Bu çalıĢma, Selçuk Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanesi Androloji Laboratuarı‟na Kasım 2012-Temmuz 2013 ayları arasında baĢvuran; en az 10 adet/gün olmak üzere 25 sigara kullanan ve 25 sigara kullanmayan, infertilite kriterlerine uyan, baĢka bir kronik rahatsızlığı (diyabet, hipertansiyon, romatizmal hastalık vb.) veya ürolojik operasyon, enfeksiyon ve inmemiĢ testis tıbbi hikayesi olmayan toplam 50 erkeğe ait semen örneği üzerinde yapıldı. Selçuk Üniversitesi Tıp Fakültesi GiriĢimsel Olmayan Uygulamalar Etik Kurulu‟nun29/02/2012 tarih 2012/47 nolu izni (bkz. EK-A) ile çalıĢmaya baĢlanıldı. ÇalıĢmaya katılan her hasta için bilgilendirilmiĢ onam formu ile izinleri alındı (bkz. EK-B).
Ġnfertilite kriterlerine uyan ancak, mikroskopik incelendikten sonra azospermik olarak değerlendirilen semen örnekleri araĢtırma dıĢı bırakıldı.
Semen örnekleri en az üç günlük cinsel perhiz sonrasında, steril kaplara mastürbasyon yöntemiyle alınmıĢtır. Ġlk makroskobik incelemeiçin semen örnekleri 20- 40 dakika arasında 370C‟de etüvde likefiye olmaları beklenildi. Vizkozitesi, görünümü, hacmi ve pH‟sı değerlendirilen semen, mikroskobik değerlendirme için X100 büyütme ile ıĢık mikroskobunda incelendi ve Dünya Sağlık Örgütü (DSÖ-WHO 2010) kriterlerine uygun olarak analizleri yapıldı (WHO 2010).
Morfolojik değerlendirme için hazırlanan preparatlar kuruduktan sonra spermacTM boyaları ile boyandı ve WHO 2010 kriterlerine göre değerlendirmeler yapıldı.
Ayrıca apopitozisi hücresel düzeyde değerlendirmek için; apopitotik süreçte nükleik asitlerin terminal uçlarının iĢaretlenmesi ile DNA kırıklarını gösteren, yaygın olarak kullanılan ve geçerliliği kabul gören bir test olan TUNEL testi (Terminal
deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labelling) yapıldı.
TUNEL uygulaması için taze semen örneğinden,15 ml‟lik santrifüj tüpüne 1 mlalındı ve etüvde 370C‟de kalma süreleri bir saate tamamlandı. Daha sonra semen
örneklerinin üzerine 10 ml‟e kadar oda ısısında fosfat tamponlu tuz solüsyonu (PBS) eklendi. Tüpler ters düz edilerek iyice homojenize edildikten sonra 1300 d/dk‟de 8 dakika santrifüj edildi. Santrifüjden çıkan tüpten süpernatant 1 ml kalacak Ģekilde atıldı ve pellet sertçe kaldırılarak iyice homojenize edildi. Daha sonra tekrar 10 ml olacak Ģekilde PBS eklendi ve santrifüj iĢlemi tekrarlandı. Santrifüjden çıkan tüpten tekrar süpernatant 1 ml kalacak Ģekilde atıldı vepellet sertçe kaldırılarak iyice homojenize edildi. Her hasta için 3‟er lam yayma preparat hazırlandı ve kurumaya bırakıldı. Preparatlar fiksasyondan önce sperm varlığı açısından mikroskopta kontrol edildi.
Hazırlanan fiksasyon çözeltisinde fikse edilen lamlar buz üzerinde permeabilite solüsyonunda bekletildikten sonra kurumaya bırakıldı (bkz. Çizelge2.1).
Çizelge2.1.Ġmmün iĢaretlemede kullanılan çözeltiler
Adı Gerekli Kimyasallar Hazırlanma ġekli
Fiksasyon 50 ml PBS
2 gr Paraformaldehit
75 0C de 350 devirde 120 dk manyetik karıĢtırıcıda taze olarak hazırlanır.
Permabilite
100 µl (%0,1) Triton X 0,1 gr (%0,1) Sodyum Sitrat Distile Su
100 µl (%0,1) Triton X+ 0,1 gr (%0,1) Sodyum Sitrat+Distile Su içerisine alınır manyetik karıĢtırıcıda hazırlanır.
Çizelge2.2.Kullanılan malzeme ve kimyasallara ait bilgiler.
Adı Kod Firma
PBS P4417-100TAB Sigma
DAPI‟li kapama solüsyonu Ab1044139 Abcam
Triton X 100 SC-29112 Santa Cruz Biotecnology
%0,1 Sodyum Sitrat C0909 Sigma
Paraformaldehit Lot 010M1507 Sigma
Poly-L lysine kaplı lam 631-0108 SuperFrost Plus
TUNEL testi uygulama protokolünde aĢağıdaki iĢlem basamakları prosedürü takip edildi.
