KIRIM KONGO HEMORAJİK ATEŞ VİRÜSÜ (KKHA) S SEGMENTİNİN KISMİ KLONLANMASI
T.C.
GAZİOSMANPAŞA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
BİYOLOJİ ANABİLİM DALI
YÜKSEK LİSANS TEZİ
KIRIM KONGO HEMORAJİK ATEŞ VİRÜSÜ (KKHA)
S SEGMENTİNİN KISMİ KLONLANMASI
Aşiyan KARABULUT
TOKAT 2010
Doç. Dr. Şaban TEKİN danışmanlığında, Aşiyan KARABULUT tarafından hazırlanan bu çalışma 15/01/2010 tarihinde aşağıdaki jüri tarafından oy birliği ile Biyoloji Anabilim Dalı’nda Yüksek Lisans tezi olarak kabul edilmiştir.
Başkan: Prof. Dr. İsa GÖKÇE İmza: Üye : Doç. Dr. Şaban TEKİN İmza: Üye : Yrd. Doç. Dr. Ahmet BURSALI İmza:
Yukarıdaki sonucu onaylarım
Prof. Dr. Metin YILDIRIM Enstitü Müdürü
TEZ BEYANI
Tez yazım kurallarına uygun olarak hazırlanan bu tezin yazılmasında bilimsel ahlak kurallarına uyulduğunu, başkalarının eserlerinden yararlanılması durumunda bilimsel normlara uygun olarak atıfta bulunulduğunu, tezin içerdiği yenilik ve sonuçların bir yerden alınmadığını, kullanılan verilerde herhangi bir tahrifat yapılmadığını, tezin herhangi bir kısmının bu üniversite veya başka bir üniversitedeki başka bir tez çalışması olarak sunulmadığını beyan ederim.
ÖZET Yüksek Lisans Tezi
KIRIM KONGO HEMORAJİK ATEŞ VİRÜSÜ (KKKAV) S SEGMENTİNİN
KISMİ KLONLANMASI
Aşiyan Karabulut
Gaziosmanpaşa Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı
Danışman: Doç. Dr. Şaban Tekin
Kırım Kongo Kanamalı Ateşi (KKKA), Bunyaviridae ailesinden Nairovirus cinsi içinde tanımlanan KKKA virüsünün (KKKAV) etken olduğu ciddi bir hastalıktır. KKKAV S, M, ve L segmentleri olmak üzere üç parçalı tek zincirli negatif anlamlı tripartit bir RNA genomuna sahiptir. Bu çalışmada rekombinant peptit üretiminde ve moleküler testlerde pozitif kontrol olarak kullanmak üzere KKKAV nin S segmentinin tam veya kısmi olarak klonlanması hedeflenmiştir. Yapılan klonlama çalışmaları sonunda KKKAV S fragmentinin 536 bazlık bir kısmı pTZ57R plazmitine yerleştirilerek E. coli’de klonlanmıştır. Sonuç olarak peptit üretiminde ve moleküler testlerde pozitif kontrol olarak kullanılabilecek viral S fragmentin bir kısmını taşıyan bir plazmit üretilmiştir.
2010, 27 Sayfa
ABSTRACT Master Thesis
PARTIAL CLONING OF S SEGMENT OF CRIMEAN CONGO
HAEMORRHAGIC VIRUS (CCHFV)
Aşiyan KARABULUT Gaziosmanpaşa University
Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Biology
Supervisor: Doç. Dr. Şaban Tekin
Crimean-Congo Hemorrhagic Fever (CCHF) is a fatal disease caused by CCHF virus (CCHFV) in Nairovirus genus from Bunyaviridae family. The genome of CCHF virus is composed of S, M, ve L segments which are single stranded negatif sense RNA. The goal of this study was to clone S segment of CCHFV for peptid production and production of a posive control plasmid for molecular assays. In the present study, a 536 bp fragment of S segment of CCHFV was clonned into pTZ57R plasmid to produce recombinant partial S peptide and a recombinant plasmid to be used as a positive control in molecular tests.
2010, 27 Sayfa
Key Words: CCHF, S Segment, Plasmid, Cloning
TEŞEKKÜR
Çalışmalarımda bilgi ve deneyimleriyle beni yönlendiren değerli hocam Doç. Dr. Şaban TEKİN’e, çalışmalarım boyunca bilgilerinden ve laboratuar imkânlarından yararlandığım değerli hocalarım Prof. Dr. İsa GÖKÇE’ye ve Yrd. Doç. Dr. İskender PARMAKSIZ’a, manevi desteklerinden ötürü Araş. Gör. Tünay KARAN’a ve maddi ve manevi her türlü destekleri için aileme teşekkür ederim.
