluğunda ve 0,4-0,5 µm çapındadır. Spermin kuyruk kısmı orta parçadan ince ve tek parça halinde olmalıdır. Sperm kuyruğunda hareketin oluĢumunusağlayan temel yapı aksonemdir ve mikrotübüler ikililerden oluĢmaktadır(Erdemir ve ark2011).

Aksonemi çevreleyen yapıların doğasına göre sperm kuyruğu 4 parçadan oluĢur. Tabandan uca doğru bunlar; bağlantı parçası, orta parça, esas parça ve son parçadır.

Sperm bağlantı parçası (connecting piece);bir çift sentriyolün bulunduğu dar

bir parçadır. Distal sentriyol, sperm kuyruğunun merkezi parçası olan aksoneme kaynaklık yapar (Kierszenbaum 2006).

Orta kısım (Middle piece); aksonem dokuz mikrotübül çiftinin iki kat sardığı

mikrotübüler bir yapıdan orta kısım ise yoğun dıĢ fibrilleri saran mitokondri ve aksonemden oluĢmaktadır. Disülfit bağlarından zengin olan dıĢ fibriller sperm kuyruğunun sertliğini sağlarlar. Bu bölgedeki mitokondriler oksidatif metabolizma ve hücre enerjisi için gerekli olan ATP üretiminde etkili enzimleri içerir. Aksonem ise ATP‟den elde edilen kimyasal enerjinin motiliteye yani mekanik harekete dönüĢümünde gerekli enzimler ve yapısal proteinleri bulundurur. Orta kısım distale doğru incelir ve esas parçayı birleĢtiren annulus ile sonlanır (bkz.Resim 1.3) (Özdiler ve Aydos 2000).

Esas parça (Principal piece); aksonem ve fibröz kılıftan oluĢur. Annuus ile

terminal yapı arasında kalan kısımdır. Fibröz kılıf, aksonem ve yoğun dıĢ lifleri „outer dense fiber‟ (ODF) sarar (bkz. Resim 1.3 ve2.4). Periferde uzunlamasına iki kolon (santraldeki mikrotubül çifti planında yani 3 ve 9 nolu ODF‟nin zıt yönünde) ve

(16)

semisirküler yapılardan oluĢur. Fibröz kılıf yapısı disülfid bağları nedeniyle oldukça stabildir. Buna bağlı sperm motilitesine yardımcı olur. Aynı Ģekilde aksonemal kompleksin sperm plazma membranıyla bağlantısı sperm hareketlerinin etkinliğini artırır (Kadıoğlu ve ark 2004).

Resim 1.3.Spermin Kuyruk Yapısı(Lecture-Fertilization).

Resim 1.4.Orta parçada yoğun dıĢ lifler (ODF) boyuna kesitlerinde (Murayama ve

(17)

Son parça (Terminal piece); fibröz kılıfın sonlandığı bölge esas parçanın distal

ucunu belirler. Buradan sonraki kuyruk kısmı son parça adını alır. 5-7 µm uzunluğundadır ve sadece flagellum membranıyla örtülü aksonemden oluĢur. Bu nedenle silyuma benzer(Hassa 2003).

1.2.Spermatogenezis

Erkek germ hücreleri olan spermatozoalar spermatogenez adı verilen özel bir iĢlem sonucu meydana gelirler. Bu sırada spermatojenik kök hücreleri genom miktarında azalma ile morfolojik ve fonksiyonel değiĢikliklere uğrar ve diploid hücrelerden haploid hücrelere dönüĢürler. Spermatozoa sadece gövde olarak en küçük (sperm baĢ uzunluğu: 4-5 µm) ve en polarize (sperm baĢı önde, flagellum arkada) hücre olmakla kalmayıp kadın üreme sistemi gibi baĢka bir vücut dıĢı ortamda bile iĢlev görebilen tek hücredir. Bu nedenle spermatozoalar görevi basitçe, genetik bilginin erkekten diĢiye, yani oosite transferini sağlayanileri derecede özelleĢmiĢ hücrelerdir. Sperm hücrelerinin bu görevi yerine getirebilmeleri için spermatozoanın morfolojik ve fizyolojik geliĢimden geçmesi gerekmektedir. Ek olarak uygun bir kromozomal ve genetik yapılanma Ģarttır, yani kromozom ve DNA(Deoksiribo Nükleik Asit) bütünlüğü bulunmalıdır.

Spermatogenez sırasında spermatozoalar ileride normal sperm fonksiyonu için gerekli epididimal olgunlaĢma sürecine katılacak olan morfolojik ve fizyolojik geliĢimde bulunurlar. Bu nedenle spermatogenez basamaklarında gerçekleĢen iĢlemlerde bir problem olduğu takdirde bu durum kusurlu ve iĢlev görmeyen erkek germ hücreleriyle sonuçlanacaktır. Dolayısıyla üreme fizyolojisini iyi anlayabilmek için spermatogenez ile morfolojik ve genetik olayların detaylı öğrenilmesi büyük önem taĢımaktadır.

Yapısal olarak anormal ve genetikolarak kusurlu spermatozoa arasındaki iliĢki önemli bir bilinmeyen olarak karĢımıza çıkmaktadır. Germ hücre farklılaĢmasından olgun spermatozoa oluĢumuna kadar süren spermatogenezdeki uzun olaylar zinciri hem yapısal hem de genetik hasarlara açık bir yolculuk haline gelmektedir (Oehninger ve Kruger 2009).

(18)

Spermatogenez spermatogonyadan spermatozoa oluĢumu sırasındaki proliferatif ve hücresel değiĢiklikleri kapsar ve 3 fazda incelenir:

1. Spermatositogenez: Tip A spermatogonya bir dizi bölünmeye uğrayarak

sayıca çoğalır ve Tip B spermatogonyayı oluĢturur. En son oluĢan spermatogonyanın bölünmesiyle primer spermatositler meydana gelir.

2. Mayozbölünme: Spermatositler iki olgunlaĢma bölünmesine uğrayarak

kromozom sayısını yarıya indirir ve spermatid kümelerini oluĢturur.

3. Spermiyogenez: Spermatidler belirgin hücresel değiĢikliklere uğrayarak

spermatozoaya dönüĢürler(Hassa 2003).

1.2.1. Spermatositogenez

Puberte döneminden önce, testisteki seminifer tübüllerin epiteli, az sayıda cins hücresine karĢın, çok sayıda Sertoli hücresi içerir(Karaöz 2002).

Sertoli hücresinin iĢlevleri Ģu Ģekilde özetlenebilir:

1. GeliĢmekte olan üreme hücrelerini fiziksel olarak ve beslenme bakımından destek sağlamak.

2. Spermiyogenezde atılan sitoplâzmanın fagositozunu gerçekleĢtirmek.

3. KomĢu Sertoli hücreleri arasında sıkı bağlantı bölgeleri yaparak kan-testis bariyerini kurmak.

4. Androjen bağlayıcı peptid(ABP) sentezi ve salınımını gerçekleĢtirmek. ABP, Leydig hücrelerinden salgılanan testosteronu bağlar ve onu tübüllümenine taĢıyarak epididimise yönlendirir.

5. AMH (Anti Müllerian Hormon)‟nun embriyogenez sırasında sentezi ve salınımına gerçekleĢtirmek.

6. Ġnhibin sentezlemek ve salgılamak.

