GAZİOSMANPAŞA ÜNİVERSİTESİ
Bilimsel Araştırma Projeleri KomisyonuSonuç Raporu
Proje No: 2009/59
Mahlep Çekirdeğinden İzole Edilen Proteince Zengin Ürünün Bazı Kimyasal ve Fonksiyonel Özelliklerinin İncelenmesi
Proje Yöneticisi Prof. Dr. Metin YILDIRIM
Birimi
Mühendislik ve Doğa Bilimleri Fakültesi Gıda Mühendisliği Bölümü
Araştırmacılar ve Birimleri Melih GÜZEL
Mühendislik ve Doğa Bilimleri Fakültesi Gıda Mühendisliği Bölümü
ÖZET*
MAHLEP ÇEKĠRDEĞĠNDEN ĠZOLE EDĠLEN PROTEĠNCE ZENGĠN ÜRÜNÜN BAZI KĠMYASAL VE FONKSĠYONEL ÖZELLĠKLERĠNĠN ĠNCELENMESĠ
Bu çalıĢmada, mahlep çekirdeği içinden protein konsantresi üretilmesi ve üretilen protein konsantresinin bazı kimyasal ve fonksiyonel özelliklerinin incelenmesi amaçlanmıĢtır. Mahlep çekirdeği içi proteinleri pH 10,0’da ekstrakte edilip pH 4,5’te çöktürülerek protein konsantresi hazırlanmıĢtır. Protein konsantresinin kurumadde, yağ, toplam karbonhidrat, protein ve kül içeriği; protein çözünürlüğü, su ve yağ tutma kapasitesi, emülsiyon aktivite indeksi ve emülsiyon stabilite indeksi, köpük kapasitesi ve stabilitesi, minimum jel oluĢturan konsantrasyonu ve proteinlerin molekül ağırlıkları belirlenmiĢtir.
Protein konsantresi %92,73±0,65 kurumadde, %6,29±0,12 kül, %6,02±0,35 karbonhidrat, %1,42±0,09 yağ ve %73,11±0,80 protein içermiĢtir. Su tutma kapasitesi, yağ tutma kapasitesi ve minimum jel oluĢturan konsantrasyonu sırasıyla %281±2,0, %166±0,10 ve %12 olarak bulunmuĢtur. Maksimum çözünürlük pH 12,0 (%95,97±1,94) ve minimum çözünürlük ise pH 6,0’da (%16,71±0,45) gözlenmiĢtir. Emülsiyon aktivite indeksi 27,21±2,50 m2/g, emülsiyon stabilite indeksi ise 81,05±1,49 dakika olarak belirlenmiĢtir. Protein konsantresinin köpük kapasitesi %43,75±8,84 ve köpük stabilitesi ise %71,33±21,68 (30 dakika sonra) olarak belirlenmiĢtir. Protein konsantresinin emülsifiye etme ve köpürme özellikleri sodyum kazeinattan daha düĢük bulunmuĢtur. Sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) yağsız mahlep çekirdeği içi unundaki protein fraksiyonlarının hemen hemen tamamının protein konsantresinde tutulduğunu göstermiĢtir. Üretilen protein konsantresinin fonksiyonel ve kimyasal özellikleri dikkate alındığında protein konsantresinin bazı gıda formülasyonlarında kullanım alanı bulabileceği anlaĢılmıĢtır.
Anahtar Kelimeler: Mahlep çekirdeği içi protein konsantresi, Fonksiyonel özellikler
(*) Bu çalıĢma GaziosmanpaĢa Üniversitesi Bilimsel AraĢtırma Projeleri Komisyonu tarafından desteklenmiĢtir (Proje No: 2009/59).
INVESTIGATION OF SOME CHEMICAL AND FUNCTIONAL PROPERTIES OF PROTEIN RICH PRODUCT FROM MAHALEB SEEDS
The aims of this research were to produce protein concentrate from mahaleb (mahlab) seed kernels, and to investigate its some chemical and functional properties.
Protein concentrate was prepared from the defatted powder of mahaleb seed kernels by extracting at pH 10.0, and precipitating at pH 4.5. Dry matter, fat, total carbohydrate, protein, and ash contents; protein solubility, water and oil absorption capacity, emulsifying activity and stability indices, foaming capacity and stability, least gelling concentration, and molecular weight of the resulting concentrate were determined.
Protein concentrate contained 92.73±0.65% dry matter, 6.29±0.12% ash, 6.02±0.35% carbohydrate, 1.42±0.09% fat, and 73.11±0.80% protein. Water holding capacity, oil holding capacity and least gelling concentration of protein concentrate were 281±2.0%, 166±0.10%, and 12%, respectively. Protein concentrate showed minimum and maximum solubility at pH 6.0 (16.71±0.45%) and 12.0 (95.97±1.94%), respectively. Emulsifying activity and stability indices, foaming capacity and stability of protein concentrate were 27.21±2.50 m2/g, 81.05±1.49 min, 43.75±8.84% and 71.33±21.68% (after 30 minutes), respectively. Emulsifying and foaming properties of protein concentrate were lower than those of sodium caseinate. Sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) analysis showed that almost all of the protein fractions in the defatted powder were transferred to the protein concentrate. The protein concentrate may find applications in some food formulations with regards to its functional and chemical properties.
