Spermatozoon DNA’sındaki Hasar ve Önem

ÇeĢitli iç ve dıĢ nedenlerden dolayı DNA‟dafarklı düzeyde hasarlar meydana gelmektedir. Spermatozoon DNA‟sı hasarına insan ve fare, at, domuz, balıkgibi pek çok hayvan türünde rastlanmaktadır. DNA‟da oluĢan bu hasarların baĢlıcaları; kromatinyapısının bozulması, DNA bazlarınınoksidasyonu, yanlıĢ eĢleĢmesi ve tubulin polimerizasyonunbaskılanması, bazların kimyasal olarak değiĢmesi,kromatin yapısındaki anomaliler, DNAzincirinin kırılması, DNA-DNA ve DNA- proteinçaprazlaĢmaları, DNA da mutasyonlar gibi bir takım yapısal bozulmalardır(Türk ve ark 2006).

Aynı zamanda bir hipoteze göre spermiyogenezin kritik aĢamasındaki defektif kromatin paketlemesinin bir sonucu olarak defektif insan spermatozoasında DNA hasarı olarak görülür. Kromotin yapısındaki defektler ya da topoisomeraz sisteminin kendi aktivitesi yüksek düzeylerde DNA fragmantasyonu gösteren gametlerin oluĢmasına neden olabilir.

Gerçekten bu hipotezi destekleyen diğer bir gözlemde, kromatinpaketleme hataları çoğunlukla germ çizgisindeki DNA hasarı ile iliĢkilidir. Diğer bir hipoteze göre, defektif sperm fonksiyonu ve erkekteki DNA hasarı her ikisi birlikte yüksek düzeyde oksidatif strese bağlı olarak oluĢmaktadır. Reaktif Oksijen Türlerinin (ROS) yoğun bir biçimde üretimi ya da maruz kalınması istatistiksel olarak bağımsız çalıĢmalarda sperm fonksiyonlarında defekt ya da DNA hasarı yaptığı gösterilmiĢtir(Oehninger ve Kruger 2009).

Spermdeki DNA hasarı doğal konsepsiyon sonrası ve intrauterin inseminasyon (IUI), invitrofertilizasyon (IVF) ve intrasitoplazmik sperm enjeksiyonu (ICSI) adı verilen farklı yardımcı üreme tekniklerinin (YÜT) kullanımını takiben fertilizasyonun ve gebeliğin belirleyicisidir. Bunun kullanılan yardımcı üreme teknikleri için önemli bir anlamı vardır çünkü ne kadar invaziv bir teknik kullanılırsa oosite transfer edilen ve oositi invitro fertilize eden erkek genomunun genetik hasarlanma ihtimali de o kadar fazla olacaktır.

Semen kalitesi düĢük olan hastalarda DNA kırık oranı anlamlı olarak yüksektir ve DNA hasarı ICSI için enjekte edilecek spermatozoa seçiminde belirlenemez, ICSI‟de defektif spermatozoa kullanım ihtimali yüksek olur, bu da hasarlı DNA‟nın oosite transferi riskini artırır(Ramos ve Wetzels 2001, Oehninger ve Kruger 2009).

Yine sigara içen babalarınspermatozoonlarındaki DNA hasarına bağlı olarakçocuklarında doğumsal anomaliler, kusurlar veçocukluk çağında kansere yakalanma oranıartmaktadır (Oehninger ve Kruger 2009).

Sperm DNA fragmantasyonunun derecesi gametin genetikmateryalinin bütünlüğünü yansıtır. Sperm DNA bütünlüğünü değerlendirmek için en sıklıkla

kullanılan teknikler TUNEL, Comet ve sperm kromatin yapısı (SCSA)testleridir(Sergerie ve ark2005).