7. Spermlerin üreme kanallarına geçiĢini ve beslenmesini sağlayan früktozdan zengin salgı yapmak.

8. Testiküler transferrini sentezlemek ve salgılamak. Testiküler transferrin de proteindir ve üreme hücrelerine demir taĢıdığına inanılmaktadır. Kandaki demir taĢıyan

(19)

protein, serum transferrini, Sertoli hücresinin bazalindeki özel reseptörlere bağlanır ve sitoplâzmaya alınır. Burada demir serum transferriniden testiküler transferrine aktarılır, bu da demiri seminifer epitelin adluminal kompartımanındaki geliĢen üreme hücrelerine gönderir(Hassa 2003).

Spermatogeneze ait süreç, gonadotropin hormonlarının serbest bırakılması ile hipotalamus-hipofiz ekseni tarafından kontrol edilir.Sertoli hücrelerinden, hipofizden salgılanan FSH‟ye yanıt olarak androjen bağlayıcı proteinler (ABP) salgılanır (Elder ve Dale 2000).

ABP testesteron ve dihidrotestesteron androjenlerine yüksek bağlanma afinitesinde olan bir salgısal proteindir. Androjen-ABP kompleksi, henüz fonksiyonu günümüzde bilinmemektedir, epididimisin proksimal kısımlarına taĢınır.

Hem ABP hemde andorjen reseptörü androjenler için bağlanma afinitesine sahip olsalarda bunların farklı proteinler olduğunu belirtmek gerekir. ABP salgısal bir proteinken, androjen reseptörü stoplazmik ve nükleer bir proteindir.

Sertoli hücreleri inhibin ve aktivin altünitelerini (α ve β alt üniteleri) salgılarlar. Ġnhibin (αα heterodimeri) hipotalamustan ve ön hipofizden salınan gonotodropin salgılatıcı faktör ve FSH üzerine negatif feedback (geri etki) bir etki gösterir. Aktivin (αα veya ββ homodimer ) FSH salınımı üzerine pozitif feedback bir etki gösterir.

Sertoli hücreleri puberteden sonra postmitotiktir. EriĢkin testisinde mitotik hücre bölünmesi gözlenmez(Kierszenbaum 2006).

Ġnsan spermatogonium rutin histolojik preparatlar içinde çekirdeklerinin görünümüne göre üç tipe ayrılır.

Koyu tip A spermatogonia; yoğun bazofilik, ince granül kromatinli oval çekirdeği vardır. Bu spermatogonium seminifer epitelin kök hücreleri olduğu düĢünülmektedir(Ross ve Pawlina 2011). Bunlar rezerv hücrelerdir ve hücre siklusuna girmezler. Ancak mitoz yaparak koyu Tip A diğer jenerasyon hücreleri yaparlar ve sonunda açık Tip A‟yı oluĢtururlar(Hassa 2003).

(20)

Açık Tip A spermatogonia; ince granül kromatinli, soluk boyalı oval

çekirdekleri vardır(Ross ve Pawlina 2011). Ġki çekirdekçiği bulunur. Bu hücrelerin organelleri azdır ve testesteronla uyarılınca çoğalarak, mitozla yeni açık Tip A ve Tip B spermatogonyayı yapar.

Tip B spermatogonia; açıkTip A‟ya benzer. Fakat daha yuvarlak ve merkezde yerleĢen çekirdeği ve daha kaba heterokromatini ile ayırt edilir(bkz. Resim 1.5).

Spermatogenezin ilk evresinde germinal epitelin bazal membranına komĢu yerleĢimli Tip A spermatogonya denen ilkel spermatogonya 4 kez mitozla bölünerek 16 adet, daha farklılaĢmıĢ hücreler olan Tip B spermatogonyayı meydana getirir. Bu evrede spermatogonya Sertoli hücrelerine doğru ilerler. Sertoli hücreleri çok büyüktür ve membranları bazal ve yan yüzlerde birbirine sıkıca bağlanır. Böylece bir bariyer meydana gelir. Ortalama 24 günlük bir süre sonra Sertoli hücre bariyerini geçen her spermatogonyum büyür ve primer spermatositi oluĢturur. Primer spermatositler daha büyük yuvarlak hücrelerdir(bkz.Resim 1.6)(Hassa 2003).

(21)

Resim 1.6. Spermatogenez de mitoz bölünme(AkkuĢ M).

Tip A spermatogonyalar ara spermatogonya ve tip B spermatogonyumlara farklılaĢır ki, bunlarda bölünerek spermatozoa oluĢumuyla sonuçlanan farklılaĢma yolağına girerler. Bu hücresel programlama olayı geri dönüĢümsüz gibi gözükmektedir, çünkü bir kez farklılaĢmaya girdiklerinde spermatogonyalar kök hücre oluĢumuna neden olan yolağa tekrar girememektedir. Genetik olarak kusurlu spermatogonyumlar tartıĢmasız önem taĢımaktadır, çünkü kiĢinin hayatı boyunca spermatozoaların kökeni vazifesini görecek hücreler bunlardır.

Yüksek sayıda spermatogonya kök hücrelerin apopitoza uğraması „kusurlu‟ kök hücrelerin uzaklaĢtırılmasını sağlayan ileri düzenleyici mekanizmaların olduğunu düĢündürmektedir. Bu dönemde somatik hücrelerde apopitoz mekanizmalarını açıklayan çalıĢmalar konusunda ciddi bir çaba bulunmaktadır. AraĢtırma gayretleri spesifik kök hücre gruplarının hangi mekanizmalarla hücre ölümü için hedef seçildiği konusunda derinleĢtirilmelidir. Özellikle testiste, (muhtemelen özgün monitörizasyon sistemleriyle) farklılaĢan germ hücrelerinin hangi mekanizmalarla sürekli değerlendirildiğinin

(22)

anlaĢılması genetik olarak kusurlu germ hücre oluĢumunun engellenmesinde önemli rol oynayacaktır (Oehninger ve Kruger 2009).

1.2.2. Mayoz Bölünme

Tip B spermatogonyumların en son mitotik bölünmesinin ardından, ortaya çıkan yavru hücreler DNA sentezlerler (S fazı) ve 4C DNA içerikleri ile birinci mayoz bölünmeye baĢlarlar.

Birinci mayoz bölünmenin profazının alt evreleri; leptoten (ipliksi), zigoten (eĢleĢen), pakiten (kalınlaĢan), diploten (çift görünen) ve diyakinez (uzaklaĢan) evreleridir(Kierszenbaum 2006).

Leptoten evresinde homolog kromozomlar uzundur ve histolojik preparatlarda

ayırımı zordur.

Zigoten evresinde homolog kromozomlar eĢleĢir, haploid sayıda sinaptik çift

yaparlar ve bunlar rutin preparatlarda daha kolay ayırt edilir.

Pakiten evresinde kromozom çiftleri longitudinal olarak kasılır, kalınlaĢır ve

daha görünür hale gelir. Tetrat oluĢur.

Diploten evresinde eĢleĢen kromozomların ilgili bölümleri karĢılıklı değiĢir.

Buna:„krosing over‟denir.

Birinci mayozun profazı oldukça uzundur, 22-24 güne kadar uzayabilir. Bu nedenle epitelde profazın değiĢik evrelerindeki spermatositler görülebilir. Profazın sonunda çekirdek zarı kaybolur ve tetratlar metafaz ekvatoryal plağında dizilirler. Anafazda her homolog kromozom çiftinin üyesi ayrılır ve karĢı kutba hareket eder. Böylece telofazda kromozom sayısı her yavru hücrede yarıya iner.