Keywords: Mahaleb kernel protein concentrate, Functional properties
İÇİNDEKİLER Sayfa ÖZET……….……….….………... ABSTRACT……….……….….……….………..… i ii
ĠÇĠNDEKĠLER……….………..…..……….……… ġEKĠLLER DĠZĠNĠ………….……….……...………..… ÇĠZELGELER DĠZĠNĠ………...………..…. iii v vi 1. GĠRĠġ……….…….……… 1 2. KAYNAK ÖZETLERĠ………...……..……….. 4
2.1. Mahlep Çekirdeklerinin Özellikleri………. 4
2.2. Proteinlerin Fonksiyonel Özellikleri………..…... 5
3. MATERYAL VE YÖNTEM………..…...…………..…... 15
3.1. Materyal………..………... 15
3.2. Yöntem………...……….……… 15
3.2.1. Mahlep Çekirdeği Ġçinden Yağın UzaklaĢtırılması……...………. 15
3.2.2. Mahlep Çekirdeği Ġçi Protein Konsantresinin (MÇĠPK) Hazırlanması…... 15
3.2.3. Mahlep Çekirdeği Ġçi ve Ürünlerinin Fiziksel ve Kimyasal Nitelikleri... 16
3.2.3.1. Mahlep Çekirdeği Ġçi ve Ürünlerinin Kurumadde Analizleri.…………...….. 16
3.2.3.2. Mahlep Çekirdeği Ġçi ve Ürünlerinin Yağ Analizleri…….………. 16
3.2.3.3. Mahlep Çekirdeği Ġçi ve Ürünlerinin Toplam Karbonhidrat Analizleri.……. 17
3.2.3.4. Mahlep Çekirdeği Ġçi ve Ürünlerinin Protein Analizleri………...……. 17
3.2.3.5. Mahlep Çekirdeği Ġçi Protein Konsantresinin Kül Analizi……….. 18
3.2.3.6. Mahlep Çekirdeği Ġçi ve Ürünlerinin Renk Değerlerinin Ölçümü ..……... 18
3.2.3.7. Yağsız Mahlep Çekirdeği Ġçi ve Mahlep Çekirdeği Ġçi Protein Konsantresinin SDS-PAGE ile Ġncelenmesi……….... 19
3.2.4. Mahlep Çekirdeği Ġçi Protein Konsantresinin Fonksiyonel Özelliklerinin Belirlenmesi……….………..….……… 20
3.2.4.1. Protein Çözünürlüğünün Belirlenmesi ………..……... 20
3.2.4.2. Su ve Yağ Tutma Kapasitesinin Belirlenmesi ………...……….……… 20
3.2.4.3. Köpük Kapasitesi ve Stabilitesinin Belirlenmesi………. 21
3.2.4.4. Emülsiyon Aktivite Ġndeksi (EAĠ) ve Emülsiyon Stabilite Ġndeksinin (ESĠ) Belirlenmesi………. 22
3.2.4.5. Minimum Jel OluĢturan Konsantrasyonun (MJOK) Belirlenmesi………….. 23
3.2.5. Ġstatistiksel Değerlendirme………. 23
4. BULGULAR ve TARTIġMA………..….. 24
4.1. Protein Konsantresinin Hazırlanması………... 24
4.1.1. Örneklerin Öğütülmesi ve Yağ Ekstraksiyonu………... 24
4.1.2. Ekstraskiyon pH’sının Belirlenmesi………...……… 25
4.1.3. Protein Konsantresinin Hazırlanması ve BileĢimi………... 27
4.1.4. Mahlep Çekirdeği ve Ġçi Ürünlerinin Renk Değerleri………...………. 29
4.2. Mahlep Çekirdeği Ġçi Protein Konsantresinin Fonksiyonel Özellikleri……….. 31
4.2.1. Protein Çözünürlüğü ………... 31
4.2.2. Su Tutma Kapasitesi………..………... 33
4.2.3. Yağ Tutma Kapasitesi………...………... 34
4.2.4. Köpük Kapasitesi ve Stabilitesi………….………. 35
4.2.5. Emülsiyon Aktivite Ġndeksi ve Emülsiyon Stabilite Ġndeksi……….. 38
4.2.7. Jel Elektroforezi (SDS-PAGE)…..………. 40
5. SONUÇ………..……… 42
KAYNAKLAR……….……….. 44
ŞEKİLLER DİZİNİ
Sayfa ġekil 4.1. Yağsız mahlep çekirdeği içi örneklerinden proteinlerin ekstraksiyonuna
pH’nın etkisi……….. 26 ġekil 4.2. Mahlep çekirdeği içi protein konsantresinin farklı pH değerlerindeki
çözünürlükleri………... 32 ġekil 4.3. Protein örneklerinin köpük stabilitesinde zamanla gözlenen değiĢim ……. 37 ġekil 4.4. Mahlep çekirdeği içi ürünlerinin SDS-PAGE elektroforetogramı………… 41
ÇİZELGELER DİZİNİ
Sayfa Çizelge 4.1. Mahlep çekirdeği içinin yağ ekstraksiyon öncesi ve sonrası bileĢimi…….. 25 Çizelge 4.2. Protein konsantresinin bazı kimyasal nitelikleri………... 27 Çizelge 4.3. Yağsız mahlep çekirdeği içi proteinlerinin, protein konsantresinde tutulma
oranları……….. 29 Çizelge 4.4. Mahlep çekirdeği içi ürünlerinin renk değerleri……… 30 Çizelge 4.5. Protein konsantresinin 1,0-12,0 pH aralığındaki protein çözünürlüğü……. 33 Çizelge 4.6. Protein konsantresinin su ve yağ tutma kapasiteleri………. 34 Çizelge 4.7. Protein konsantresinin ve Na-kazeinatın köpük kapasiteleri ve stabiliteleri. 37 Çizelge 4.8. Protein konsantresinin emülsiyon aktivite ve emülsiyon stabilite indeksi… 39
Çizelge 4.9. Mahlep çekirdeği içi protein konsantresinin minimum jel oluĢturan konsantrasyonları……….. 40
1. GİRİŞ
Gıda iĢlemenin değiĢik aĢamalarında çeĢitli katı veya sıvı atıklar açığa çıkmaktadır. Meyve iĢleme tesislerinde en fazla karĢılaĢılan atık kabuk, posa ve çekirdektir. Çevre kirliliği, gıda yetersizliği gibi kaygılar, atıkların ekonomik ve güvenli bir Ģekilde geri dönüĢümünü sağlayacak yöntemlerin geliĢtirilmesi ihtiyacını da beraberinde getirmektedir (Kamel ve Kakuda, 1992). Günümüzde bu atıklar hayvan yemi olarak kullanma, fermantasyon yoluyla tek hücre proteinine dönüĢtürme, biyo-yakıt üretme gibi değiĢik uygulamalar ile değerlendirilmeye çalıĢılmaktadır (Kamel ve Kakuda, 1992; Duman ve ark., 2011).
Rosaceae familyasında yer alan mahlebin (Prunus mahaleb L.) vatanı Batı Asya ve
Avrupa’dır. Bu bitki Güney Avrupa, Fransa, Güney Almanya, Kuzey Asya, Kafkasya ve Türkistan içlerine kadar uzanan geniĢ bir alanda doğal olarak yetiĢmektedir. Ülkemizde ise Tokat, Mardin, Çorum, GümüĢhane, Amasya, Ordu, Erzurum, UĢak ve Van yöresinde doğal olarak yetiĢmektedir. Yöresel olarak Ġdris, Yabani Kiraz, TaĢ Kirazı, Endirez, Keniro, Kokulu Kiraz, Endülüs ve Meltem gibi isimlerle anılmaktadır (Mataracı, 1997; Ġlisulu, 1992). Ġnglizce’de ise English cherry, Rock cherry, St. Lucie cherry gibi isimler verilmiĢtir (Mariod ve ark., 2010).
Mahlep kayalık ve güneĢli yerlerde yetiĢir. Yapraklarını döken küçük ağaç ya da ağaççık formunda olup beyaz renkli ve kokulu çiçekleri vardır (Moreno ve ark. 1996). Mahlep ağacı alçak boylu, sık ince dallı, yayvan, bazen sarkık taçlıdır. Çiçek teĢekkülü salkımı andırır. Dolayısıyla meyveleri de salkımlardan meydana gelir. Meyveleri çok küçük küresel, tam olgunlaĢtıkları zaman koyu kırmızı veya siyah renklidir. GeliĢme kuvveti, kabuk, yaprak ve meyve rengi, meyve Ģekli ve döllenme durumu bakımından birbirinden farklı mahlep tipleri mevcuttur (YeĢiloğlu, 2005).