İÇİNDEKİLER Sayfa ÖZET………. i ABSTRACT……….. ii TEŞEKKÜR……….. iii SİMGE ve KISALTMALAR DİZİNİ……….. vi ŞEKİLLER DİZİNİ……….. viii 1. GİRİŞ ve LİTERATÜR ÖZETİ………. 1
1.1. Kırım Kongo Kanamalı Ateşi Hastalığı……… 1
1.2. KKKA Virüsünün Moleküler Biyolojisi……….. 4
1.3. Viral RNA’nın Yapısı………5
1.3.1. S Segmenti………. 4
1.3.2. L Segmenti………. 4
1.3.3. M Segmenti……… 5
1.4. Bunyaviridae Ailesindeki Virüslerin Replikasyonu………. 5
1.4.1. Replikasyonda Glikoproteinlerin Önemi………7
2. MATERYAL ve YÖNTEM……….. 8
2.1. Materyal……… 8
2.1.1. Kullanılan Kimyasal Madde ve Malzemeler………. 8
2.1.2. Kullanılan Cihazlar……… 8
2.1.3. Tampon ve Solüsyonların Hazırlanması……… 9
2.1.3.1. 0,5 M EDTA Solüsyonu………. 9
2.1.3.2. 50X Tris Asetat EDTA (TAE) Tamponu……… 9
2.1.3.3. 10X TE Tamponu………9
2.1.3.4. 1X TE Tamponu………. 9
2.1.3.5. Ethidium Bromür……… 9
2.1.3.6. Primerlerin Hazırlanması……… 10
2.1.4. Luria Bertani Besiyerinin Hazırlanması……… 10
2.1.4.2. Katı LB Besiyerinin Hazırlanması……….. 11
2.2. Yöntem………..12
2.2.1. Kene Dokularının Ayrılması………. 12
2.2.2. Viral RNA Ekstraksiyonu………. 12
2.2.3. cDNA Sentezi……… 13
2.2.4. Reverse Transkriptaz Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RT-PCR)…… 15
2.2.5. Agaroz Jel Elektroforezi……….15
2.2.5.1. Agaroz Jelin Hazırlanması……….. 15
2.2.5.2. Örneklerin Yürütülmesi……….. 16
2.2.6. Klonlama……… 16
2.2.6.1. Ligasyon………. 16
2.2.6.2. Transformasyon………...17
2.2.7. Rekombinant Kolonilerin Analizi……….. 19
2.2.7.1. Plazmit İzolasyonu……….. 19
2.2.7.1.1. Solüsyonların Hazırlanması………..19
2.2.7.1.2. Plazmit İzolasyon Basamakları……….20
2.2.7.2. Klasik Polimeraz Zincir Reaksiyonu………...20
2.2.7.3. Plazmitin Restriksüyon Endonükleaz Enzimi ile Kesilmesi………21
3. BULGULAR ve TARTIŞMA……….23
4. SONUÇ……….24
KAYNAKLAR……….25
SİMGE ve KISALTMALAR DİZİNİ Simgeler Açıklama °C Santigrat Derece g Gram F Forward GN, GC Glikoproteinler L Large L Litre M Medium M Molar R Reverse S Small S Saniye Kısaltmalar Açıklama Ark. Arkadaşları bp Baz Çifti
BSA Sığır Serum Albumini
cDNA Komplementer DNA
dk Dakika
DNA Deoksiribonükleik asit
DMSO Dimetilsülfoksit
dNTP Deoksiribonükleotit Trifosfat
DTT Ditiotrietol
EDTA Etilendiamintetraasetik Asit HCl Hidrojen Klorür KKKA Kırım Kongo Kanamalı Ateşi
mg Miligram
ml Mililitre
mM Milimolar NaCl Sodyum Klorür
NP Nükleokapsit Proteini
Pmol Pikamol
PCR Polimeraz Zincir Reaksiyonu
RNA Ribonükleik Asit
RNaz Ribonükleaz
rpm Rotation Per Minute
RT-PCR Reverse Transkripsiyon Polimeraz Zincir Reaksiyonu
TAE Tris-Asetat EDTA
TE Tris-EDTA
TNF Tümör Nekrozis Faktör
ul Mikrolitre
ŞEKİLLER DİZİNİ
Şekil Sayfa
Şekil 1.1 KKKA Hastalığının Dünyada Yayılışı…………...2
Şekil 1.2 KKKA Hastasına Ait Kanamalı Bir Kol……….. 3
Şekil 1.3 Bunyaviridae Virionunun Sistemik Yapısı……….. 4
Şekil 1.4 Bunyaviridae Ailesindeki Virüslerin Replikasyonu……… 6
Şekil 2.1 cDNA Sentez Basamakları………... 14
Şekil 2.2 pTZ57R/T Vektörü……….. 17
Şekil 2.3 PCR Ürününün Klonlanması……… 18
Şekil 2.4 Rekombinant Koloniler……… 19
Şekil 2.5 TZ57R/T Plazmitinin Çoklu Klonlama Bölgesinin Haritası……… 21
Şekil 2.6 KKKA Virüsünün Genomunu Kesen Enzimler……….. 22
Şekil 3.1 536 bp’lik KKKAV S Segmentinin RT-PCR İle Çoğaltılması………….23
1. GİRİŞ VE LİTERATÜR ÖZETİ
Kırım Kongo Kanamalı Ateşi (KKKA), kene kaynaklı bir hastalıktır (Ergonul, 2006). KKKA hastalığı, insanlarda şiddetli kanamalar ve yüksek ateş gibi semptomlarla seyreden bir hastalıktır (Nichol, 2001). KKKA hastalığına neden olan Kırım Kongo Kanamalı Ateşi Virüsü (KKKAV), kanamalı virüsler arasında yer alır.
Kanamalı virüsler, vücutta ateş, kanama gibi şiddetli semptomlarla seyreden ileriki aşamalarda ölümle sonuçlanabilen zoonoz karakterli hastalığa neden olan virüslere denir. Kanamalı virüsler 4 aileye ayrılır. Bunlar; Flaviviridae, Bunyaviridae, Arenaviridae ve Filoviridae’dir (Le Guenno, 1995). Bunyaviridae ailesi birbirinden farklı 5 cins içermektedir. Bunlar; Bunyavirüs, Hantavirüs, Nairovirüs, Phlebovirüs ve Tospovirüs’lerdir (Eliot ve ark., 2000).
Nairovirüs’ler; KKKA virüsü, Dera Ghazi Khan virüsü, Hughes virüs grubu, Nairobi Sheep Disease (NSD) virüs grubu, Qalyup virüs grubu, Sakhalin virüs grubu ve Thaifora virüs grubu (Clerx ve ark., 1981) olmak üzere 7 farklı serogruba ayrılmaktadır. Bunlar da 34 çeşit virüsü kapsamaktadır (Van Regenmorte ve ark., 2000). Bu Nairovirüs’lerden, KKKA virüsü hayvanlarda enfeksiyon oluşturmasına rağmen ciddi belirtiler göstermezken insanlarda ölümle sonuçlanabilen yüksek semptomlar gösterir (Clerx ve ark., 1981). Bilinen sadece 3 virüs hastalığa neden olur. Bunlar; KKKA, Dugbe virüs ve Nairobi’dir (Haferkamp ve ark., 2005).
1.1. Kırım Kongo Kanamalı Ateşi Hastalığı
KKKA hastalığı, ülkemizin de içinde bulunduğu geniş bir coğrafyada görülmektedir (Şekil 1.1). Afrika, Asya, Güneydoğu Avrupa ve Ortadoğu’da bulunan 30 ülkenin üzerinde hastalığın ortaya çıktığı bildirilmiştir (Lindenbach, 2001). Balkan yarımadası bu hastalık için endemik bölgedir (Vesenjak-Hirjan, 1991).
düşmekte ve enfeksiyonun şiddetli komplikasyonları nedeniyle hastalar ölmektedir (Ahmeti ve ark., 2006).
Şekil 1.1. KKKA Hastalığı’nın Dünya’da Yayılışı (Whitehouse, 2004)
KKKA klinik olarak ilk defa 1944’de Kırım’da ve önceki Sovyetler Birliği’nde 200’ün üstünde olayın baş göstermesiyle tanımlanmış ve ‘Kırım Kanamalı Ateşi’ olarak adlandırılmıştır. Daha sonra 1956’da Kongo’da izole edilen bir virüsle benzerliği bulunmuş ve adı ‘Kırım-Kongo Kanamalı Ateşi’ olarak kabul edilmiştir (Whitehouse, 2004).