24 günün sonunda her primer spermatosit iki sekonder spermatositi oluĢturmak üzere bölünür. Bu bölünme normal bir bölünme değildir. Buna birinci mayoz bölünme denir. Bölünmenin baĢlangıcında 46 kromozamdaki tüm DNA replike olur. Bu olayda 46 kromozomun her biri iki kromatidlidir ve sentromerlerinden birbirine bağlıdır. Bu

(23)

arada primer spermatosit 2 sekonder spermatosite bölünür. Her kromozom çifti ayrılarak 23 kromozomdan oluĢan iki grup oluĢturur. Her bir kromozom hala 2 kromatidten oluĢmaktadır ve böylece iki sekonder spermatosite gideler. Sekonder spermatositler interfazda çok kısa kalır, bu nedenle seminifer tübül kesitlerinde az rastlanırlar. Sekonder spermatositin ömrü insanda ~6 saattir. Ġkinci mayozun profazı kısadır. 2-3 gün içerisinde ikinci mayoz bölünme meydana gelir. Metafazda kromozomlar sentromerlerinden bölünerek kromatidlerine ayrılır ve 23 kromozomdan 2 set meydana gelir. Anafazda bir set kardeĢ spermatide, diğer set diğer spermatide gider. Telefazda haploid sayıda kromozama sahip 2 spermatid meydana gelir. Sonuçta her spermatid sadece 23 kromozom ve orijinal spermatogonyumdakinin yarısı kadar gen taĢır(Hassa 2003).

Mayoz bölünmeye, kromozom sayısı yarıya indiği için, redüksiyon bölünmesi ya da cins hücresinin olgunlaĢmasını sağladığı içinde, olgunlaĢma bölünmesi adı da verilmektedir(Karaöz 2002).

Mayoz bölünmenin üç önemli sonucu:

1. Sperm ve ovosit her bir homolog kromozom çiftinin sadece bir temsilcisini içerir.

2. Maternal ve paternal kromozomlar rastgele dağılırlar. 3. Kross over genetik çeĢitliliği artırır(Kierszenbaum 2006).

Mayoz bölünmenin türlerin devamı için gerekli olmasından dolayı kromozamal DNA‟nın eĢleĢmesi, kırılması ve tamiri için özelleĢmiĢ bir dizi düzenleyici mekanizma oluĢmuĢtur. Böylesi düzenleyici mekanizmaların varlığına rağmen mayotik bölünme sırasında translokasyonların ve anöploidinin sık Ģekilde gerçekleĢtiği bilinmektedir.

Bunun ötesinde büyük sayıdaki bir infertil erkek popülasyonunda germ hücre farklılaĢması mayoz sırasında durmaktadır. EĢleĢme ve kromozomal ayrılma anomalileri muhtemelen bu grup infertil hastalarda rol oynamaktadır. Ayrıca, mayoz için gerekli çok sayıdaki özgün moleküler aĢama germ hücre oluĢumunun durmasına neden olan genetik hasar ve yapısal defektlerin geliĢmesine hedef oluĢturmaktadır.

(24)

Erkek ve kadında mayoz bölünme mekanizmalarıyla ilgili hızla artan bilgimiz erkek infertilitesinin nedenlerine yönelik önemli açılımlara olanak tanıyacaktır(Oehninger ve Kruger 2009).

1.2.3. Spermiyogenez

Bu terim spermatidin spermatozoaya dönüĢtüğü mayoz sonrasındaki değiĢiklikler dizisini ifade eder. Mayozdan sonraki birkaç haftada her spermatid kendisini çevreleyen Sertoli hücresi tarafından beslenir ve yeniden Ģekillendirilir. Böylece giderek spermatozoona dönüĢür. Bu sırada sitoplâzmasının bir kısmını kaybeder, çekirdek kromatini yeniden organize olur, kompakt bir baĢ meydana gelir ve kuyruk geliĢir. Bu olayların çoğu IM (ıĢık mikroskobu) ile izlenebilir, ancak ince ayrıntıların çoğu EM (elektron mikroskop) ile tanımlanabilir. Spermiyogenezdeki olaylar Ģunlardır:

1. Çekirdek kondenzasyonu ve çekirdeğin hücrenin periferine gitmesi. 2. Modifiye bir lizozom olan akrozomun oluĢması ve çekirdek yüzeyine tutunması.

3. Flagellum oluĢumu, sentriyolden aksonem geliĢmesi. 4. Artık cisimlerin atılması(Hassa 2003).

Spermiyogenez, spermatogenezin son aĢamasıdır. Üç ana olay spermiyogenezi karakterize eder(bkz.Resim 1.7):

(25)

Resim 1.7. Spermiyogenez (AkkuĢ M).

1. Flagellumun (kamçı) geliĢmesi: Flagellum, distal sentriyolden geliĢir. Keratin içeren dıĢ yoğun lifler ve bir fibröz kılıf ile çevrili bir aksoneme (eĢmerkezli dizilimli, 9+2 mikrotübül çiftleri) sahiptir. Mitokondriyonlar kuyruğun proksimal bölümü (orta parça) çevresinde helikoidal/sarmalımsı bir kılıf oluĢturur.

2. Akrozom geliĢmesi:Döllenme için gerekli olan hidrolitik enzimlerin depolanması ve sürekli sentezinin gerçekleĢtiği akrozomal keseyi içerir. Akrozomun geliĢmesi dört ardıĢık evreden oluĢur:

a. Golgi evresi, b. Kep/Ģapka evresi, c. Akrozomal evre, d. OlgunlaĢma evresi.

3. Nükleer yoğunlaĢma: Somatik histonlar (H1,H2A,H2B ve H4) arjinin ve

lizin-zengin protaminlerle yer değiĢtirdiğinde nükleer yoğunlaĢma oluĢur.

Bu somatik histonların protaminlere dönüĢümünden sonra, nükleozomlar kaybolur ve çekirdek materyalini yoğunlaĢtırmak için düz kromatin lifler yan yana dizilirler. Spermiyogenezin olgunlaĢma aĢamasından sonra belirgin bir RNA sentezi yoktur(Kierszenbaum 2006).

(26)

Yüksek derecedeki kromatin yoğunlaĢması olgun spermi fiziksel ve kimyasal hasarlara karĢı korur. Sperm oosit içine girince disülfit bağları parçalanır ve sperm kromatini dekondanse olur ve protaminler oositin histonlarıyla yer değiĢtirir. Kromatin kondenzasyonunu tamamlamamıĢ spermatozoa çift iplikli DNA‟dan çok tek iplikli DNA içerir veya kromozom anomalilerine sahiptir(Hassa 2003). Dekondanse DNA‟ya sahip spermde baĢ tamamen boyayı alarak lacivertimsi-siyah homojen renkte görüntü verir. Ġnflamasyon, apopitoz, sigara ve serbest oksijen türleri spermde kromatinin kondanse hale geçmesini engeller. Kromatinde yeterli kondansasyon geliĢmez ise sperm DNA‟sı da kırılmaya karĢı hassaslaĢır(Aksoy ve ark 2009). Sperm kromatini kalitesi fertilizasyonda, özellikle de oositi döllemesi için bir tek spermatozoonun seçildiği intrasitoplazmik sperm enjeksiyonu (ICSI) olgularında kritik bir öneme sahiptir(Hassa 2003).

Spermiyumların Sertoli hücrelerinden seminifer tübül lümenine atılmaları olayına spermiasyon denir(Karaöz 2002).

Spermatozoonun salınması sırasında baĢ Sertoli hücresinden aktif olarak atılır ve flask Ģekilli artık sitoplâzma parçası ayrılır, spermatozoon serbestleĢir ve artık cisimcik Sertoli hücresine alınır. Spermiyasyondan sonra köprüler parçalanır ve artık cisimcikler Sertoli hücresi tarafından fagosite edilir ve lizozomal hidrolazlar ile sindirilir. Yeni salınan sperm seminifer tübülden ileri doğru Sertoli hücrelerinden salgılanan bir sıvı içerisinde ilerler. Bu ilerleme peritübüler myoid hücrelerin kasılmasıyla gerçekleĢir. 5-6 m‟lik epididimise geçtiğinde artık motil hale gelir(Hassa 2003).