Sarı Mahlep ve Kara Mahlep olmak üzere yurdumuzda yetiĢen iki önemli mahlep tipi vardır. Sarı mahlep meyveleri olgunlaĢınca kırmızı renk alır, gövde açık renklidir. Tokat bölgesinde kiraz ve viĢneye anaç olarak kullanılan çeĢit sarı mahleptir. Kiraz ve viĢne ile çok iyi uyuĢan
tipleri vardır. Kara mahlep meyveleri olgunlaĢınca siyah bir renk alır. Kara mahlep, kiraz ve viĢne için uygun anaç değildir. Gövdesi de siyaha yakın renklidir. AĢılama sonucunda iyi bir uyuĢma sağlamaz. AĢı iyi bir tutum sağlar ama 3-4 yıl sonra aĢı yerinden kırılmalar, geliĢmede durma ve kuruma gibi belirtilerle gecikmiĢ uyuĢmazlık olayı görülebilir (YeĢiloğlu, 2005). Türkiye’deki kiraz ağaçlarının %75-80’inin mahlep anacı üzerine aĢılı olduğu belirtilmektedir (Mısırlı, 1992).
Mahlebin mutfaktaki kullanımı Türkiye, Yunanistan ve Ermenistan ile sınırlıdır (Aydin ve ark., 2002). Ancak Sudan’da ekmeğe lezzet vermek amacıyla kullanıldığı da bildirilmektedir. Mahlep çekirdeği içi Sudan’da ayrıca geleneksel losyonların üretiminde ve çocuklarda ishal önleyici ilaç olarak da kullanılmaktadır (Mariod ve ark., 2010). Ülkemizde, kurutulan meyveleri baharat olarak, çekirdek içleri çöreklere koku vermek amacıyla ve kokulu dalları ise tütün çubuğu yapımında kullanılmaktadır (Yaltırık ve Efe, 2000). Ayrıca yöresel ilaçlarda tonik ya da anti diyabetik olarak da kullanılmaktadır (Sezik ve Basaran, 1985). Meyvelerinin jölesi, pestili ve Ģekerlemesi yapılmaktadır (Gerçekçioğlu ve GüneĢ, 1992; Meraler, 2010). Ayrıca α-eleostearik asitçe (9cis, 11trans, 13trans - 18:3) zengin bir yağ içermesi nedeni ile boya sanayiinde kullanılır. Ağaç kabuklarının hoĢ kokulu olması, kumarin içermesinden ileri gelmektedir (Meraler, 2010).
Mahlep çekirdeği önemli düzeyde yağ (%30,9) ve protein (%28,0) içermektedir (Mariod ve ark., 2009). Çekirdek içinde kumarin, herniarin (7-metoksikumarin), dihidrokumarin ve düĢük miktarlarda amigdalin (mandelonitril-β-gentiobiosid) bulunmaktadır. Çekirdek içi yumuĢak yapılı, hoĢ kokulu ancak acı bir tada sahiptir. Özellikle belirli bir süre çiğnendikten sonra hafif bir badem lezzeti oluĢturur (Mastelić ve ark., 2006; Jerković ve ark., 2011).
Bir gıdanın tüketici açısından önem taĢıyan fonksiyonel özellikleri, gıdanın besleyici değerinin dıĢında kalan diğer niteliklerinin tümüdür. Tüketici tercihlerini etkileyen bu nitelikler sırasıyla tekstür, tat-koku, renk ve görünüĢtür. Fonksiyonel özellikler sadece son ürünün kalitesini belirlemek açısından değil ayrıca iĢlenmiĢ et ürününün dilimlenmesi, bisküvi hamurunun makinelerle taĢınabilmesi gibi üretim aĢamalarının kolaylaĢtırılması ve yeni gıda maddelerinin geliĢtirilmesi açısından da önemlidir (Singh ve ark., 2008; Ogunwolu ve ark., 2009). Bu nedenlerle proteinler, tat-koku maddelerini taĢıma, köpük, emülsiyon, jel ve hamur oluĢturma gibi özellikleri ile gıdanın fonksiyonel niteliklerini etkileyen ve/veya belirleyen önemli bileĢenlerdir.
Proteinlerin fonksiyonel özellikleri, proteinlerin kompozisyonu ve üç boyutlu yapısı gibi iç faktörlerden, gıda ya da model sistemin kompozisyonu gibi çevresel faktörlerden ve izolasyon metodu ile koĢullarından etkilenmektedir (Kinsella, 1981; Fernandez-Quintela ve ark., 1997; Bilgi ve Çelik, 2004). Bu nedenlerle elde edildikleri kaynağa bağlı olarak proteinlerin fonksiyonel nitelikleri de farklılık gösterebilmektedir.
Gıda üretiminde kullanılan proteinler kabaca hayvansal kaynaklı (jelatin, kazein vb) ve bitkisel kaynaklı (soya, yer fıstığı vb) proteinler olmak üzere iki grupta toplanabilir. Birçok bitkisel kaynaklı protein, insan beslenmesinde düĢük maliyetli protein kaynağı olarak ilgi çekmektedir (Ogunwolu ve ark., 2009).
Yapılan kaynak taramalarında, mahlep çekirdeği içinin bileĢiminin belirlendiği birkaç çalıĢma dıĢında, mahlep çekirdeği içinden proteinlerin izole edilmesi ve izole edilen proteince zengin ürünlerin (konsantre veya izolat) fonksiyonel niteliklerinin belirlenmesini konu alan herhangi bir çalıĢmaya rastlanmamıĢtır. Bu nedenle gerçekleĢtirilen bu çalıĢmada mahlep çekirdeği içinden ekstrakte edilen proteince zengin ürünün bazı kimyasal ve fonksiyonel özellikleri belirlenmiĢ, diğer bitkisel ve hayvansal kaynaklı proteinler ile karĢılaĢtırılmıĢ ve gıda endüstrisinde kullanım olanakları incelenmiĢtir.
2. KAYNAK ÖZETLERİ
Mahlep çekirdeği içinin bileĢimini konu alan sınırlı sayıda kaynak bulunmaktadır. Mahlep çekirdeği içinden proteinlerin izole edilmesi ve fonksiyonel özelliklerinin belirlenmesi ile
ilgili ise herhangi bir literatüre rastlanılmamıĢtır. Bu nedenle konu ile doğrudan ilgili ulaĢılabilen kaynaklar sınırlı kalmıĢtır.
2.1. Mahlep Çekirdeğinin Özellikleri
Aydin ve ark. (2002) tarafından yapılan çalıĢmada, Tokat ilinde yetiĢtirilen mahlep çekirdeği içinin bazı fiziksel özellikleri incelenmiĢtir. ÇalıĢmada analiz edilen örneklerin %2,8-9,3 düzeyinde su içerdiği, bin tane ağırlığının 0,205-0,215 kg arasında değiĢtiği saptanmıĢtır. Mahlep çekirdeği yağının yağ asidi kompozisyonunu inceleyen Yücel (2005), mahlep yağında en çok bulunan yağ asitlerinin oleik asit (%35,4) ve linoleik asit (%28,5) olduğunu belirlemiĢtir. Mahlep çekirdeği yağının önemli düzeyde konjuge linolenik asitleri (%27,6) içerdiği ve konjuge linolenik asitlerin de %76,1’ini α-eleostearik asidin (9cis, 11trans, 13trans - 18:3) oluĢturduğu saptanmıĢtır. Ayrıca mahlep çekirdeğinin kurumaddesinde %18,5 düzeyinde yağ bulunduğu belirlenmiĢtir.