.
KKKA virüsü insanlarda ölüm oranı %30’a varan şiddetli hastalıklara neden olur (Papa A. ve ark., 2006). Virüs, ilk infekte ettiği bölgeden bölgesel lenf nodlarına, karaciğer ve dalağa yayılır. Bu bölgelerde, virüs, doku makrofajlarını ve dendritik hücreleri infekte eder (Şekil 1.2). Çözünür faktörler, virüsün infekte ettiği monosit ve makrofajlardan salınır. Lokal ve sistemik olarak hareket eder. Virüsün infekte ettiği bu hücrelerden salınan kemokinler makrofajları infeksiyon bölgesine toplar (Whitehouse, 2004).
Şekil 1.2. KKKA Hastasına Ait Kanamalı Bir Kol (Whitehouse, 2004)
Trombositopeni ve lökopeni klinik bulguları arasındadır. Ayrıca aspartat aminotransferaz (AST), alanin aminotransferaz (ALT) ve laktat dehidrogenaz (LDH) oranlarında yükselme görülür. Bu hastalıkta patogenezinde ve sonuçlanmasında sitokinler rol oynar. Serumdaki TNF-alfa, sTNF-R, IL-6 ve IL-10 konsantrasyonları hastalığın seyrini ölçer. TNF-alfa ve IL-6 sitokinleri çoğunlukla KKKA viral enfeksiyonu esnasında keşfedilmiştir. IL-6 hem şiddetli hem de hafif durumlarda yükselirken, TNF-alfa, KKKA’nin şiddetli formlarında ortaya çıkar (Papa ve ark., 2006).
KKKA hastalığında inkübasyon süresinin ardından grip benzeri semptomlar görülmeye başlar. Bunlar yaklaşık bir hafta sonra dinebilir. Belirtileri, ateş, halsizlik, başağrısı, kırıklık, duygu durumda dalgalanma, zihinsel karmaşa ve burun kanaması, dışkıda ve idrarda kanama, yüz ve göğüste kırmızı döküntüler, gövde, kol, bacaklarda morluklar görülür. Bunlar kanama pıhtılaşma bozukluğuna bağlıdır. Kanama yani hemoraji belirtileri rahatsızlığın ilk 3-5 gününde görülmeye başlar. Daha da ilerleyerek, akciğer karaciğer (ağrılı ve büyük karaciğer), böbrek yetmezliği ile ölüm oluşabilir (Ergonul, 2007).
replikasyonunu engellediği belirtilmiştir. Nükleokapsit bileşenleriyle etkileşerek yeni virüs parçacıklarının üretimini inhibe etmektedir ( Andersson ve ark., 2004).
1.2. KKKA VİRÜSÜNÜN MOLEKÜLER BİYOLOJİSİ
Bunyavirüsler, zarflı, negatif kutuplu, 3 parçalı, tek zincirli RNA genomuna sahiptirler (Şekil 1.3 ). Üç genom parçası, 4 yapısal proteinle şifrelenmiştir (Schmaljohn ve ark., 1998). RNA bağımlı RNA polimeraz (L protein) L (Large) segmenti tarafından, glikoproteinler (GN, GC), M (Medium) segmenti tarafından, nükleokapsit proteini (NP) ise, S (Small) segmenti tarafından şifrelenmiştir (Elliot ve ark., 1991 ). KKKA virüsünde, yaklaşık 45 kDa ağırlığında, GN ve GC’den ayrı olarak üçüncü bir yapısal glikoprotein belirlenmiştir. Fakat bu glikoproteinin şifrelenme stratejisi henüz analiz edilememiştir (Morikawa ve ark., 2002). Üç RNA segmentinin hepsinin 3’ ucundaki ilk 8 ila 13 nükleotitlik dizi korunmuş dizidir, 5’ ucundaki komplementer olan konsensus dizisiyle birlikte, segmentlerin sonu nonkovalent olarak bağlıdır, dolayısıyla RNA, nükleokapsit içerisinde serbest bağlı dairesel konfigürasyondadır (Papa ve ark., 2002).
KKKA virüsünün, M segmentinin L ve S segmentlerinin uçlarına çok fazla komplementer olduğu gösterilmiştir. Bunların rolü RNA polimerazın bağlanması için önemli cis-acting elementler olarak kuvvetlendirilmiştir (Mettenleiter, 2002).
1.3. VİRAL RNA’NIN YAPISI
1.3.1. S Segmenti
S segmenti 1672 bp’dir (Marriott ve Nuttall, 1992) ve nükleokapsit proteinini kodlar (Papa ve ark., 2002A). S segmenti analizi, 3’ nonkodlama bölgesinin KKKA virüsünün Avrupa, Orta Asya ve Çin’deki sirkülasyonunun, infeksiyonun global bir odaktan orjin almış olabileceğini pek çok KKKA virüs genovaryantını içerdiğini ileri sürmektedir. Evrimleşme esnasında, Fragmental değişimin S segmentinin 3’ kodlanmayan bölgesinde homolojik rekombinasyonun bir sonucu olarak meydana gelmiştir (Seregin ve ark., 2006).
1.3.2. L Segmenti
AST/T130908 dizisi, Hyalomma marginatum kenelerinden (2002’de Astrakhan bölgesinden toplanmış) izole edilmiş ve RT-PCR ile çoğaltılmıştır. AST/ T130908 L segment dizisi, 12112 nükleotit uzunluğunda olup %41.3’ü G+C (guanin+sitozin)’den oluşur. L segmenti, kodlama bölgesi dizisinin tamamı için KKKA virüsünün dizisi TAJ/HU8966, 1990’da Tacikistan’daki hastalardan izole edilmiştir. Bu L segmenti 12133 nükleotit uzunluğunda olup %41.1 oranında G+C içerir (Meissner ve ark., 2006).
1.3.3. M Segmenti
M segmenti 5366 bp’dir. M segmenti, glikoprotein öncülerini kodlar bunlar da zar glikoproteinleri olan GN ve GC’yi oluşturur (Papa ve ark., 2002A). KKKA virüsünün M segmenti, 5356-5377 nükleotiti kapsar ve şifrelediği protein 1689-1697 aminoasiti kapsar (Morikawa ve ark., 2002).
cDNA aracılığıyla replike olur (Şekil 1.4). Golgi cisimciğinde veya plazma membranında yapı taşları birleştirilir. Plazma membranında tomurcuklanma ve zarlanarak hücre dışına çıkış veya golgi cisimciğinde zarlanma ve ekzositoz ile hücre dışına çıkış gerçekleşir (Whitehouse, 2004).