Spermiyogenez sırasında meydana gelen yoğun değiĢiklikler dikkate alındığında spermiyogenez sırasında germ hücre blokajı olan durumların erkekte infertiliteye yol açması sürpriz değildir. Orta kısım, aksonem, mitokondri veya kuyruk sentezi sırasında meydana gelebilecek kusurlar genellikle zayıf motiliteye sahip anormal spermatozoa geliĢimine yol açacak, sperm çekirdeği veya baĢ kısmının yoğunlaĢması için gerekli proteinlerin sentezinde oluĢacak mutasyonlar anormal baĢlı spermlerle sonuçlanacaktır. Anormal görünümlü spermatozoaların varlığının bilinmesine karĢın morfolojik alterasyonlarla genetik aberasyonları eĢ tutmak için henüz erkendir. Daha öncesi

(27)

kritikgenlerde spermatozoon morfolosini bozmayacak minör baz-çift yer değiĢtirmeleri genetik olarak kusurlu fakat görünüĢ olarak normal spermatozooalarla sonuçlanmaktadır (Oehninger ve Kruger 2009).

1.3. Semen Analizi

Erkeğin fertilite potansiyeli ile ilgili bilimsel yaklaĢımın oluĢturulması 1677 yılında Van Leeuwenhoek‟un Londra Royal Akademi‟ye Johan Ham ile birlikte insan spermatozoasının keĢfini tanımladıkları bir mektubu yazmaları ile baĢlamıĢtır. Schirren‟e göre Van Leeuwenhoek, sterilite Ģeklinde tanımlanabilen evlilik durumlarında bu sorunun kimden kaynaklandığını tespit etmek için mikroskobik inceleme yapılmasının önemini ortaya koymuĢtur. Semen analizi ile ilgili daha bilimsel yaklaĢım 19. yüzyılın sonunda oluĢturulmuĢtur. Buna göre Lode, semen sayımını incelemeden önce hemositometre aracılığı ile dilüsyone etmiĢtir. Sonunda, araĢtırılan dört erkek olguda, ortalama sperm konsantrasyonunu 68,88x106

olarak tespit etmiĢtir. Bundan sonra 1941 yılında Hotchkiss, sperm motilitesinin değerlendirilmesinde daha sonraları 1945 yılında Macleod ve Heim tarafından da modifiye edilen bir derecelendirme sistemi bildirmiĢtir. Modifiye edilen bu sistemde sperm hareket ve progresif aktiviteleri ayrı ayrı kaydedilerek ileriye doğru olan hareket; 0- 4 arasındaki skala ile belirtilmiĢtir. Sonraki dönemlerde Belding, günümüzdede kullandığımız semen incelemelerine katkıda bulunmuĢtur. Buna göre: spermdeki baĢ, orta kısım ve kuyruk anomalilerinin tek tek ya da kombine olarak belirtilebileceğini ifade etmiĢtir. Bu çalıĢmayı 1934 yılında, Williams‟ın spermin baĢ kısmındaki vakuollerin varlığı ile akrozomu tanımlamaları izlemiĢtir. Semen analizinde en iyi standardizasyonu sağlamak için, Dünya Sağlık Örgütü (WHO) kitapçığının ilk olarak 1980 yılında yayınlanmasından sonrabunu sırası ile; 1987, 1992, 1999ve2010(Kadıoğlu ve ark2011)yıllarındaki farklı basımları takip etmiĢtir(Oehninger ve Kruger 2009).

Ġnfertil çiftte yapılacak araĢtırmalara semen analizi ile baĢlanması genellikle kabul gören bir uygulamadır. Erkek infertilitesinde sperm yapı bozuklukları ve aksesuar cinsel bez salgı bozuklukları %35-40 oranında rol oynamaktadır. Diğer etkenler ise, genital traktüste obstrüksiyon ve sperm iĢlevlerinde bozukluklardır(Hassa 2003).

(28)

Laboratuarda semen kalitesinin ölçüm sonuçlarıaĢağıdaki faktörlere bağlıolacaktır: • Numunenin tümüyle toplanması: Ejakülasyon sırasında atılan ilk semen fraksiyonları esasen spermden zengin prostat sıvısıyken, daha sonraki fraksiyonlar daha çok seminal kese sıvısını içerir. Bu nedenle, ejakülatın ilk (spermden zengin) fraksiyonunun kaybı son fraksiyonunun kaybına göre semen analizi sonuçlarını daha fazla etkilemektedir.

• Ejakülasyon sırasında konsantre epididim spermatozoasını seyrelten sıvılar salgılayan aksesuar cinsel bezlerin aktivitesi. Ejakülattaki toplam sperm sayısının aksine (sperm konsantrasyonuyla semen hacminin çarpımı) diğer üreme organlarının iĢlevlerinden etkilendiği için, sperm konsantrasyonu, testiküler sperm üretiminin doğrudan ölçütü değildir. Örneğin, en azından bazı toplumlarda yaĢla birlikte seminal sıvı ve toplam sperm üretimi birlikte azaldığından, genç ve yaĢlı erkeklerin semenlerindeki sperm konsantrasyonları benzer olabilmesine rağmen, toplam sperm sayıları farklılık gösterebilir.

• Soncinsel aktiviteden itibaren geçen zaman. Spermatozoa epididimlerde toplanır, daha sonra üretra içine taĢar ve idrarla yıkanıp atılır. Epididim iĢlevleri bozulmadığı sürece, spermlerin vitalitesi ve kromatini cinsel perhizin uzamasından olumsuz etkilenmemektedir.

• Sondan bir önceki cinsel perhiz süresi: Epididimler tek bir ejakülasyonla tamamen boĢalmadığından bir önceki ejakülasyondan bir miktar spermatozoa kalır. Bu durum, ejakülattaki spermatozoanın yaĢ dağılımını ve kalitesini etkilemektedir. Bu etkilenmenin boyutunu saptamak zor olduğu için nadiren hesaba katılmaktadır.

• Ejakülat baĢına düĢen spermatozoa sayısını etkileyen testis büyüklüğü. Testislerin büyüklüğü, sperm morfolojisini de etkileyen spermatogenetik aktivitenin düzeyini yansıtır (Kadıoğlu ve ark 2011).

Semen analizi aĢağıdaki aĢamalarıiçerir: Ġlk 5 dakika içinde:

(29)

• Numune kabının likefaksiyon için laboratuar sehpası üstünde veya bir inkübatör de (37°C) bekletmek.

Otuz ila 60 dakika arasında:

• Likefaksiyon ve semen görünümünün değerlendirilmesi, • Semen hacminin ölçümü,

• Semen pH‟sının ölçümü (gerekiyorsa),

• Mikroskobik görünüm, sperm motilitesi ve sperm sayısını belirlemek için gerekli seyreltme derecesini değerlendirmek üzere bir ıslak preparatın hazırlanması,

• Spermlerin vitalitesini değerlendirmek (hareketli hücrelerin yüzdesi düĢükse), • Sperm morfolojisini değerlendirmek için semenden yayma preparatı hazırlamak,

• Sperm konsantrasyonunu değerlendirmek üzere semeni seyreltmek, • Sperm sayısını değerlendirmek,

• MAR [(mixed antiglobulin reaction (karma antiglobülin reaksiyonu)] testi uygulamak (gerekiyorsa),

• Peroksidaz pozitif hücreleri değerlendirmek (yuvarlak hücreler mevcutsa), • Immunobead [IB] testi için spermatozoa hazırlamak (gerektiğinde), • Semenin santrifüjü (biyokimyasal belirteçler analiz edilecekse). Üç saat içinde:

• Numunelerin mikrobiyoloji laboratuarına gönderilmesi (gerekiyorsa), Dört saat sonra:

• Yayma preparatlarının fiksasyonu, boyanması ve sperm morfolojisi açısından değerlendirilmesi.Aynı gün ileri saatlerde (numuneler dondurulmuĢsa izleyen günlerde),

• Aksesuar bez belirteçlerinin analizi (gerekiyorsa),

• Indirekt immunobead (IB) testini uygulamak (gerekiyorsa) (Kadıoğlu ve ark 2011),

(30)

Numune toplama

• Semenin ortam sıcaklığındakideğiĢikliklere maruziyetini kısıtlamak, numunenin alınmasıyla analizi arasındakizamanı kontrol etmek amacıyla numunenin laboratuarınyakınındaki özel bir odada verilmesi gerekir.