Mahlep çekirdeği üzerinde yapılan bir çalıĢmada, mahlep çekirdeğinin %6,2 su, %30,9 yağ, %28,0 protein, %2,1 kül, %18,7 lif ve %14,1 karbonhidrat içerdiği saptanmıĢtır. Mahlep çekirdeği yağında, oleik asit (%45) ve linoleik asitin (%47) en çok bulunan yağ asitleri olduğu belirlenmiĢtir. Aminoasit analizi sonucunda treonin, metiyonin+sistein, lizin ve izolösin aminoasitlerinin ilk dört yetersiz aminoasitler oldukları gözlenmiĢtir. Major elementlerden Ca, K ve Mg düzeylerinin sırasıyla 133,7, 204,2 ve 102,2 ppm; minor elementlerden Al, Pb Ni, Mn, Cu, Cr ve Co düzeylerinin ise düĢük olduğu saptanmıĢtır (Mariod ve ark., 2009).
Mardin ve yöresinde yetiĢen mahlep meyvesi çekirdeği içlerinin mineral madde bileĢimini inceleyen Meraler (2010), mahlep çekirdeği içinde mg/kg olarak 9,94 Al, 19,4 B, 6 795 Ca, 0,00963 Cd, 0,000000185 Co, 0,06707 Cr, 15,5 Cu, 59,5 Fe, 9 166 K, 2 907 Mg, 18,0 Mn, 0,65 Mo, 5,05 N, 45,6 Na, 1,3 Ni, 5 767 P, 0,215 Pb, 2 297 S ve 36,0 Zn bulunduğunu saptamıĢtır.
Proteinlerin fonksiyonel özellikleri gıda iĢleme ve ürün formülasyonlarında önem taĢımaktadır. Fonksiyonel özelliklerden bazıları su tutma, yağ bağlama, emülsiyon, köpük ve jel oluĢturmadır. Bu fonksiyonel özellikler moleküler yapı ve ağırlık gibi iç faktörlerden, proteinlerin izolasyon metodu, pH, iyonik güç ve diğer bileĢenlerin bulunması gibi birçok dıĢ faktörden etkilenmektedir. Fonksiyonel özelliklerden hangisinin daha önemli olduğu protein konsantresinin veya izolatının kullanılacağı gıda maddesine bağlı olarak değiĢim gösterir. Örneğin yüksek su ve yağ tutma kapasitesi sosis, ekmek ve keklerde arzu edilirken yüksek emülsifiye etme ve köpük oluĢturma özellikleri salata sosları, sosisler, çorbalar, Ģekerlemeler, donmuĢ tatlı ve kekler için tercih edilen özelliklerdir (Kinsella, 1979; Ahmedna ve ark., 1999).
Proteinlerin farklı koĢullardaki çözünürlüğü, emülsiyon oluĢturma, köpürme ve jelleĢme gibi diğer fonksiyonel özelliklerini önemli düzeyde etkilemesi nedeniyle proteinlerin önemli fonksiyonel niteliklerinden birisidir (Kinsella, 1982). Proteinler izoelektrik noktalarında en düĢük çözünürlüğü gösterirler. Çünkü bu noktada protein-protein interaksiyonu maksimum seviyede gerçekleĢir. Ġyonların konsantrasyonu ve çeĢidi proteinlerin su tutma kapasitesini, ĢiĢmesini ve çözünürlüğünü önemli derecede etkilemektedir (Cheftel ve ark., 1985; Saldamlı ve Temiz, 1998).
Proteinlerin su ile etkileĢimi, gıdaların lezzet ve yapısını belirlemesi nedeniyle gıda sistemlerinde çok önemlidir. Gıda proteinlerinin su tutma kapasitesini belirleyen proteine özgü faktörler aminoasit bileĢimi, üç boyutlu yapı ve yüzey hidrofobisite/polaritesidir. Ayrıca gıda iĢleme metotları da proteinlerin üç boyutlu yapısı ve hidrofobisitesi üzerinde önemli etkiye sahiptir (Barbut, 1999). Su tutma kapasitesi çorba, hamur ve fırıncılık ürünleri gibi viskozitesi yüksek gıda maddeleri için kritik bir fonksiyonel özelliktir. Bu ürünlerde proteinlerin çözünmeden suyu tutmaları ve bu sırada viskoziteyi arttırıp kıvam ve yapı kazandırmaları gerekmektedir (Seena ve Sridhar, 2005).
Proteinlerin yağ ile etkileĢimi, gıdaların lezzet ve yapısını belirlemesi nedeniyle gıda sistemlerinde çok önemlidir (Barbut, 1999). Gıda emülsiyonları termodinamik açıdan stabil olmayan su-yağ karıĢımlarıdır. Emülsiyonun oluĢması ve stabilitesi mayonez gibi gıda sistemlerinde çok önemlidir. Proteinler yüklü-yüksüz, polar-apolar aminoasitler içerebilmektedir. Bu aminoasitler proteinlere, hidrofilik ve hidrofobik özellikleri bir arada içeren yüzey aktif madde niteliği kazandırmaktadır. Bu sayede proteinler gıda sistemlerinde
hem yağ hem de su fazı ile etkileĢime girebilmektedir. Proteinlerin stabilize ettiği emülsiyonları pH, iyonik kuvvet, sıcaklık, düĢük molekül ağırlığına sahip yüzey aktif maddelerin varlığı, Ģekerler, yağ fazı ve protein tipi gibi faktörler de etkilemektedir. Bunun yanı sıra emülsiyon özelliğini proteinin çözünebilirliliği de oldukça etkileyebilmektedir. Ancak doğrusal bir iliĢkiden söz etmek olası değildir (Saldamlı ve Temiz, 1998). Çözünmez ve yüksek düzeyde apolar nitelik gösteren proteinlerin büyük miktarda yağ bağlayabildikleri görülmektedir. Küçük partikül boyutlu, düĢük yoğunluklu protein tozları yüksek yoğunluklu protein tozlarından daha fazla yağ tutarlar. Bitkisel protein konsantrelerinin karbonhidrat bileĢenlerinin yağ bağlamada önemli derecede bir payı bulunmamaktadır (Cheftel ve ark., 1985).