Şekil 1.4 Bunyaviridae Ailesindeki Virüslerin Replikasyonu (Whitehouse, 2004)
Virüsün konak hücre yüzeyindeki spesifik reseptöre bağlanmasıyla, virüsün hücre içine giriş basamağı tamamlanmış olur. KKKA virüsünün şu an için reseptörü bilinmemektedir. Araştırmalar, KKKA virüsünün hücre içine girişinin klatrin bağımlı endositozla gerçekleştiğini göstermiştir. Ayrıca, KKKA virüsünün girişine kolesterolle zenginleştirilmiş plazma membranına spesifik mikrodomainler aracılık etmektedir (Simon, 2008).
Çünkü stoplazma yoğundur ve uzun geçişli difüzyona izin vermez. Hücre içi taşıma mikrotübüller veya aktin filamentler ve onlarla ilişkili motorlar aracılığıyla gerçekleşir.
Viral transkripsiyon işleminde, sabit ya da dinamik mikrotübüllere ihtiyaç vardır. Mikrotübüller viral montajda ve/veya çıkışta çok önemlidir. Bunun yanında taşıma trafiğinde aktin filamentler hazırdır ve moleküllerin hücre içine ve dışına salınımında önemlidir. KKKA virüsünün yaşam döngüsünde virüs proteinleri aktinle doğrudan ilişkili olup hücre içi pozisyonda önemlidir (Simon ve ark., 2009). KKKA virüsünün nükleokapsit proteini (NP) infekte ettiği hücrenin perinükleer bölgesinde lokalize olmuştur. Viral NP’nin de perinükleer bölgeleri hedef alabilmesi için aktin filamentleri gereklidir (Andersson ve ark., 2004).
1.4.1. Replikasyonda Glikoproteinlerin Önemi
Viral glikoproteinler, hedef hücrelerin üzerindeki reseptör bölgelerini tanımaktan sorumludurlar. Virüsler bağlanmayı takiben endositoz ile hücre içine girerler. Stoplazmada replikasyon meydana gelir ve virionlar golgi bölgesindeki stoplazmik veziküller içerisinde endoplazmik retikulum boyunca tomurcuklanarak olgunlaşırlar. Olgunlaşan virionlar endoplazmik retikulumdan tomurcuklanarak ayrılırlar ve golgi bölgesinde, stoplazmik veziküller içerisine alınırlar. Buradan da füzyon işlemi ile virüs en dıştaki zarını almış olarak çıkar (Flick ve ark., 2003). N terminal glikoproten (GN), golgi kompleksine lokalize olmuştur. Tersine, C terminal glikoproteinler (GC) endoplazmik retikulumda bulunur (Ahmeti ve Raka, 2006).
2. MATERYAL VE YÖNTEM
2.1. Materyal
Çalışmada 2008 yılında Tokat ve ilçelerinden toplanan keneler ile KKKA hastalığı öyküsü olan kişilerden alınan serum örneklerinden izole edilmiş viral RNA kullanılmıştır.
2.1.1. Kullanılan Kimyasal Madde ve Malzemeler
Agaroz, Ethidium Bromür, Bromfenol Blue (Sigma), Tris, Gliserol, Asetat, EDTA, HCl, NaOH, Ethanol, amfisilin, agar, BamHI, XhoI, BSA, triptofan, maya ekstraktı, NaCl, Escherichia coli GM2163, Escherichia coli JM107, M13/pUC-F (Iontek) ve M13/pUC-R (Iontek), T7 PRMTR (Iontek) ve SP6 PRMTR (Iontek), KK536-F ve KK536-R primer setleri, Viral RNA İzolasyon Kiti (Roche), Plazmit İzolasyon Kiti (Roche), cDNA Sentez Kiti (Roche), Klasik PCR Kiti (Promega), RT-PCR Kiti (Roche), Klonlama Kiti (Fermentas) kullanıldı. Bunların yanı sıra, erlen, beher, termometre, mezür, bistüri, falkon tüpleri, petri kapları, steril pipet uçları, steril appendorflar, steril PCR tüpleri ve cam şişeler kullanıldı.
2.1.2. Kullanılan Cihazlar
Thermal Cycler (Peqlab), Santrifüjler (Appendorf, Hettich), UV transillüminatör (Syngene), Güç Kaynağı (Consort), Yatay Elektroforez (Scie-plas), Hassas Terazi (Acculab), pH metre (Hana), Otomatik Pipetler (Appendorf, Brand), Manyetik Karıştırıcılar, Vorteks (Ika), Buz makinası (Scotsman), Otoklav (Hiclave), Etüv (Memmert), Mikrodalga Fırın (Arçelik), +4 °C’deki, -20 °C’deki ve -80 °C’deki buz dolapları (Uğur, Arçelik, U410 Premium), Fotoğraf makinası (Sony), Saf Su Cihazları (Mes mp minipure, Millipore), Steril Kabin (Esco) ve Çalkalayıcı Etüv (Heidolph) kullanıldı.
2.1.3. Tampon ve Solüsyonların Hazırlanması
2.1.3.1. 0.5 M EDTA Solüsyonu
16.81 g EDTA 90 ml saf su içerisinde manyetik karıştırıcı yardımıyla tamamen çözünene kadar karıştırıldı. pH: 8.0’a ayarlandıktan sonra hacim 100 ml’ye tamamlandı. Otoklavda 121 °C’de 20 dk. steril edilip +4 °C’deki buz dolabında saklandı.
2.1.3.2. 50X Tris Asetat EDTA (TAE) Tamponu
242 g Tris, 57.1 ml Glasiyal asetik asit ve 100 ml 0.5 M EDTA manyetik karıştırıcı yardımıyla tamamen çözününceye kadar karıştırıldı. Hazırlanan çözeltinin pH’ı Glasiyal asetik asit ile 8.5’e ayarlandı. Toplam hacim saf su ile 1 L’ye tamamlandı. Otoklavda steril edilip +4 °C’deki buz dolabında saklandı.
2.1.3.3. 10X TE Tamponu
10 ml 1 M Tris HCl (pH: 8.0), 2 ml 0.5 M EDTA (pH: 8.0) homojenize edilip, hacim saf su ile 1 L’ye tamamlandı. Hazırlanan tampon otoklavlanıp +4 °C’deki buz dolabında saklandı.