• Numune en az iki en çok yedi günlük cinsel perhizden sonra alınmalıdır. Ġlâve numunegerekirse, her defasında cinsel perhiz süresi mümkün olduğu kadar sabit tutulmalıdır.

• KiĢiye semen numunesinin alınmasıyla ilgili anlaĢılır yazılı ve sözlü bilgilendirmeyapılmalıdır. Semen numunesinin tamamının toplanması ve numunenin herhangi bir kısmının ziyan olması halinde durumun ilgiliye bildirilmesi gerektiği vurgulanmalıdır.

• Rapor formuna aĢağıdaki bilgiler kaydedilmelidir;

 KiĢinin adı, doğum tarihi, kiĢisel kod numarası, cinsel perhiz süresi, numunenin alındığı gün vesaat, numunenin eksiksiz olup olmadığı, numunenin elde edilmesindeki herhangi birzorluk, numunenin alınmasıyla semen analizine baĢlanmasıarasında geçen süre.

Tanısal veya araĢtırma amacıyla semenin toplanması;

• Numune mastürbasyonla elde edilmeli, ejakülat spermatozoa için toksik olmadığıdoğrulanmıĢ cam veya plastikten temiz ve geniĢ ağızlı bir kap içine alınmalıdır

• Ejakülasyondan sonra spermatozoayı olumsuz etkileyebilen geniĢ çaplı ısı değiĢikliklerinden kaçınmak için, numune kabı 20°C ilâ 37°C arasındaki ortam, sıcaklığında tutulmalı, kabın üzerine erkeğin adı, kod numarası, numunenin alındığıtarih ve saatin yazılı olduğu bir etiket yapıĢtırılmalıdır.

• Semen likefiye olurken numune kabılaboratuarsehpası üzerinde veya birinkübatörde (37°C) bırakılır.

• Semen numunesi tam değilse, özellikle ilk, yani spermden zengin fraksiyonu eksikse, bu durumu raporda bildirin. Numune eksikse, 2–7 gün arasında bir cinsel perhiz döneminden sonra ikinci bir numune alınmalıdır (Kadıoğlu ve ark 2011).

(31)

Ġlk makroskobik değerlendirme

Semen analizi, likefaksiyondan hemen sonra basit inspeksiyonla (gözle muayene)baĢlamalıdır. Dehidratasyon veya ısı değiĢikliğinin semen kalitesini olumsuzetkilemesinden kaçınmak için, ejakülasyondan sonra tercihen 30 dakika, en fazla bir saatiçinde analiz yapılmalıdır.

Likefaksiyon

Toplama kabına ejakülasyonunun hemen ardından semen, tipik olarak yarı katı koagüle kitle Ģeklindedir. Oda sıcaklığında birkaç dakika içinde genellikle likefiyeolmaya (incelmeye) baĢlar. Bu sırada sıvı içinde heterojen topaklardan oluĢan karıĢımgörülecektir. Likefaksiyon devam ederken semen daha homojen ve hemen hemen sugibi bir hale gelir(Kadıoğlu ve ark2011).Bu durum prostattan salgılanan fibrolitik enzimler ile meydana gelmektedir. Bunun yanında fibrinogenez ve aminopeptidaz olarak bilinen iki proteolitik enzim ile olmaktadır. Likefaksiyon bu nedenle normal prostatik fonksiyonu göstermektedir(Hassa 2003, Oehninger ve Kruger 2009).

Son evrelerde yalnızca küçük koagülasyon alanları kalır. Numunenintümü oda sıcaklığında genellikle 15 dakika içinde likefiye olur, bu durum nadiren60 dakika veya daha uzun zaman alabilir. AltmıĢ dakika içinde tam bir likefaksiyonoluĢmazsa, bu durum kaydedilmelidir. Evde toplanan veya kondom içine alınan semennumuneleri normal olarak laboratuara ulaĢtıklarında likefiye olmuĢ olacaklardır. Normal Ģekilde likefiye olmuĢ semen numunelerinin içinde klinik bir değer taĢımayan, pelteye benzer, sıvılaĢmamıĢ, jel benzeri granüller (jelatinöz cisimler) bulunabilir. Ancak, mukus iplikçiklerinin varlığı semen analizini etkileyebilir(Kadıoğlu ve ark2011).

Semen viskozitesi

YaklaĢık olarak 1893 yılında Cary ve Hotckiss semenin içeriğini sudan daha vizkoz olarak tanımlamıĢlardır. Vizkoziteyi saptamak için en uygun yol modifiye pipet metodunun kullanılmasıdır(Oehninger ve Kruger 2009).

(32)

Likefaksiyondan sonra semen, nazikçe, geniĢ kalibreli (yaklaĢık 1,5 mm çapında) tek kullanımlık plastik pipet içinden aspire edilerek, yerçekimiyle damlamaya bırakıldığında oluĢan iplikçiği gözleyerek, numunenin viskozitesi tahmin edilebilir. Normal semen pipetten belirgin küçük damlalar Ģeklinde düĢer. Viskozite anormal ise damla 2 cm‟den uzun iplikçik oluĢturur.

Alternatif olarak viskozite, numunenin içine bir cam çubuk sokup çekerek oluĢturulan iplikçiğin uzunluğu gözlenerek de değerlendirilebilir. Ġplikçik 2 cm‟den uzunsa viskozitenin anormal olduğu kaydedilir.

Kısmen likefiye olmamıĢ numunenin aksine, viskoz semen numunesi homojen yapıĢkanlık sergiler ve kıvamı zamanla değiĢmez. Yüksek viskozite, numunenin elastik özellikleriyle tanınabilir. Pipetle alınmayaçalıĢıldığında kitlesi kendine sıkıcayapıĢıktır(Kadıoğlu ve ark2011).

ArtmıĢ vizkozite, seminal, vezikül ve prostat gibi genital yapıların infeksiyonuna sekonder olarak anormal prostat fonksiyonunun ortaya çıkmasıyla oluĢabilir. Bu durum ayrıca, uygun olmayan saklama kaplarının kullanımı ya da hastanın sık ejakülasyon yapması gibi fizyolojik bir nedene bağlı olarak oluĢmaktadır(Oehninger ve Kruger 2009).

Yüksek viskozite sperm hareketliliğinin ve konsantrasyonunun belirlenmesini, antikor kaplı spermin saptanmasını ve biyokimyasal belirteçlerin ölçümünü olumsuz etkileyebilir(Kadıoğlu ve ark2011).