Köpük, emülsiyona benzer bir Ģekilde oluĢur. Köpükte su molekülleri apolar faz olan hava küreciklerinin etrafını sarmaktadır. Teorik olarak proteinlerin hem polar hem de apolar grupları bir arada içermesi onları iyi bir köpük oluĢturucu konumuna getirmektedir. Bu nitelikleri sayesinde proteinler su-hava ara yüzeyinde yer alarak hava küreciklerinin birleĢmesine engel olurlar. Proteinlerin köpürme özellikleri marshmallow, kekler, çırpılmıĢ kremalar gibi gıda maddeleri için önem taĢımaktadır (Kinsella, 1979). Bir molekülün iyi bir köpürme ajanı olabilmesi için temel gereksinimler Ģu Ģekildedir: (i) köpürme süresince hava/su ara yüzeyinde hızlı bir Ģekilde adsorblanmalı, (ii) hızlı yapısal değiĢikliğe uğrama ve ara yüzeyde yeniden düzenlenme yeteneğine sahip olmalı, (iii) moleküller arası interaksiyonlar yoluyla kohezif bir viskoelastik film oluĢturabilmeli (Makri ve ark., 2005). Moleküler arası kohezyon ve elastikiyet stabil köpük oluĢumu için önemli iken ikincil ve üçüncül yapılı esnek moleküller köpüklerin etkili bir Ģekilde oluĢumu için gerekli olmaktadır (Kinsella, 1981; Damodaran, 1990).
Protein jelleri, protein zincirlerinin kısmi etkileĢimi sonucunda suyun hapsedildiği üç boyutlu ağ yapısıdır. Proteinlerin jel oluĢturma yetenekleri salam, sosis gibi et ürünlerinde önem taĢımaktadır (Kinsella, 1979). Jel, sıvı-katı arasında yer alan bir fazdır. Proteinlerin jel oluĢturması yalnızca katı-viskoelastik jel oluĢumunda değil, aynı zamanda su tutma, partiküllerin bağlanması, köpük stabilizasyonu gibi proseslerde de kullanılmaktadır. Belirli koĢullar altında sıcaklık, enzim veya iki değerli katyonlarla ağ yapı oluĢumu sağlanabilir. Isıl iĢlem etkisi ile oluĢan jelleĢmede protein çözeltisi (sol haldeki protein) önce ”projel” haline dönüĢür. Projel viskoz bir sıvı olup bazı proteinlerde polimerizasyon görülür. Projel oluĢumu tersinmez olup ardından ikinci basamak olan ağ yapının oluĢması gelir ve protein jelasyona
uğrar. Ağ yapı oluĢmasındaki interaksiyonlar öncelikle hidrojen bağları, hidrofobik ve elektrostatik etkileĢimleri içermektedir (Saldamlı ve Temiz, 1998).
Mahlep çekirdeği içi proteinlerinin fonksiyonel özellikleri ile ilgili herhangi bir çalıĢmaya ulaĢılamadığı için bu kısımda diğer kaynaklardan sağlanan protein ürünlerinin üzerinde yapılan araĢtırmalardan bazılarının özetleri sunulmuĢtur.
Bezelyeden (Pisum sativum L. Var. Trapper) protein izolatı üretimi sonucunda yağsız bezelye unundaki proteinlerin %65’i protein izolatında tutulmuĢtur. Elde edilen bezelye protein izolatlarının özellikleri: %4,2 su, %90 protein, %4,4 yağ, %2,8 kül, L*: 62,8, a*: 5,0, b*: 22,1 Ģeklinde tespit edilmiĢtir. Elde edilen bezelye protein izolatlarının fonksiyonel özellikleri ise Ģu Ģekilde bulunmuĢtur: Emülsifikasyon %38, yağ tutma kapasitesi %122, su tutma kapasitesi %112, köpürme %143. Protein izolatının farklı pH değerlerindeki çözünürlük profili ise pH 3,0’te %56, pH 4,5’te %2, pH 7,0’de %87, pH 10,0’da %100 olarak gerçekleĢmiĢtir (Sumner ve ark., 1980).
Yağsız Ģeftali çekirdeği ununun yağ tutma ve emülsiyon oluĢturma özelliklerinin iyi, ancak su tutma ve köpürme özelliklerinin düĢük olduğu belirlenmiĢtir. Protein çözünürlülüğünün alkali ve asidik pH değerlerinde yüksek, pH 4,3’te ise minimum düzeyde bulunduğu saptanmıĢtır (Rahma ve Abd El Aal, 1988).
Fernandez-Quintela ve ark. (1997) tarafından yapılan çalıĢmada bezelye, bakla ve soya fasulyesinden protein izolatları hazırlanmıĢtır. Baklagiller 10 saat su içerisinde bekletildikten sonra kabukları elle soyulmuĢtur. Daha sonra örnekler 25ºC’de hava akımlı etüvde 1 gece bekletilerek kurutulmuĢtur. Kabukları uzaklaĢtırılan ve öğütülen baklagillerin yağı uzaklaĢtırılmıĢtır. Bu Ģekilde elde edilen unlar 1:5 (w/v) oranında suyla karıĢtırılarak süspansiyon haline getirildikten sonra pH’sı 1 N NaOH ile 9,0’a ayarlanmıĢtır. Bu Ģartlar altında 20 dakika oda sıcaklığında protein ekstraksiyonu gerçekleĢtirilen örneklerin çözünmeyen kısımları santrifüj ile uzaklaĢtırılmıĢtır. Elde edilen sıvı fazın pH’sı 1 N HCl ile 4,0’e ayarlanarak 20 dakika oda sıcaklığında proteinlerin izoelektrik çöktürmesi gerçekleĢtirilmiĢ ve proteinler santrifüj edilerek ayrılmıĢtır. Ayrılan kısım dondurarak kurutulmuĢtur. Protein izolatlarının fonksiyonel özellikleri Ģu Ģekilde belirlenmiĢtir: Bezelye protein izolatının su tutma kapasitesi 1,7 g su/g, yağ tutma kapasitesi 1,2 g yağ/g, köpürme kapasitesi %15, köpük stabilitesi %94 ve minimum jel oluĢturan konsantrasyonu %18; bakla
protein izolatının su tutma kapasitesi 1,8 g su/g, yağ tutma kapasitesi 1,6 g yağ/g, köpürme kapasitesi %15, köpük stabilitesi %77 ve minimum jel oluĢturan konsantrasyonu %14; soya fasulyesi protein izolatının su tutma kapasitesi 1,3 g su/g, yağ tutma kapasitesi 1,1 g yağ/g, köpürme kapasitesi %22, köpük stabilitesi %93 ve minimum jel oluĢturan konsantrasyonu %16 olarak bulunmuĢtur. Baklagil protein izolatlarının izoelektrik noktası pH 4,0 olarak bulunmuĢtur. Baklagil protein izolatlarının protein çözünürlüklerinin pH 4-6 arasında minimuma indiği, alkali pH değerlerinde ise önemli ölçüde arttığı bulunmuĢtur.