1. Enzim ve iĢaretli nükleotidlerin DNA kırıklarına ulaĢmasını kolaylaĢtırmak için lamlar oda sıcaklığında Proteinaz K (IHC Select Proteinase K Millipore Lot 2328325 cat no 21627 USA) ile 20 dk. inkübe edildi.
2. Sperm yayma preparatları 2x5 dk PBS ile yıkandı.
3. Preparatlar, daha sonra TUNEL+Reaksiyon karıĢımından (iĢaretleme solüsyonu + terminal deoksi nukleotidil transferaz (TdT) enzim solüsyonu) (Insitu Cell Death Detection Kit, POD REF: 11684817910, LOT: 14590300, Roche Diagnostics Indianapolis, USA) 50 mikrolitre her kesit üzerini kaplayacak Ģekilde damlatıldı. Tabanı gazlı bezlerle nemlendirilmiĢ ağzı kapaklı kutulara konuldu.
4. 370C ayarlanmıĢ etüvde 1 saat inkübe edildi.
5. Preparatlar 2x5 dk PBS ile yıkandı.
6. Preparatlar, DAPI‟lı kapama solüsyonu (fluorescent mountin medium with DAPI) ( Abcam, Ab1044139) damlatılarak lamel ile kapatıldı. Negatif kontrol amaçlı olarak bazı preparatlara sadece iĢaretleme solüsyonu damlatıldı aynı Ģekilde etüvde inkübe edildi.
Tüm preparatlar Olympus BX51 flüoresan ataĢmanlı trinoküler mikroskopta incelenerek, DP72 dijital kamera ile dijital görüntüler elde edildi. Bu görüntüler Olympus DP2BSW görüntü yazılımı programında değerlendirildi. Elde edilen görüntülerde 100 sperme karĢılık gelen apopitotik sperm sayıları değerlendirildi.
APOPĠTOTĠK ĠNDEKS = Toplam ApopitotikSperm Sayısı / 100
Elde edilen sayısal veriler “Mann-Whitney U Testi” ve “Pearson Korelasyon” katsayısı aracılığıylaile değerlendirilmiĢtir.
3. BULGULAR
ÇalıĢmamızda semen örneklerinden elde edilen veriler, sigara kullanan grup:Çizelge 3.1‟de, sigara kullanmayan grup ise;Çizelge 3.2‟de gösterilmiĢtir. Sigara kullanan vakalara ait istatistiksel veriler Çizelge 3.3‟de, sigara kullanmayan vakalara ait istatistiksel veriler Çizelge 3.4‟de, her iki grubun istatistiksel karĢılaĢtırılmasıda:Çizelge 3.5‟de özetlenmiĢtir. ÇalıĢılan parametrelere ait bulgular aĢağıdaki gibidir:
YaĢ
Ġnfertilite Ģikâyeti ile baĢvuran hastaların yaĢ ortalamaları, sigara kullanan grupta: 30,52 (±5,6) iken; sigara kullanmayan grupta: 31,40 (±5,5)idi. Grupların kendi içindeki istatistiklerinde, yaĢ ile ilgili bulgular Çizelge 3.6‟dagösterilmiĢtir. Sigara kullanan ve kullanmayan gruplar arasında istatistiksel bir fark yoktu.
Çizelge 3.6. Sigara kullanan ve kullanmayan gruplara ait yaĢ ile iliĢkili parametrelerin
istatistiksel farkları (** p < 0,01),(* p < 0,05 ).
SĠGARA KULLANAN SĠGARA KULLANMAYAN
ĠNFERTĠLĠTE SÜRESĠ ĠNFERTĠLĠTE SÜRESĠ AMORF BAġ
YAġ 0,575** 0,442* 0,403*
Ġnfertilite süresi
Ġnfertilite süreleri, sigara kullanan grupta kullanmayan gruba göre daha yüksekti (3,48±4,5; 2,32±2,06). Grupların kendi içindeki istatistiklerinde, infertilite süresi ile ilgili bulgular Çizelge 3.7‟de gösterilmiĢtir. Her iki grup arasında istatistiksel bir fark yoktu (p>0,05).
Çizelge 3.7. Sigara kullanan ve kullanmayan gruplara ait infertilite süresi ile iliĢkili
parametrelerin istatistiksel farkları (** p < 0,01),(* p < 0,05 ).
SĠGARA KULLANAN SĠGARA KULLANMAYAN
YAġ YAġ
Semen volümü
Sigara kullanan grupta semen völümleri daha düĢük (3,02±1,1; 3,42± 1,4) idi. Grupların kendi içindeki istatistiklerinde, semen volümü ile ilgili bulgular Çizelge 3.8‟de gösterilmiĢtir. Sigara kullanan ve sigara kullanmayan gruplarda istatistiksel olarak anlamalı bir fark yoktu.
Çizelge 3.8. Sigara kullanan ve kullanmayan gruplara ait semen volümü ile iliĢkili
parametrelerin istatistiksel farkları (** p < 0,01),(* p < 0,05 ).