Ejakülatın görünümü

Normal likefiye olmuĢ semen numunesi homojen, gri-opelesan bir görünüme sahiptir. Sperm konsantrasyonu çok düĢükse, daha az opak bir görünüm alabilir; rengi de farklılaĢabilir: örn: eritrositler mevcutsa (hemospermi) kırmızı-kahverengi veya hasta ikterikse veya bazı vitaminler veya ilaçlar alıyorsa sarı olabilir(Kadıoğlu ve ark2011).

(33)

Semen volümü

Semen volümünün ölçülmesinde günümüzde hala kullanılmakta olan yöntem semen örneği 15 ml büyüklüğündeki konik tüpe koymak ve 0,1 ml seviyesine kadar olan yerlerde okumaktır. Volüm hesaplaması semen kabının boĢ ağırlığını ve ardından semeni koyup ağırlığını tespit ettikten sonra ikisinin farkının hesaplanması Ģeklinde de yapılabilir (Oehninger ve Kruger 2009).

Ejakülat hacmine baĢlıca katkı seminal keseler ve prostattan, daha az miktarda ise bulbouretral bezler ve epididimlerden gelir. Hacmin doğru saptanması, semenin her türlü değerlendirmesi için kritiktir, çünkü ejakülat içindeki spermatozoanın ve sperm dıĢı hücrelerin toplam sayısının hesaplanmasına olanak tanır.

Semen hacminin alt referans sınırı 1,5 ml‟dir(bkz. Çizelge1.1)(Kadıoğlu ve ark2011).

Semen volümü 1 ml‟den daha azsa semen örneğinin uygun olarak alınıp alınmadığının kontrol edilmesi önemlidir. Bu nokta semen örneğinin ilk kısmının en yüksek oranda sperm içermesi ve en yüksek motiliteye sahip olması dolayısı ile oldukça önemlidir(Oehninger ve Kruger 2009).DüĢük semen hacmi; ejakülatör kanalda tıkanmanın veya seminal keselerin de yeterince geliĢmediği bir durum olan doğumsal bilateral vaz deferens yokluğunun karakteristik bir belirtisidir. Yüksek semen hacmi, aksesuar organların aktif inflamasyonlarındaki aktif eksüdasyonu yansıtabilir.

Semen PH’si

Semen pH‟sı, baĢlıcası alkalen seminal kese salgısıyla, asidik prostat salgısı olan farklı aksesuar bez salgılarının pH değerleri arasındaki dengeyi temsil eder. pH, likefaksiyondan sonra sabit bir zaman, tercihen 30 dakika geçtikten sonra ölçülmelidir. Ancak her durumda, üretiminden itibaren oluĢan CO2kaybından etkilendiği için, pH

ölçümü ejakülasyondan sonraki bir saat içinde mutlaka yapılmıĢ olmalıdır(Kadıoğlu ve ark2011).

(34)

Normal semen pH=7,2 ve üstüdür. pH 7‟nin altın ise ve azoospermi varsa vas deferens, seminal veziküller ya da epididimde disgenezis söz konusu olabilir. Akut enfeksiyon halinde ya da pH ölçümünün geç yapılması halinde ise pH 8‟in üzerinde çıkabilir (Hassa 2003).

Çizelge 1.1.Semen analizi için en düĢük referans değerler.

Parametre Alt Referans Sınırı

Semen Volüm (ml) 1,5 (1,4-1,7)

Toplam Sperm Sayısı (106ejekülat baĢına) 39 (33-46) Sperm Konsantrasyonu (106 ml baĢına) 15 (12-16)

Toplam Motilite (PR+NP, %) 40 (38-42)

Hızlı Motilite (PR, %) 32 (31-34)

Vitalite (Canlı Spermatozoa, %) 58 (55-63)

Sperm Morfolojisi (Normal ġekiller, %) 4 (3,0-4,0)

Ġlk mikroskobik inceleme

Taze semenin boyanmamıĢpreparatlarının incelenmesi için, bir faz kontrast mikroskobun kullanılması önerilir. Numunenin ilk mikroskobikincelenmesinde preparat, toplam X100 büyütme altındataranır (ör: X10 büyütmeliobjektif ve X10 büyütmeli okülerin kombinasyonu).Bu gözden geçirmede aĢağıdakiler ortaya konabilir:

• Mukus iplikçik oluĢumu;

• Sperm agregasyonu veya aglütinasyonu;

• Spermatozoa dıĢında hücrelerin varlığı, ör: epitel hücreleri “yuvarlak hücreler”(lökositler ve immatür germ hücreleri) ve izole sperm baĢları veya kuyrukları.

(35)

• Sperm hareketliliğideğerlendirilir.

• Sperm sayısınındoğrudeğerlendirmesi için gerekli seyreltme oranı belirlenebilir(Kadıoğlu ve ark2011).

Örnek iyi karıĢtırılmamıĢsa aynı örnekten yapılan iki ayrı inceleme arasındamotilite, canlılık, konsantrasyon ve morfolojik olarak belirginfarklılıklar gözlenebilir. GeniĢağızlı plastik bir pipete 10 kezaspire edilmesi ile örnek karıĢtırılabilir. Spermlere hasar verebileceğinden dolayı yüksek hızlıkarıĢtırıcılar kullanılmamalıdır. Semenin hacmi ve lamel boyutlarının da standartolması gerekir. Böylece analizler her zaman derinliğinyaklaĢık 20 µm‟de sabit olduğu preparatlarla yapılmıĢolur. Derinliğin 20 µm‟nin altında olması spermlerin rotasyonelhareketini zorlayabilir. On µl‟lik hacimde semen lam üzerinekonur. Üzeri lamelle kapatılır. Lam ile lamel arasında hava kabarcığıoluĢturulmamalıdır (Gökçe2011).

Spermagregasyonu

Hareketsiz spermlerin birbirleri ile ortamdaki mukus iplikleri gibi debris materyali ile veya sperm dıĢı hücreler ile yapıĢması sonucu gözlenebilir(bkz. Resim 1.8)(Gökçe2011).

Resim 1.8.Semende spermatozoanın nonspesifik kümeleĢmesi (agregasyon)(Kadıoğlu

(36)

Sperm aglütinasyonu

Hareketli spermlerin birbirine baĢ-baĢ, kuyruk-kuyruk veya karıĢık olarak yapıĢarak bir arada bulunmasıdır. Grade1 (Ġzole): Aglütinasyon baĢına ayrılmıĢ sperm <10 spermatozoa, spermlerin çoğu serbesttir. Grade2(Orta): Aglutinasyon baĢına 10-50 sperm görülür. Grade3(GeniĢ): Aglutinasyon baĢına >50 spermatozoa, bazı spermatozoalar serbest. Grade4(Bütün): Bütün spermatozoalar aglutine olmuĢtur ve bağlantılar arası aglütinasyon görülür(bkz. Çizelge1.2)(Özçınar2014).

Hücrelere veya debrise yapıĢık hareketli spermatozoa veya birbirine yapıĢık(agregasyon) hareketsiz spermatozoa aglütinasyon olarak değerlendirilmemelidir(Kadıoğlu ve ark2011).

Sperm dıĢı hücreler

Ejakülat genitoüriner sistemden epitel hücreleri, lökositler ve immatür germ hücreleri gibi baĢka hücreler de içerebilir. Son ikisine yuvarlak hücreler de denir ve normal durumda tüm ejakülatta 1x106/ml‟den fazla yuvarlak hücre bulunması halinde

peroksidaz testi, lökosit belirteçleri çalıĢılmalı ve konsantrasyonları doğru bir Ģekilde hesaplanmalıdır (Gökçe 2011).