Nohut unlarından pH 12,0’de (izolat A) ve pH 10,5’de kararmayı engellemek için Na2SO3
varlığında (izolat B) ekstrakte edilen proteinler izoelektrik çöktürme (pH 4,3) ile geri kazanılmıĢtır. Ġzolat A elde edilirken prespitat su ile yıkanarak donuk kurutulmuĢtur. Ġzolat B’de ise prespitat pH’sı 4,3 olan su, etanol ve aseton ile yıkanarak oda sıcaklığında kurutulmuĢtur. Ġzolat B’nin hazırlanmasında pH değerinin düĢük olması ve sodyum sülfitin proteinlerle reaksiyona girebilecek okside polifenollerin oluĢumunu engellemesi rengin daha beyaz olmasını sağlamıĢtır. Ġzoelektrik çöktürme ile özellikle albüminler geri kazanılamadığından örneklerdeki proteinlerin toplam geri kazanım oranları %65,9 (izolat A) ve %62,1 (izolat B) Ģeklinde gerçekleĢmiĢtir. Ġzolat A ve izolat B’nin kimyasal bileĢimleri sırası ile %3,3 ve %5,5 su, %2,9 ve %4,3 kül, %78 ve %88,1 protein, %3,5 ve %1,1 yağ, %11,8 ve %3,3 karbonhidrat, <% 0,1 ve <%0,1 polifenol olarak bulunmuĢtur. Ġzolat B’de etanol ve aseton yıkaması nedeniyle lipit ve karbonhidrat düzeyleri düĢük bulunmuĢtur. Buna bağlı olarak da izolat B’nin protein içeriği (%88,1) daha yüksek çıkmıĢtır. Hekzan ile ekstraksiyon nedeniyle yağsız unda (%1,5 yağ) ve protein izolatlarında bir miktar polar karakterli yağ kalmıĢtır. Ġzolat A ve B’nin fonksiyonel özellikleri ise sırasıyla %26,6 ve %46,3 çözünürlük (pH 7,0’de), %343,7 ve %199,5 su tutma kapasitesi, %409,4 ve %125,7 yağ tutma kapasitesi Ģeklinde bulunmuĢtur (Sanchez-Vioque ve ark., 1999).
Sze-Tao ve ark. (2000) tarafından badem içi üzerinde yapılan çalıĢmada, öğütülmüĢ bademin yağı aseton ile uzaklaĢtırılmıĢ ve yağsız örnek -20°C’ de muhafaza edilmiĢtir. YağsızlaĢtırılmıĢ örnekler pH’sı 8,1 olan tris-HCl tamponunda 1:10 oranında çözülmüĢtür. Daha sonra 12 000 g’de 20 dakika süreyle 4°C’de santrifüj edilmiĢtir. Santrifüj edilen örneklerin sıvı kısmı saf suya karĢı diyaliz edildikten sonra donuk kurutulmuĢ ve -20°C’de muhafaza edilmiĢtir. Bu Ģekilde hazırlanan protein izolatının pH 5,0’de %1’lik konsantrasyonda köpük kapasitesi %120, 30. dakikadaki köpük stabilitesi %98 (makaledeki
veriler kullanılarak hesaplanmıĢtır), yağ tutma kapasitesi 2,926 g yağ/g, emülsiyon aktivite indeksi pH 5,0’de %0,1’lik konsantrasyonda 44,78 m2/g olarak belirlenmiĢtir.
Yağsız amaranth unundaki proteinlerin ekstraksiyonu pH 10,0’da gerçekleĢtirilmiĢtir. Santrifüj sonrası sıvı kısım alındıktan sonra katı kısım tekrar ekstraksiyona tabi tutulmuĢtur. Fakat çok az bir proteinin geri kazanılması ve sıvı fazın çok yükselmesinden dolayı ikinci ekstraksiyon iĢlemi uygun bulunmamıĢtır. Ekstraksiyon sıvısındaki proteinler pH 4,6’da çöktürülerek geri alınmıĢ ve sonra donuk kurutulmuĢtur. Bu proseste son ürünün protein içeriği %32 olarak gerçekleĢmiĢtir. Ekstraksiyon sıvısının diyaliz edilmesi sonucunda ise protein içeriği % 67 olan bir ürün elde edilmiĢtir. Ġzoelektrik çöktürme ve diyaliz iĢlemleri uygulanarak elde edilen protein konsantrelerinin kimyasal bileĢimleri sırasıyla %0,5 ve %0,7 yağ, %56 ve %24,4 polisakkarit, %0,3 ve %0,4 kül, %7 ve %7,5 su olarak bulunmuĢtur. Ġzoelektrik çöktürme ile hazırlanan örnekler baĢlıca globülin fraksiyonlarını içerirken albümin fraksiyonlarını içermemektedir. Ayrıca yüksek miktarda polisakkarit içermektedir. Fakat diyaliz metodu ile tüm protein fraksiyonları geri kazanılmıĢtır (Fidantsi ve Doxastakis, 2001). Moure ve ark. (2001), yaptıkları çalıĢmada kuĢburnu (Rosa rubiginosa) çekirdeklerinden iki farklı ekstraksiyon tekniği ile protein izolatı hazırlamıĢlardır. Su ile yapılan ekstraksiyonda partikül boyutunun < 0,5 mm olması durumunda, protein %83,5, çözünür Ģeker %7,85, su tutma kapasitesi 2,37 g/g, yağ tutma kapasitesi 11,06 g/g, minimum jel oluĢturan konsantrasyon %8, köpük kapasitesi %56, emülsiyon aktivite ve stabilite indeksi (%0,1’lik konsantrasyonda) sırasıyla %53,4 ve %58,4 bulunmuĢtur.
Webb ve ark. (2002), buğday protein izolatı (%88,4 protein), sodyum kazeinat (%92,3 protein), soya protein izolatı (%84,8 protein), peynir altı suyu protein izolatı (%93,4 protein) ile hazırladıkları %3’lük protein dispersiyonlarının fonksiyonel özelliklerini incelemiĢlerdir. Hazırlanan protein dispersiyonlarının pH değerleri sırasıyla 6,21, 6,68, 6,72 ve 6,00 olarak ölçülmüĢtür. Örneklerin bu pH değerlerindeki çözünürlükleri ise sırasıyla %79,67, %86,67, %60,67 ve %96,33 olarak gerçekleĢmiĢtir. Örneklerin diğer fonksiyonel özellikleri ise sırasıyla %600,3, %6 877,3, %91 ve %1 662 overrun (%3’lük konsantrasyonda), 155,0, 82,0, 115,9, 57,0 m2/g emülsiyon aktivite indeksi (%3’lük konsantrasyonda), 294, 25, 52 ve 28 saat emülsiyon stabilite indeksi (%3’lük konsantrasyonda) olarak bulunmuĢtur.
Mucuna fasulyesinden (Mucuna pruriens) hazırlanan protein konsantresinin protein içeriği %78,3 olarak bulunmuĢtur. Protein konsantrelerinin minimum çözünürlüğü %19,4 değeri ile pH 4,0’te, maksimum çözünürlülüğü ise %96 ile pH 12,0’de gerçekleĢmiĢtir. Köpük kapasitesinin konsantrasyona bağlı olduğu; %10 (w/v)’luk konsantrasyonda %94 ve %2 (w/v)’lik konsantrasyonda ise %58’lik bir değer aldığı gözlenmiĢtir. Protein konsantresinin minimum jel oluĢturan konsantrasyon (MJOK) değeri %8 (w/v) ile pH 4,0’te tespit edilmiĢtir. En yüksek MJOK değeri % 16 (w/v) ile pH 2,0’de sağlanmıĢtır. Örneklerin pH 7,0 ve 8,0’deki MJOK değerleri ise % 12 (w/v) olarak saptanmıĢtır (Adebowale ve Lawal, 2003).