1.5.3. Apopitozis

Hücre ölümü, morfolojik görünümüne (apopitotik, nekrotik, otofajik ya da mitozla bağlantılı), enzimolojik kriterlere (nükleaz ya da kaspazlar, kalpainler, katepsinler ve transglutaminazlar gibi farklı proteaz sınıflarının olup olmaması), iĢlevsel kriterlere (programlanmıĢ ya da tesadüfî, fizyolojik ya da patolojik) ya da immünolojik karakterlere (immünolojik ya da immünolojik olmaması gibi) göre sınıflandırılmaktadır(Bilir ve Ergüven 2012).Apopitozis klasik hücre ölüm Ģekli olarak bilinen nekrozisden birçok özelliği açısından oldukça farklı olan bir hücre ölüm mekanizmasıdır (Ulukaya 2001). Apopitotik hücrelerde, plazma membranları sağlam, nekrotik hücrelerde ise, plazma membranları bütünlüklerini kaybederler ve sızdırırlar (bkz. Resim 1.10)(Chen ve ark 2006).Biyolojik bilimler literatüründeapopitozis terimi, ilk defa ĠskoçyalıaraĢtırmacılar olan Kerr, Wyllie ve Currie tarafından 1972yılında kullanılmıĢ ve canlı dokulardaki hücre azalmalarından sorumlu olan, yapısal olaraközgün bir hücre ölüm tipi olarak tanımlanmıĢtır (Ulukaya 2001).

Resim 1.10. Ultrastrüktürel apoptotik sperm(*): Nekrotik sperm ():(Apoptotik

cisimcikler – nükleer fragmantasyon) Apoptotik sperm(Δ): Spermde Nükleer vakuol (Doğan ve ark 2010).

Sperm DNA hasarı ve sperm apopitozis erkek fertilitesinin potansiyel olarak kullanıĢlı endeksleri olarak kabul edilmiĢtir (Chen ve ark 2006, El-Melegy ve Ali 2011). Memeli testislerinde, klonal geniĢleme fazladır ve bu nedenle Sertoli hücrelerinin kapasitesini destekleyerek germ hücrelerinin sayısının uygun olması için apopitoz gibi bir mekanizma gerekmektedir (El-Melegy ve Ali 2011).

Apopitozis aynı zamanda programlanmıĢ hücre ölümü, fizyolojik hücre ölümü veya hücreintiharı olarak da bilinir (Ulukaya 2001). Normal spermatogenez sırasındahücre geliĢimi ve farklılaĢmasına ilave olarak germ hücre ölümü de görülür ve bu spermatozoonoluĢumundakritik rol oynar. Sonuçta spermatozoon potansiyelsayısı tahminen %75‟i kadar azalır. Testiküler germ hücre apopitozisi fizyolojik ve devamlı olarak hayat boyu meydana gelir. Apopitozisin normal spermatogenez sürecinde iki önemli rolü vardır. Bunlardan ilki,Sertoli hücreleritarafından desteklenebilecek sayıda germ hücre popülâsyonunusınırlandırmak, ikinciside anormal spermatozoonun azaltılmasında seçici olmaktır(Doğan ve ark 2010).

Apopitozis, hücre ölümünde öncü bir dizi biyokimyasal ve morfolojik değiĢikliklerin neden olduğu genetik mekanizmalar üzerine hücresel tabanlı ölümün bir modudur (El-Melegy ve Ali 2011). Hücreküçülmeye ve kondanse olmaya baĢlar, hücre iskeletidağılır ve çekirdek zarı yer yer erir. Çekirdek DNA‟sıparçalara ayrılır. Apopitoza uğrayan bir hücrede laminin ve aktinfilamentlerinin kesilmesi sonucu sitoplâzma çekilmeye veküçülmeye baĢlar. Kromatin ve çekirdekte bulunan yapısalproteinlerin parçalanması sonucu çekirdektekondensasyon baĢlar ve çoğu zaman çekirdek kromatinin çekirdek membranının iç yüzüne yerleĢmesi nedeniyle atnalı biçiminde görülür. Hücre büzülmeye ve küçülmeyedevam eder ve makrofajların tanıyabileceği ve normalhücrelerden daha kolay ayırtedilebileceği membranlaçevrili küçük parçalara ayrılır. Ġçlerindesitoplâzma vesıkıcapaketlenmiĢ organeller ve bazılarında çekirdekparçaları da mevcut olan apopitotik cisimler meydana gelir. Çekirdek de hücre gibi büzüĢür ve bazenmembranla sarılı olarak birkaç parçaya ayrılabilir. Nükleerporlar kromatinin membrana komĢuolmadığı bölgelerdeyoğunlaĢırlar.