(37)

Çizelge 1.2. Farklı sperm aglütinasyon derecelerinin Ģematik diyagramı(Kadıoğlu ve ark2011). Aglütinasyonun Derecesi Ġlgili Kısımlar 1. Ġzole (< 10 sperm/ aglütinat, birçok serbest sperm) 2. Orta(10– 50 sperm/ aglütinat, serbest sperm) 3. GeniĢ(> 50 sperm/aglütin at, bazı spermler hâlâ serbest) 4. Yoğun (spermlerin hepsiaglütine olmuĢve aglütinatlar birbirleriyle bağlantılı) A. BaĢ- baĢa B. Kuyruk - kuyruğa (baĢların serbest ve aglütinatlardan uzakolduğu görülmektedir) C. Kuyruk ucu - kuyruk ucuna D. KarıĢık (bas - basa ve kuyruk - kuyruğa. Aglütinasyonlar açıkça seçilmiyor) E. YumaklaĢmıĢ (baĢlarkuyruklar birbirlerinekarıĢmıĢ. Kuyruk Kuyruğaaglütinasy on nedeniyle baĢlar açıkçaseçilmiyor)

(38)

Sperm motilitesi

Spermin ileri hareketlilik derecesi gebelik oranlarıyla iliĢkilidir.

Semen içindeki sperm motilitesi, numunenin likefaksiyonundan sonra en kısa zamanda; tercihen 30 dakikada, ancak mutlaka bir saat içinde değerlendirilmelidir. Bu Ģekilde, dehidratasyon, pH ve ısı değiĢikliklerinin motilite üzerine zararlı etkilerini sınırlandırmak mümkün olur.

Ġleri veya yerinde hareketli olan spermatozoayı hareketsiz olanlardan ayırt eden basit bir hareketlilik derecelendirme sistemi önerilir. Her spermatozoanın hareketliliği aĢağıdaki gibi derecelendirilir:

• Ġleri hareket (Progresif Motilite; PR): hızdan bağımsız olarak doğrusal veya geniĢ bir daire içinde aktif olarak hareket eden spermatozoa.

• Yerinde hareket (Nonprogresif Motilite; NP): ileriye doğru hareketin olmadığı tüm diğer hareketlilik kalıpları, örn: küçük daireler halinde yüzme, baĢı yerinden güçlükle oynatan kamçısal hareket veya yalnızca kuyruğun kamçısal hareketi gözlenebilir.

• Hareketsizlik (Immotilite; IM): hareketin olmaması.

Toplam hareketlilik için alt referans siniri (PR+NP): %40 (5. yüzdelikte, %95 CI 38–42). Ġleri hareket (PR) için alt referans siniri : %32 (5. yüzdelik, %95 CI 31–34).

Ejakülattaki ileri hareketli spermatozoa sayısı biyolojik öneme sahiptir. Ġleri hareketli spermatozoa sayısı; ejakülattaki toplam sperm sayısının, ileri hareketli hücrelerin yüzdesiyle çarpılması sonucu elde edilir(Kadıoğlu ve ark2011).

Spermatozoanın hareketi özellikle orta kısım ve kuyruğun anatomik ve iĢlevsel olarak sağlam olması ile ilgilidir. Orta kısımda yer alan mitokondilerce üretilen ATP hareketin enerjisini verir.

(39)

Sperm toplama kabının içine su, sabun karıĢması, masturbasyon için jel kullanılması, süre geçmesi, ısı farklılıkları hareketi azaltır ya da yok eder. Sperm motilitesini inhibe eden diğer faktörler Ģunlardır: ejakülat viskozitesinin yüksek olması; ilaçlar (ör. Sulfasalazin); alkol; sigara ve skrotal ısının artıĢı.

Ejakülasyondan 2 saat sonra spermatozoanın %50‟sinin hareketlerini devam ettirmeleri beklenir. Bu değer %30‟un altına düĢmemelidir. Motilite tayini özellikle düĢük ısılardan etkilendiğinden, semen likefaksiyonu süresince örneğin 37°C‟ye ayarlı inkibatörde bekletilmesi, mikroskobik incelemeninde tercihen ısı ayarlı objektifi bulunan mikroskopta yapılması uygundur. Spermatozoa immotilitesi denilince gerçek ölü spermlerden ayırt edilmesi gerekir. Zira hareketsiz her spermin ölü olması gerekmez.

Gerçek sperm immotilitesi nedenleri arasında Ģunlar sayılabilir:

 Ġnfeksiyonlar,

 Sperm kuyruğunun aksonemata ve dynein kollarındaki defektler,

 Antisperm antikorlar,

 Seminal lökositler ve “hostile seminal plasma” tarafından aĢırı süperoksit yapımı,

 Ġmmotil silia sendromu (Kartagener sendromu)

 Kısa kuyruk ya da kuyruk yokluğu defektleri(Hassa 2003).

Sperm canlılığı

Sperm hücre membranı bütünlüğünün değerlendirilmesi esasına dayanır ve progresif hareketli sperm oranı ˂ %40 olduğu durumlarda sperm canlılık testleri özellikle önem kazanır. Eozin-nigrosin veyaeosin-Y testinde membran bütünlüğü hasarlanmıĢ spermler boyayı alırlar ve boyanmıĢ olarak gözlenirler, hipoozmotik ĢiĢme (HOS) testinde ise membran bütünlüğü olan spermler hipoozmolar sıvıyı hücre içine alarak ĢiĢerler ve kuyrukları kıvrık izlenir. Sperm canlılığı için en az 200 sperm hücresi sayılmalıdır (Özçınar2014).

(40)

Isı değiĢikliği ve dehidratasyonun sperm canlılığı üzerineolumsuz etkilerini azaltmak amacıyla likefaksiyondan sonraki30 dakikada ya da ejakülasyondan sonraki ilk bir saatiçinde canlılık değerlendirilmelidir.

Hareketsiz spermlerin canlı olup olmadıkları klinik açıdan önemlidir. Canlılık değerlendirmesinin sonuçları aynısemen örneğinin hareketlilik sonuçlarıyla birlikte değerlendirilmelidir. Canlı ama hareketsiz hücrelerin büyük orandabulunması kuyruktaki yapısal defektlerin göstergesi olabilir. Hem hareketsiz hem de ölü hücrelerin (nekrozoospermi)yüksek oranda bulunması ise epididimal bir patolojiningöstergesi olabilir(Gökçe2011).

Vitalitenin referans alt siniri (membranı sağlam spermler) %58‟dir (5. yüzdelikte). Ejakülatta membranı sağlam spermatozoa sayısı biyolojik öneme sahiptir. Bu sayı ejakülattaki toplam sperm sayısı ile membranı sağlam hücrelerinin yüzdesi çarpılarak elde edilir(Kadıoğlu ve ark2011).

Sperm sayımı

Bir ejakülattaki toplam sperm sayısı ve sperm konsantrasyonu, gebeliğe kadar geçen süre ve gebelik oranlarıyla iliĢkili olup, gebe kalmanın belirleyici faktörleridir. Toplam sperm sayılarıyla reprodüktif sonuçlar arasındaki korelasyona iliĢkin daha fazla veri gereklidir. Ejakülat içindeki spermatozoa sayısı, semenin değerlendirilmesi sırasında ölçülen spermatozoa konsantrasyonundan hesaplanır. Normal ejakülatlar için; erkek reprodüktif trakti tıkanık değilse ve cinsel perhiz süresi kısaysa, ejakülat içindeki toplam spermatozoa sayısı testis hacmiyle korelasyon gösterir; bu durum testislerin spermatozoa üretme yetisinin ve erkek reprodüktif trakt açıklığının da bir göstergesidir. Semendeki spermatozoa konsantrasyonu dölleme (fertilizasyon) ve gebelik oranlarıyla iliĢkili olmasına rağmen, seminal veziküller ve prostattan salınan sıvıların hacminden etkilenir ve testis fonksiyonunun spesifik bir ölçüsü değildir.