2.1.3.4. 1X TE Tamponu
1 ml 1 M Tris HCl (pH: 8.0), 0.2 ml 0.5 M EDTA (pH: 8.0) homojenize edilip, hacim saf su ile 1 L’ye tamamlandı. Hazırlanan tampon otoklavlanıp +4 °C’deki buz dolabında saklandı.
2.1.3.6. Primerlerin Hazırlanması
Çalışmada kullanılan pirmerlerden bazıları aşağıda verilmiştr; T7 PRMTR (GTA ATA CGA CTC ACT ATA) , SP6 PRMTR (CAT TTA GGT GAC ACT ATAG), M13/pUC-F -20 (5’ GTA AAA CGA CGG CCA GT 3’), M13/pUC-R (5’ AAC AGC TAT GAC CAT 3’), KK536-R (5’ TGG CAC ACC TTC ACA AAC TC 3’) ve KK536-F (TGG ACA CAC CTT CAC AAA CTC) primerleri.
T7 PRMTR primerine, 68,1 pmol/ul ve SP6 PRMTR primerine ise 65,5 pmol/ul 1X TE tamponu eklendi. KK536-R ve KK536-F primerlerine 62.4 pmol/ul 1XTE eklendi. M13/pUC-R ve M13/pUC-F primerleri de 1XTE ile sulandırıldı. Primerler tamamen çözünmeleri için +4 °C’de bekletildi. Stok primerler 100 uM konsantrasyonda hazırlanmışken, çalışma kullanım stokları 10 uM konsantrasyonunda hazırlanmıştır.
2.1.4. LB Besiyerinin Hazırlanması
Rekombinant plazmit, Escherichia coli (E. coli) hücrelerine transforme edildi. Transforme olan hücrelerin seçimi ve çoğaltılması amfisilin içeren katı ve sıvı Luria Bertani (LB) besiyerlerinde gerçekleştirildi. Ayrıca toz halinde gelen E.coli hücreleri bir miktar LB besiyeri ile canlandırıldı.
2.1.4.1. Sıvı LB Besiyerinin Hazırlanması
10 g triptofan, 5 g maya ekstraktı, 10 g NaCl cam bir şişeye konup 950 ml distile su içerisinde manyetik karıştırıcı yardımıyla çözündü. Çözeltinin pH’ı 7.0’a ayarlandı. Hacim, distile suyla 1000 ml’ye tamamlandı. Otoklavda 20 dakika sterilizasyonu yapıldı. Hazırlanan bu besiyere, gerektiği kadar soğuduktan sonra, kullanım amacına göre 500 ul amfisilin eklendi.
2.1.4.2. Katı LB Besiyerinin Hazırlanması
10 g triptofan, 5 g maya ekstraktı, 10 g NaCl ve 15 g agar cam bir şişeye konup 950 ml distile su içerisinde manyetik karıştırıcı yardımıyla çözündü. Çözeltinin pH’ı 7.0’a ayarlandı. Hacim, distile suyla 1000 ml’ye tamamlandı. Otoklavda 20 dakika sterilizasyonu yapıldı. Hazırlanan bu besiyeri, gerektiği kadar soğuduktan sonra, kullanım amacına göre 500 ul amfisilin eklendi. Hazırlanan besiyeri petri kaplarına döküldü ve soğuyup katılaşması beklendi.
2.2. Yöntem
2.2.1. Kene Dokularının Ayrılması
Keneler -80 ’°C den çıkarılarak sıvı azot içerisine alındı. Ardından petri kabına konan kene, steril bir bisturi yardımı ile enine olarak ikiye kesildi, iç organları çıkarıldı ve 200-500 ul steril PBS tamponuyla karıştırıldı. Bu karışım enjektör yardımı ile çekilip bir appendorf tüplerine alındı. Enjektörün iğnesinden 5-10 kez geçirilen dokuların tamamen homojenize olması ve oluşan homojenat 14000 rpm’de 5 dk. Santrifüj edilerek süpernatantı RNA izolasyonu için kullanıldı.
2.2.2. Viral RNA Ekstraksiyonu
Kenenin ayrılan dokularından ve insan serumundan KKKA virüsüne ait RNA’yı izole etmek için Roche ‘High Pure Viral RNA Isolation’ kiti kullanılmıştır. İzolasyon, kit prosedürüne uygun olarak kısaca şu şekilde yapılmıştır:
1. İlk olarak çalışma solüsyonu hazırlandı. 12 numune için, bir appendorf tüpüne 5 ml Binding Buffer kondu. Üzerine 0,4 ml Elution Buffer ile çözdüğümüz carrier RNA’dan 50 ul ekleyerek karıştırdık. Çalışma solüsyonu her zaman taze olarak hazırlandı.
2. 200 ul serum veya plazmaya, 400 ul çalışma solüsyonu eklendi. İyice karıştırılarak filtreli tüplere aktarıldı.
3. 8000 rpm’de 15 s santrüfüj edidi. Collection tüp değiştirildi.
4. Filtreli tüpe, 500 ul İnhibitör Removal Buffer (İlk kullanımda üzerine 20ml absolute ethanol eklendi) eklendi.
6. Filtreli tüpe, 450 ul Wash Buffer (İlk kullanımda üzerine 40 ml ethanol eklendi) eklendi.
7. 8000’de 1 dk. santrüfüj edildi. Collection tüp değiştirildi. 8. Tekrar 450 ul Wash Buffer eklendi.
9. 8000’de 1dk. santrüfüj edildi. Ardından maksimum hızda 10 s Santrifüj edildi. Collection tüp atıldı. Filtre bir appendorf tüp içerisine yerleştirildi.
10. 50 ul Elution Buffer filtre içerisine eklendi.
11. 8000’de 1dk santrüfüj edildi. Filtre atıldı. Appendorf tüpü içerisinde kalan saflaştırılmış viral RNA — 80 °C ‘de saklandı.
2.2.3. cDNA Sentezi
Elde edilen viral RNA’dan cDNA sentezlemek için Roche ‘Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis’ kiti kullanıldı. Prosedüre göre basamaklar kısaca şu şekildedir (Şekil 2.1):
1. Viral RNA’dan 9 ul alınıp, PCR tüpüne kondu.
2. cDNA sadece tek çeşit primerle üretileceğinden primer seçimi yapılır. Seçilen primerden 1 veya 2 ul kullanıldı. Bizim çalışmamızda Anchored-oligo (dT), Random Hexamer ve 536 primerleri kullanılmıştır.