Arpa protein konsantrelerinin hazırlanması ile ilgili bir çalıĢmada; iki farklı arpa örneğinden (Bülbül, Tokak), proteinlerin pH 11,2’de ekstraksiyonu ve pH 5,4’te izoelektrik çökmesi sağlanmıĢtır. Daha sonra çöken proteinler santrifüj (3 300 x g, 15 dakika) edilmiĢtir. Protein çökeltisi donuk kurutularak arpa protein konsantresi üretilmiĢtir. Bülbül ve Tokak protein konsantrelerinin protein içerikleri sırasıyla % 75,9 ve % 77,2 bulunmuĢtur (Bilgi ve Çelik, 2004).
Baklagiller üzerinde yapılan bir çalıĢmada, öğütülmüĢ örneklerden yağın uzaklaĢtırılmasında petrol eter (1:3 oranında) kullanılmıĢtır. Örneklerdeki proteinler pH 9,5’da ekstrakte edilmiĢ ve pH 4,5’te izoelektrik çöktürme yoluyla geri kazanılmıĢtır. Albüminlerin izoelektrik noktası daha yüksek (pI 6,5) olduğundan sıvı faz ile birlikte uzaklaĢtırılmıĢtır. Yapılan bu çalıĢmada izoelektrik çöktürme ile hazırlanan izolatlar yalnızca globülinleri içerdiğinden geri kazanım oranı ultrafiltrasyon tekniğine göre daha düĢük gerçekleĢmiĢtir (Makri ve ark., 2005).
Keten tohumu üzerinde yapılan bir araĢtırmada, öğütülen tohumlar 50ºC’de kurutma iĢlemine tabi tutulmuĢtur. Daha sonra yağ içeriği %2’den daha az olana kadar hekzan ile ekstraksiyon gerçekleĢtirilmiĢtir. Protein konsantresi üretiminde kullanılan yağsız unun protein içeriği %36 olarak bulunmuĢtur. Örneklerdeki proteinler alkali (pH 9-11) koĢullarda ekstrakte edildikten sonra pH 4,2-4,8 aralığında izoelektrik çöktürmeye tabi tutulmuĢtur. Ekstraksiyonun pH 11’de ve çöktürmenin ise pH 4,8’de yapılması ile hazırlanan protein konsantresinde geri kazanım oranı %26,5 bulunmuĢtur. Bu Ģekilde hazırlanan konsantrenin kimyasal bileĢimi %2,56 yağ, %6,62 kül, %2,44 çözünmez lif, %15,79 çözünür lif, %6,59 Ģeker ve %66,03 protein olarak saptanmıĢtır. Konsantrenin su ve yağ tutma kapasitesi sırasıyla 2,7 g/g (%253,5) ve 1,18 g/g (%150,25) olarak bulunmuĢtur. Köpük kapasitesi pH 6,0’da minimum
(%12) değeri alırken aynı pH’daki köpük stabilitesi %83,3 ile en yüksek değere ulaĢmıĢtır (Martinez-Flores ve ark., 2005).
Subagio (2006) yaptığı çalıĢmada, sümbül fasulyesinden (Lablab purpureus L.) hazırladığı protein izolatının kimyasal bileĢimini %89,8 kurumaddede protein, %2,15 yağ, %2,97 kül ve %4,60 niĢasta olarak bulmuĢtur. Protein izolatı hazırlanmasının son aĢamasında, çökeltinin %70’lik etanol ile yıkama iĢlemine tabi tutulması, elde edilen protein izolatının diğer bileĢenlerden (lipitlerin ve Ģekerlerin) arındırılmasında etkili olduğu belirlenmiĢtir. Protein izolatı üretiminde toplam protein geri kazanım oranı %37-40 arasında gerçekleĢmiĢtir. DüĢük geri kazanım değerinin, proteinin diğer bileĢenlerle kompleks oluĢturmasından ve ayrıca izoelektrik presipitasyon aĢamasında, ekstrakte olmuĢ proteinlerin %50’sinin geri kazanılamamıĢ olmasından kaynaklanabileceği bildirilmiĢtir. Ekstrakte olmuĢ proteinlerin %50’sinin izoelektrik presipitasyonla kaybolmasının sebebi, ekstraksiyon aĢamasındaki bekletme uygulaması sırasında proteinlerin hidrolize uğramasıdır. Ġzolatın renk değerleri L*: 90,32, a*: 1,76, b*: 3,36 olarak bulunmuĢtur. Ġzolatın beyazlığını bozan tohumdaki pigmentler hazırlama sürecinde elemine edilebilir veya Maillard reaksiyonuna yol açarak kahverengi renge neden olan Ģekerler uzaklaĢtırılabilir. Protein izolatının fonksiyonel özellikleri Ģu Ģekilde bulunmuĢtur: Köpük stabilitesi 2,3 dakika, yağ tutma kapasitesi %254, su tutma kapasitesi %321, emülsiyon aktivite ve stabilite indeksi (%0,1’lik konsantrasyonda) sırasıyla 534 m2
/g ve 2,7 saat.
Kaur ve Singh (2007), damıtık suda farklı yağsız nohut unlarından (%5 w/v) alkali Ģartlarda ekstrakte ettikleri proteinleri, pH 4,5’de çöktürerek nohut protein izolatları elde etmiĢlerdir. Bu yöntemde verimi arttırmak için ekstraksiyon 2 kez tekrarlanmıĢ ve elde edilen çökeltiler yıkanarak kurutulmuĢtur. Hekzan ile yapılan ekstraksiyonda lipitlerin tamamı uzaklaĢtırılamadığı için nohut unlarında %0,53-1,21 oranlarında yağ bulunmuĢtur. Protein izolatlarının kimyasal bileĢiminde %1,04-0,82 kül, %0,49-0,98 yağ ve %89,9-94,36 aralığında protein bulunduğu saptanmıĢtır. Renk değerleri L*: 58,63-61,33, a*: 1,88-2,21, b*: 22,46-24,95 olarak bulunmuĢtur. Nohut protein izolatlarının su tutma kapasiteleri 2,34-3,5 g/g, yağ tutma kapasiteleri 2,08-3,96 g/g, minimum jel oluĢturan konsantrasyon değerleri %14-18, köpük oluĢturma kapasiteleri (%3’lük konsantrasyonda) %30,4-44,3 ve köpük stabiliteleri (120. dakikadaki) %94,7 olarak saptanmıĢtır.