“Toplam sperm sayısıyla” “sperm konsantrasyonu” terimleri eĢanlamlı değildir. Sperm konsantrasyonu, birim semen hacmindeki spermatozoa sayısına iĢaret etmekte olup, spermatozoa sayısı ve onları seyrelten sıvı hacminin bir fonksiyonudur. Toplam

(41)

sperm sayısı ise, tüm ejakülat içindeki toplam spermatozoa sayısını ifade ettiği gibi, sperm konsantrasyonunun semen hacmiyle çarpımı sonucu elde edilir.

Toplam sperm sayısının testislerde sperm üretimini yansıttığı Ģeklindeki bir genelleme; spinal kord yaralanması olanlardan elektroejakülasyonla alınan, androjen yetersizliği olanlardan elde edilen, uzun süreli cinsel perhiz sonrasında veya retrograd ejakülasyonla alınan numuneler için doğru olmayabilir.

Sperm konsantrasyonu(birim hacimdeki sperm sayısı) denilmek istendiğinde, “sperm yoğunluğu (dansitesi)” (birim hacimdeki kitle) terimi kullanılmamalıdır(Kadıoğlu ve ark2011).

Sperm sayımı için 100 µm derinlikte hemositometre sayma kameraları tavsiye edilmektedir. Spermlerindoğru bir Ģekilde sayılıp hesaplanabilmesi içinsemenin dilüe edilmesi gerekir. Ne kadar dilüe edileceğitaze preparatta 200 veya 400 büyütmede görüntü alanıbaĢına sayılan sperm hücresi sayısına göre belirlenebilir. Örnekte mikroskopla hiç sperm görülmediyseyeni bir taze preparat hazırlanır. Yine sperm görülmezseazoospermiden Ģüphelenilebilir. Örnek 3000 g‟de 15 dakikasantrifüj edilir ve sperm hücresi tespit edilirse kriptozoospermi, görülmezse azoospermi denir(bkz.Çizelge1.3).

GeliĢtirilmiĢ Neubauer hemositometresi 3x3 mm‟lik iki ayrı sayım kamarası içerir. Sayım kamarası ile arasında 0.1mm‟lik mesafe sağlayan özel kalınlıkta (0,44 mm) bir lamel kullanılır. Her bir kamara 1X1 mm‟lik 9 kare içerir. 100µm derinlikte bu karelerin her biri 100 nl‟yi ifade eder. Bu karelerden 1, 3, 7 ve 9 numaralı olanlar 16 adet (6,25 nl), 2,4, 6 ve 8 numaralı olanlar 20 adet (5 nl) ve 5 numaralı kare ise 25 (4 nl) adet küçük kareden oluĢmaktadır.

GeliĢtirilmiĢ Neubauer hemositometresi ile sayım yaparken kabul edilebilir düĢüklükte bir sayım hatasına ulaĢabilmek için her birinde 200 sperm olan iki sayım yapılmalıdır. Sayım sonuçları arasındaki fark kabul edilebilir sınırlar üzerinde ise bu yanlıĢ sayım, dilüsyon hatası veya spermlerin eĢit dağılmamıĢ olduğunun bir göstergesi olabilir. Yeniden dilüsyon hazırlanıp yeni sayım yapılmalıdır.

(42)

Çizelge 1.3. Semen kalitesine iliĢkin terminoloji.

Aspermi Semen yok (retrograd ejakülasyon var veya yok)

Astenozoospermi Ġleri hareketli spermlerin (PR) yüzdesi alt referanslimitinaltında Astenoteratozoospermi Hem ileri hareketli spermlerin (PR) hem de morfolojik olarak

normal spermlerin yüzdesi alt referans limitlerinden düĢük Azoospermi Ejakülatta hiç sperm yok (uygulanan değerlendirme yönteminin

kantitatif analiz limitine göre)

Kriptozoospermi Taze preparatlarda sperm olmamasına rağmen santrifüjlenmis pellette gözlenir

Hemospermi (hematospermi) Ejakülatta eritrositlerin varlığı Lökospermi (lökosito-spermi,

piyospermi) Ejakülatta eĢik değer üstünde lökosit varlığı

Nekrozoospermi Ejakülatta düĢük yüzdede canlı ve yüksek yüzdede cansız spermler

Normozoospermi

Alt referans limitlerine eĢit veya yüksek toplam sperm sayısı (veyaraporlanan sonuca göre, konsantrasyonu),ileriye doğru hareketli (PR) ve morfolojik olarak normal spermatozoa yüzdeleri

Oligoastenozoospermi

Alt referans limitlerinden düĢük toplam sperm sayısı (veya raporlanan sonuca göre, konsantrasyonu)ve ileri hareketli spermazoa yüzdesi

Oligoastenoteratozoospermi

Alt referans limitlerinden düĢük toplam sperm sayısı (veya raporlanan sonuca göre, konsantrasyonu), hem ileri hareketli (PR) hem de morfolojik olarak normal spermlerin yüzdeleri

Oligoteratozoospermi

Alt referans limitlerinden düĢük toplam sperm sayısı (veya raporlanan sonuca göre, konsantrasyonu) ve morfolojik olarak normal spermlerin yüzdesi

Oligozoospermi Alt referans limitinden düĢük toplam sperm sayısı (veya raporlanan sonuca göre, konsantrasyonu)

Teratozoospermi Alt referans limitinden düĢük yüzdede morfolojik olarak normal spermler

Şekil

Çizelge  1.2.  Farklı  sperm  aglütinasyon  derecelerinin  Ģematik  diyagramı(Kadıoğlu  ve  ark2011)
Çizelge 1.3. Semen kalitesine iliĢkin terminoloji.
Çizelge  3.7.  Sigara  kullanan  ve  kullanmayan  gruplara  ait  infertilite  süresi  ile  iliĢkili  parametrelerin istatistiksel farkları (** p &lt; 0,01),(* p &lt; 0,05 )
Çizelge  3.8.  Sigara  kullanan  ve  kullanmayan  gruplara  ait  semen  volümü  ile  iliĢkili  parametrelerin istatistiksel farkları (** p &lt; 0,01),(* p &lt; 0,05 )
+7

Referanslar

Benzer Belgeler

The widely used ADF and Philips – Perron (PP) unit root tests, which are used for testing the stationarity hypothesis, and the Engle – Granger and Johansen

Nitekim, birçok çalışma infertil erkeklerde, fertil erkekle- re kıyasla daha fazla DNA hasarı gözlendiğini ve yüksek sperm DNA hasarının sıklıkla düşük sperm

Yıkama sonrası sperm sayılarında alkol ve sigara kullanıcılarında dramatik bir azalış belirlenirken sadece sigara kullanıcısı olan bireylerin semen

Çalışmamızda olduğu gibi intraserebral kanamalı hastalarda S100B ile GKS arasında anlamlı negatif korelasyon, kanama volümü ile anlamlı pozitif

İlerleme oranı 0,2 mm/devir, talaş derinliği 1,25 mm sabit tutularak 3 farklı kesme hızlarında kesici takım aşınması bakımından en fazla aşınmanın olduğu sonuçlar

f) İkileme ve bağlaçlı tamlama: Hatipoğlu, ikilemeler ile bağlaçlı yapıdaki tamlamaların anlamsal olarak asla aynı ifadeyi veremeyeceğini belirtir. Aç susuz kal-

Neo-klasik iktisada dayanan beşeri sermaye yaklaşımlarıyla birlikte, beşeri sermayenin ekonomide ve ekonomik büyümede fiziki sermaye kadar önemli bir üretim faktörü olduğu