3. Son hacim su ile 11,4 ul’ye tamamlandı.
4. Isıtıcı kapaklı Thermal Block Cycler’da, template-primer karışımı, 65 °C’de 10 dak ısıtılarak denatüre edildi.
8. Deoksynükleotid Mix’den 2 ul eklendi.
9. Son olarak DTT’den 1ul, Reverse Transkriptaz’dan 1,1 ul eklendi. Son hacmin 20 ul’ye ulaşmasına dikkat edildi.
10. Karışım, ısıtıcı kapaklı Thermal Block Cycler’da 30 dk. 55 °C’de 10 dk. 45 °C ’de, 5 dk 85 °C’de inkübe edildi.
11. Sentezlenen cDNA, -20 °C’de saklandı.
Elde edilen cDNA’ların KKKA virüsüne ait olup olmadığı Real Time PCR’da kontrol edildi.
Şekil 2.1 cDNA Sentez Basamakları (www.roche-applied-science.com) 2.2.4. Reverse Transkriptaz Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RT-PCR)
Elde edilen viral RNA’ların Roche kitine göre RT-PCR’ları yapıldı. Prosedürün basamakları takip edildi.
1. Kullanılacak komponentler buz üzerinde çözüldü. 2. dNTP mix’den 0.8 ul, PCR tüpüne eklendi. 3. DMSO’dan ve DTT solution’dan 2.5 ul eklendi. 4. RNaz inhibitor’den 0.5 ul eklendi.
5. Upstream ve Downstream primerlerden 1 ul kullanıldı. Bu çalışmamızda 536 R, 536 F primerleri kullanıldı.
6. Template RNA’dan 5 ul kullanıldı.
7. RNaz free su ile son hacim 25 ul’ye tamamlandı. 8. Ardından tekrar 13 ul RNaz free su eklendi
9. 5X RT-PCR buffer’dan 10 ul, C. therm. polymeraz mixture’dan 2 ul eklendi. 10. Toplam hacim 50 ul’ye ulaştı.
RT-PCR işlemi KK536-R (5’ TGG CAC ACC TTC ACA AAC TC 3’) ve KK536-F (TGG ACA CAC CTT CAC AAA CTC) primerleri kullanılarak yapılmıştır. RT-PCR 55 oC 30 dak, 94 oC 10 dak., 35 döngü 94 oC 30 s, 55 oC 1 dak., ve 72 oC de 10 s ve 72 oC de 5 dak. son uzama koşullarında gerçekleştirilmiştir. RT-PCR ürünleri %1 lik agaroz jel elektroforezinde koşturularak görüntülenmiştir.
2.2.5. Agaroz Jel Elektroforezi
2.2.5.1. Agaroz Jelin Hazırlanması
tamamen erimesi sağlanır. Ardından erimiş agaroza 5 ul ethidium bromür eklendi ve jel elektroforez tankına dökülür. Jelin katılaştıktan sonra üzerine TAE tamponu döküldü ve taraklar çıkarıldı.
2.2.5.2. Örneklerin Yürütülmesi
Örneklerin sayısı kadar tüp alındı. Her bir tüpe 2 ul bromfenol mavisi (BFB) eklenerek kısa süreli spin yapıldı. İlk kuyucuğa standart diğerlerine de numuneler konuldu. Güç kaynağı 100 ampere ayarlanarak 20 dakika koşturuldu.
2.2.6. Klonlama
Kırım Kongo Kanamalı Ateşi (KKHA) virüsü genomunun klonlanması için Fermentas’ın K1213, K1214 Instaclone PCR Cloning Kiti kullanıldı. Prosedüre göre:
2.2.6.1. Ligasyon
Ligasyon mix hazırlandı. Bunun için:
Vektör pTZ57R (Şekil 2.2)’den 3ul kullanıldı. 5X Ligasyon Buffer’dan 6ul kullanıldı.
T4 DNA Ligaz’dan 1 ul kullanıldı.
PCR ürünü saflaştırılmadan kullanıldığında, T4 DNA ligazın tuzlarla inhibe olmasını önlemek için 4ul’den fazla kullanılmadı. Saflaştırılmış PCR ürününden değişken miktarlarda kullanılabilir. Son hacmin 30 ul olması için kalan miktar su ile tamamlandı. Biz bu çalışmada 15 ul saflaştırılmış PCR ürünü kullandık.
1. Ligasyon mix, oda sıcaklığında (22 °C) 1saat inkübe edildi. Bakteriyel transformasyon için ligasyon mix’den 2.5 ul kullanıldı.
Şekil 2.2 pTZ57R/T vektörü (www.Fermentas.com)
2.2.6.2. Transformasyon
Transformasyon işlemi (Şekil 2.3) için taze bakteri kolonileri kullanılmalıdır. Biz bu çalışmamızda, bir gece önce 10 ml amfisilinsiz sıvı LB besiyerinde, 37 °C ’de çalkalanarak inkübe edilen E. coli GM2163 ve E. coli JM107 bakterilerini kullandık. Bakteriler ilk olarak kompotent hale getirildi. Prosedüre göre:
1. Overnight bakteriyel kültürün 150 ul’sine, pre-warmed C mediumdan 1,5 ml eklenir. 37 °C’de inkübatörde 20 dk çalkalanarak inkübe edildi.
2. Bakteri hücreleri 1 dk santrifüj edilerek pelleti ayrıldı, süpernatant atıldı.
3. Hücreler 300 ul T-solution içerisinde resuspanse edildi. Buz üzerinde 5 dk inkübe edildi.
6. Temiz mikrosantrifüj tüplerine 2,5 ul ligasyon mix veya 1 ul supercoiled DNA eklendi.
7. Hazırlanan hücrelerden, her biri DNA içeren tüplere 50 ul eklenir, karıştırılır ve 5 dk. buz üzerinde inkübe edildi.
8. Hemen pre-warmed LB ampisilinli agar tabaklarına ekildi. Tüm gece 37 °C’de inkübe edildi.
2.2.7. Rekombinant Kolonilerin Analizi
2.2.7.1. Plazmit İzolasyonu
Petri tabağında oluşan kolonilerden (Şekil 2.4) rastgele seçim yapıldı. Steril bir falkon tüpüne 20ml amfisilinli sıvı LB konuldu. Seçilen koloni bir öze yardımıyla sıvı LB içerisine ekildi ve çalkalayıcı etüvde, 37 °C’ de bir gece inkübe edildi. Ertesi gün, oluşan klonlar 14.000 rpm’de 10 dk. santrifüj edildi. Pellet süpernatanttan ayrıldı. Süpernatant atıldı ve pelletten plazmit izolasyonu yapıldı. Plazmit izolasyonu için Roche ‘High Pure Isolation’ kiti kullanıldı.