Apopitotik hücre ölümünde en uygun biyokimyasal özellik endojen endonükleosun aktive olmasıdır. Kromatin yoğunlaĢması ve DNA'nın bozulması sonrasında çift iplikte sayısız kırılmalara neden olur. Bu kırılma eksojen DNA polimeraz ya da terminal deoksinükleotidil transferaz (TdT) kullanılarak tespit edilebilir. TdT bağlı reaksiyon apopitotik hücreler için spesifiktir ve apopitotik hücrelerin DNA zincir kırıklarını ayırt etmek için bize olanak sağlar(Gandini ve ark 2000).

Apopitozsırasındaapopitotik hücrelerin membranlarında değiĢimler olur. En belirgin değiĢim normalde hücre membranının sitoplazmik yüzeyinde yeralan negatif yüklü fosfotidilserin birimlerinin hücre membranın dıĢ yüzeyine çıkmasıdır. Bunun sonucunda kollektin (C1q) adı verilen çeĢitli proteinler apopitotikhücre zarınabağlanmaktadır. Ayrıca normalde hücre zarındagizlenmiĢ olan N-asetil glikozamin ve N-diasetilsitabrozmolekülleri apopitozda açığaçıkarlar vemakrofajlar tarafındantanınırlar. Apopitotik hücrelerde görülen morfolojik membran değiĢimlerindenbiri de hücre içeriklerini içine alan ve membranla çevriliveziküller biçiminde apopitotik hücrelerden kopan tomurcuklardır. Bu küçük veziküller apopitotik cisimolarak da adlandırılırlar. Bu değiĢimlerapopitotik sürecinsonlarınadoğru görülür (bkz.Resim 1.11)(GüleĢ ve Eren 2008).

Bazı yazarlar normal ve dengesiz spermatogenez ile erkeklerin sperminde apopitotik belirteçlerin varlığını (fosfatidilserin dıĢsallaĢtırılması, DNA parçalanması ve Fas) nitelendirdiler. Ancak, bu ejakülat sperminde hala aktif apopitotik sinyal akıĢı yeteneğini korumak veya ejakülat sperminde tespit edilen apopitotik belirteçlerin ejakülasyondan önce baĢlamıĢ baĢarısız bir apopitotik sürecin kalıntıları olup olmadığı açık değildir (Lachaud ve ark 2004).

Apopitozisi saptamak için çok çeĢitli yöntemler geliĢtirilmiĢtir. 1972 yılında apopitozis terimi ilk kez kullanıldığında hücrenin morfolojik görünümüne göre karar verilmiĢti. Oysa günümüzde morfolojik değerlendirmenin yanı sıra apopitozise özgü olduğu bilinen bazı aktivasyonların (örneğin, aktif kaspaz–3tayini) moleküler düzeyde belirlenmesiyle de saptanabilmektedir.

Resim 1.11.Apopitozisin genel görünümü (Ulukaya 2001)

Ġlk kez morfolojik kriterlere görebelirlenen apopitozis, 80‟li yılların sonuna doğru DNAkırıklarının oluĢtuğunun ortaya çıkarılmasıyla birlikte,bu kırıkların saptanmasına yönelik yöntemlerlebelirlenmeye baĢlanmıĢtır. 90‟lı yılların ortalarında iseapopitotik hücrelerde kaspazların aktifleĢtiği bulunmuĢtur. Böylece kaspaz aktivasyonlarınınbelirlenmesine yönelik metotlarla saptanabilenapopitozis 90‟ların sonuna doğru fosfotidilserintranslokasyonunu belirleyen yöntemlerle desaptanmaya baĢlanmıĢtır. 2000‟li yılların baĢlarındaapopitotik epitelyal hücrelerde olmak üzere kaspazaktivitesiyle kırılan bir protein olan keratin 18‟inkırıldıktan sonraki özgün formunu saptayanantikorların kullanılarak daha spesifik olaraksaptanması takip etmiĢtir. Apopitozisin belirlenmesinde kullanılan yöntemler;

 Immunohistokimyasal yöntemler

 Biyokimyasal yöntemler

 Ġmmünolojik yöntemler

 Moleküler biyoloji yöntemleri (AkĢit ve Bildik 2008)