Şekil 2.4 Rekombinant Koloniler
2.2.7.1.1. Solüsyonların Hazırlanması
Süspansiyon tamponundan 1 ul alınıp liyofilize RNaz içeren cam şişeye eklendi. Oluşan RNaz/Süspansiyon karışımı +4 °C’de saklandı. İlk kullanımdan önce wash buffer I
2.2.7.1.2. Plazmit İzolasyon Basamakları
1. Appendorf tüpü içerisindeki pellete 250 ul RNaz/süspansiyon tamponu eklendi ve 30 s, 6000 rpm’de santrifüj edildi.
2. Süpernatant atıldı.
3. 250 ul lizis tamponu eklenir. Nazikçe karıştırılır, oda sıcaklığında 5 dk inkübe edilir.
4. 350 ul buz üzerindeki binding tamponundan eklendi. Nazikçe karıştırılıp 5 dk buz üzerinde inkübe edildi. Maksimum hızda 10 dk santrifüj edildi.
5. Pellet atıldı.
6. Süpernatant filtreli tüpe alınıp, maksimum hızda 30-60 s santrifüj edildi. 7. Altta kalan atıldı.
8. 500 ul wash buffer I eklenip 13.000 rpm’de 1 dk santrifüj edildi. 9. Altta kalan atıldı.
10. 700 ul wash buffer II eklendi. 13.000 rpm’de 1 dakika santrifüj edildi. Altta kalan atıldı.
11.100 ul elution buffer eklenip 13.000 rpm’de 1 dk santrifüj edildi. Filtre atılıp, altta kalan, appendorf tüpünde -20 °C’de saklandı.
Saflaştırılan plazmitlerler PCR ile test etmek için -20 oC de saklandı. Bazıları ise uygun restriksüyon endonükleazlarla kesilerek agaroz jelde yürütüldü.
2.2.7.2. Klasik Polimeraz Zincir Reaksiyonu
Pozitif klonlardaki rekombinant plazmitlerde klonlanacak DNA fragmentinin varlığını tespit etmek için PCR yapıldı. PCR testleri Promega PCR kiti kullanılarak yapıldı.
• 10X Tag tamponundan 2.0 ul PCR tüpüne konur. • dNTP karışımından 2.0 ul eklenir.
• MgCl2’den 1.2 ul konur.
• 0.6 ul forward primerden, 0.6 ul reverse primerden eklenir. • Tag DNA polimeraz enziminden 0.1 ul konur.
• Total hacmin 25 ul’ye ulaşması için kalan hacim su ile tamamlanmak üzere 11.4 ul saf su kullanıldı.
PCR işlemi 94 oC 5 dak., 35 döngü 94 oC 30 s, 55 oC 1 dak., ve 72 oC de 10 s ve 72 oC de 5 dak. son uzama koşullarında gerçekleştirilmiştir. PCR ürünleri %1 lik agaroz jel elektroforezinde koşturularak görüntülenmiştir. Klonlanan DNA’ya ait pozitif bantlar jelden ekstrakte edildi ve dizi analizine gönderildi.
2.2.7.3. Plazmitin Restriksüyon Endonükleaz Enzimi İle Kesilmesi
Plazmit, çoklu klonlama bölgesinin (Şekil 2.5) özelliğine göre uygun enzimle kesilir. Aynı anda klonlanan DNA’nın da bu enzimler tarafından kesilip kesilmediğine bakılarak uygun enzim seçilir (Şekil 2.6) ve agaroz jelde oluşan bantlar yorumlanır.
15 ul plazmit DNA 3 ul 10X BSA 3 ul 10X Buffer Multicore 1 ul XBaI 1 ul BamHI 7 ul distile su
Total hacmin 30 ul olmasına dikkat edildi. 37 °C’deki thermal block içerisinde 4 saat inkübe edildi. Her saat başı spin yapıldı.
3. BULGULAR ve TARTIŞMA
3.1. KKHAV S Fragment Taşıyan Rekombinant Plazmit Üretimi ve Klasik PCR Yöntemi ile Test edilmesi
Bu çalışmada KKKA pozitif 2 örnekten viral RNA izole edilmiş ve bu RNA örneklerinden KK536-R (5’ TGG CAC ACC TTC ACA AAC TC 3’) ve KK536-F (TGG ACA CAC CTT CAC AAA CTC) primerleri kullanılarak RT-PCR yapılmıştır. 536 baz çiftlik RT-PCR ürünleri (Şekil 3.1) bir klonlama kiti kullanarak TZ57R/T plazmitine aktarılmıştır. Daha sonra E. coli hücreleri rekombinant TZ57R/T plazmit (TZ57R/T-CCS536) ile taransfekte edilerek plazmit klonlanmıştır. Hücreler bir gece 37 °C’deki etüvde inkübe edildi. Oluşan kolonilerden rastgele seçim yapılarak amfisilinli sıvı LB besiyerine ekimleri yapıldı. Bir gece çalkalayıcı etüvde 37 °C’de inkübe edildi. Ertesi gün pellet oluşturulup plazmit izolasyonları yapılmış ve bu plazmit, 536 R ve M13/pUC F primerleri kullanılarak PCR ile test edilmiştir. Oluşan PCR ürünlerin agaroz jelde görüntülenerek 536-560 baz çifti büyüklükteki DNA bandı varlığı doğrulanmıştır (Şekil 3.2).
bant pozitif ürünü göstermektedir. Bu ürün klonlamada kullanılan üründür.
Şekil 3.2 Pozitif klonlardaki S Segmentinin PCR İle Doğrulanması. STD, DNA standardı; NK1/2, negatif plazmitler; PK1/2 pozitif plazmiler. PK2, yaklaşık 540 baz çiftlik pozitif ürünü taşıyan pozitif rekombinant plazmittir. Bu PCR testlerinde NK1/2 için M13F/R ve PK1/2 için M13F/536R primerleri kullanılmıştır.
4. SONUÇ
Sonuç olarak bu çalışmada hedeflediğimiz ve KKHAV S segmentine ait kısmı peptit üretebileceğimiz ve aynı zamanda moleküler testlerde pozitif kontrol olarak kullanılabilecek bir kontrol plazmit (TZ57R/T-CCS536) üretilmiştir. Bu rekombinant plazmitin modifiye edilmesi veya daha büyük fragmentler taşıyan yeni plazmitler üretilmesi mümkündür. Bu çalışmamız virüsün diğer fragmentlerinin klonlanmasına yönelik çalışmalarımıza ışık tutacaktır.
KAYNAKLAR
Ahmeti, S., Raka, L., 2006. Crimean Congo Haemorrhagic fever in Kosova: a fatal case report. Virology Journal, 3: 85doi: 10,1186/ 1743-422X–3–85.
Andersson, I., Simon, M., Lundkvist, A., Nilsson, M., Holmstrom, A., Elgh, F., Mirazimi, M., 2004. Role of actin filaments in targeting of Crimean Congo hemorrhagic fever virus nucleocapsid protein to perinuclear regions of mammalian cells. J Med virol, 72 (1), 83-93.
Eliot, R.M., Schmaljohn C.S., Collet, M.S., 1991. Bunyaviridae genom structure and gene expression. Curr Top Microbiol Immunol, 169, 91–141.
Eliot, R.M., Bouloy, M., Calisher, C.M., Goldbach, R., Moyer, J.T., Nichol, S.t., Pettersson, R., Plyusnin, A., Schmalijohn, c.s., 2000. Family Bunyaviridae. Virus taxonomy. Seventh report international committee for the taxonomy of viruses. Ed: Van Regenmortel, M.H.V., Fauquet, C.M., Bishop, D.H.L., Carstens, E.B., Estes, M.K., Lemon, S., Maniloff, J., Mayo, M.A., McGeorgh, D., Pringle, C.r., Wickner, R.B. Academic Pres, San Diego, CA, pp. 599-621.
Ergonul, O., 2006. Crimean-Congo haemorrhagic fever. Lancet Infect Dis 2006, 6:203- 14.
Ergonul, O., 2007. Kırım Kongo hemorajik ateşi: geçmiş ve gelecek. Klimik 2007 XIII. Türk Klinik Mikrobiyoloji ve İnfeksiyon Hastalıkları Kongresi.
Flick, R., Flick, K., Feldmann, H., Elgh, F., 2003. Reverse genetics for Crimean Congo hemorrhagic fever virus. J Virol, 77 (10), 5997–6006.
Haferkamp, S., Fernando, L., Schwarz, T.F., Feldmann, H., Flick, R., 2005. Intracellular localization of Crimean Congo hemorrhagic fever (CCHF) virus glycoproteins. Virology Journal, 2: 42 doi: 10,1186/ 1743-422X–2–42.
Le Guenno, B., 1995. Emerging viruses. Sci Am, 273, 56-64.
Lindenbach, B.D., Rice, C.M., Chanock, R.M., 2001. Flaviviridae: the viruses and their replication. In Fields virology. 4th edition. Edited by: Knippe DM, Howley PM, et al.. Philadelphia, PA:Lippincot, Williamd & Willkins, 991-1041.
Marriott, A.C., Nuttall, P.A., 1992. Comparison of the S RNA segments and nucleoprotein sequences of Crimean-Congo hemorrhagic fever, Hazara, and Dugbe viruses. Virology, 189(2),795 – 799
Mettenleiter T.C., 2002. Herpesvirus assembly and egress. J Virol 2002, 76(4), 1537– 1547.
Morikawa, S., Qing, T., Xinqin, Z., Saijo, M., Kurane, I., 2002. Genetic diversity of the M RNA segment among Crimean-Congo hemorrhagic fever virus isolates in China. Virology, 296(1), 159 – 164.
Nichol, S.T., 2001. Bunyaviruses. Ed: Knipe, D.M., Howley, P.M. Fields Virology, vol. 1, 4th ed. Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, 1603-1633.
Papa, A., Ma, B., Kouidou, S., Tang, Q., Hang, C., Antoniadis, A,. 2002. Genetic characterization of the M RNA segment of Crimean Congo hemorrhagic fever virus strains, China. Emerg Infect Dis, 8(1), 50 – 53.
Papa, A., Bino, S., Velo, E., Harxhi, A., Kota, M., Antoniadis, A., 2006. Cytokine levels in Crimean Congo hemorrhagic fever. Journal of Clinical Virology, Volume 36, Issue 4, Pages 272–276.
Seregin, S.V., Tumanova, I.Iu., Petrova, I.D., Iashina, L.N., Kuzina, I.I., Vyshemirskii, O.I., Gutorov, V.V., Seregin, S.S., Tiunnikov, G.I., Samokhvalov, E.I., L'vov, D.K., Netesov, S.V., Petrov, V.S., 2006. Genomic S segment of Crimean-Congo hemorrhagic fever virus circulating in Russia and Bulgaria. Vopr Virusol, 51(3), 25 – 32.
.
Simon, M., 2008. Crimean Congo hemorrhagic fever Virus: Interactions with host cell structures in viral replication (Ph. D.), Karolinska Instituet Stockholm.
Simon, M., Johansson, C., Lundkwist, A., Miraazimi, A., 2009. Microtubule dependent and microtubule independent steps in Crimean Congo hemorrhagic fever virus replication. Virology, 385 (2), 313–22.
Simpson, D.L., 1978. Viral hemorrhagic fevers of man. Bull WHO, 56, 819-832.
Van Regenmorte, M.H.V., Fauguet, C.M., Bishop, D.M.L., Carstens, E.B., Estek, M.K., Lemon, S.M., Manilaff, J., Mago, M.A., McGeach, D.J., Pringle, C.R., Wicknen, R.B., 2000. 7th report of the international committee of taxonomy of viruses. Virus Taxonomy, 599-621.
Vesenjak-Hirjan, J., Punda-Polic, V., Dobe, M., 1991. Geographical distribution of arboviruses in Yugoslavia. J Hyg Epidemiol Microbiol Immunol, 35(2), 129–40.
Whitehouse, C.A., 2004. Crimean-Congo hemorrhagic fever. Antiviral Res, 64(3), 145 – 160.
ÖZGEÇMİŞ
Kişisel Bilgiler
Adı Soyadı : Aşiyan Karabulut
Doğum Tarihi ve Yer : 19.07.1983/Alaçam Medeni Hali : Bekâr
Yabancı Dili : İngilizce Telefon : 0.546.6709909
e-mail : asiyan_karabulut@mynet.com
Eğitim
Derece Eğitim Birimi Mezuniyet Tarihi
Yüksek Lisans GOÜ Fen Bil. Enst. Moleküler Biyoloji
2008 -2010 Lisans PÜ Fen Edb. Fak. Biyoloji Bölümü 2006–2007 Lise Bafra Kızılırmak Lisesi 1999–2000
İş Deneyimi
Yıl Yer Görev
2007 - 2008 Yakakent Sarıköy İlköğretim Okulu Sınıf Öğretmeni 2009-….. Yakakent Çamalan İlköğretim Okulu Sınıf Öğretmeni