Cheng ve ark. (2009) çin çileği çekirdeğinden protein izolatı üretmek ve izolatın fonksiyonel özelliklerini belirlemek amacıyla gerçekleĢtirdikleri çalıĢmada, çekirdek içini öğütüp hekzan kullanarak Soxhlet düzeneğinde 9 saat süreyle yağını uzaklaĢtırmıĢlardır. Oda sıcaklığında kuruması sağlandıktan sonra tekrar öğütülüp 80 mesh’lik (0,178 mm gözenek boyutlu) elekten geçirilmiĢtir. Daha sonra yağsız un siyah polietilen torbada paketlenmiĢ ve 4°C’de muhafaza edilmiĢtir. Yağsız çin çileği çekirdeği ununun %5 (w/v)’lik çözeltisi hazırlanmıĢ ve 1 N NaOH ile çözeltinin pH değeri 10,0’a ayarlanmıĢtır. 30°C’de 1 saat süreyle karıĢtırıldıktan sonra 5 000 x g’de 20 dakika boyunca santrifüj edilmiĢtir. Kalıntı kısmına aynı iĢlemler uygulanarak ekstraksiyon iki kez daha tekrarlanmıĢtır. Üç ekstraksiyon sonunda elde edilen çözeltiler karıĢtırılıp pH değeri 1N HCl ile 4,0’e ayarlanmıĢtır. 5 000 x g’de 20 dakika süreyle santrifüj edilmiĢ ve çökelti kısmı donuk kurutulmuĢtur. Elde edilen protein izolatının bileĢimi ve fonksiyonel özellikleri belirlenmiĢtir. Ġzolatın kurumaddesinde %91,6 protein, %0,8 yağ ve %1,25 kül bulunduğu saptanmıĢtır. Minimum (%4,3) ve maksimum (%94,0) azot çözünürlülüğü sırasıyla pH 4,0 ve 12,0’de gözlenmiĢtir. Protein izolatının pH 6,0’daki köpük kapasitesi (%2’lik konsantrasyonda) %47,4, köpük stabilitesi (%2’lik konsantrasyonda) %56,0, emülsiyon kapasitesi (%2’lik konsantrasyonda) %48,7 ve emülsiyon stabilitesi (%2’lik konsantrasyonda) %84,0 olarak bulunmuĢtur. Minimum jel oluĢturan protein izolatı konsantrasyonu pH 6,0’da %12 (w/v) olarak belirlenmiĢtir. Ġzolatın su tutma kapasitesi 2,2±0,1 g/g, yağ tutma kapasitesi ise 1,8±0,2 g/g Ģeklinde saptanmıĢtır.
Yerfıstığı protein konsantresi üretiminde değiĢik yöntemlerin incelendiği bir çalıĢmada izoelektrik presipitasyon tekniği kullanılarak elde edilen protein konsantresinin fonksiyonel özellikleri Ģu Ģekilde bulunmuĢtur: Minimum protein çözünürlüğü (1/100) yaklaĢık %10 ile pH 4,5-5,0 aralığında saptanmıĢtır. Yağ ve su tutma kapasiteleri sırasıyla 2,0 mL yağ/g ve 1,15 g su/g, pH 6,0’daki emülsiyon stabilite indeksi (%0,5’lik konsantrasyonda) 19,18 dakika ve pH 7,4’deki köpük kapasitesi (%1’lik konsantrasyonda) %50 olarak belirlenmiĢtir (Wu ve ark., 2009).
Kaju fıstığından üretilen protein konsantresinin fonksiyonel niteliklerini inceleyen Ogunwolu ve ark. (2009), su tutma kapasitesini 1,74 mL su/g, yağ tutma kapasitesini 3,32 mL yağ/g, köpük kapasitesini (%0,1’lik konsantrasyonda) %40, köpük stabilitesini (%0,1’lik konsantrasyonda) %55, minimum jel oluĢturan konsantrasyonu %10 ve minimum protein çözünürlüğünü (%1’lik konsantrasyonda) pH 4,0’te %10 olarak belirlemiĢlerdir.
Kanola ile aynı familyada yer alan Lesquerella fendleri bitkisi tohumlarından elde edilen ısıl iĢlem uygulanmamıĢ yağsız unun fonksiyonel özellikleri Hojilla-Evangelista ve Evangelista (2009) tarafından incelenmiĢtir. Minimum protein çözünürlülüğü (%1’lik konsantrasyonda) pH 5,5-7,0 aralığında %25 olarak belirlenmiĢtir. pH 7,0’deki emülsiyon aktivite indeksi (0,1’lik konsantrasyonda) 93,4 m2/g, emülsiyon stabilite indeksi (0,1’lik konsantrasyonda)
25,1 dakika ve su tutma kapasitesi 8,05 g su/g olarak belirlenmiĢtir.
Sharma ve ark. (2010) kayısı çekirdeğinden ürettikleri protein konsantresinin ortalama %68,8 protein, %9,1 su, %6,4 yağ, %0,8 kül, %2,2 lif ve %12,7 toplam karbonhidrat içerdiğini tespit etmiĢlerdir. Kayısı çekirdeği protein konsantresinin su tutma kapasitesi 1,4 g su/g, yağ tutma kapasitesi 1,4 g yağ/g ve köpük kapasitesi %21 olarak belirlenmiĢtir.
Gedik (2011) tarafından yapılan çalıĢmada, viĢne çekirdeği içi proteinleri pH 10,0’da ekstrakte edilip pH 4,5’te çöktürülerek protein konsantresi hazırlanmıĢtır. Protein konsantresi %95,97±0,16 kurumadde, %3,31±0,17 kül, %2,94±0,36 karbonhidrat, %1,93±0,16, yağ ve %80,48±2,38 protein içermiĢtir. Su tutma kapasitesi, yağ tutma kapasitesi ve minimum jel oluĢturan konsantrasyonu sırasıyla %242±0,09, %173±0,17 ve %8 olarak bulunmuĢtur. Maksimum çözünürlük pH 12,0 (%92,96±1,66) ve minimum çözünürlük ise pH 5,0’te (%12,41±1,23) gözlenmiĢtir. Emülsiyon aktivite indeksi 38,91±2,50 m2
/g, emülsiyon stabilite indeksi ise 37,49±2,41 dakika olarak belirlenmiĢtir. Protein konsantresinin köpük kapasitesi %35,00±3,54 ve köpük stabilitesi ise %71,80±7,25 (30 dakika sonra) olarak saptanmıĢtır. Sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi yağsız viĢne çekirdeği içi unundaki protein fraksiyonlarının hemen hemen tamamının protein konsantresinde tutulduğunu göstermiĢtir.
3. MATERYAL ve YÖNTEM
3.1. Materyal
AraĢtırma 2010-2011 yılları arasında GaziosmanpaĢa Üniversitesi, Mühendislik ve Doğa Bilimleri Fakültesi, Gıda Mühendisliği Bölümünde yürütülmüĢtür. AraĢtırmada kullanılan mahlep çekirdeği içleri Tokat’ın Niksar ilçesinde bulunan ticari bir iĢletmeden temin edilmiĢtir. Örnekler kullanılıncaya kadar plastik torbalarda 4ºC’de muhafaza edilmiĢtir.
3.2.1. Mahlep Çekirdeği İçinden Yağın Uzaklaştırılması
Mahlep çekirdek içleri kahve değirmeni (Bosch MKM 600, Munich, Almanya) aracılığı ile parçalanarak un haline getirilmiĢtir. Öğütülen örnekler, hekzan ilavesinden (1:6 oranında) sonra oda sıcaklığında (22-24ºC) bir saat manyetik karıĢtırıcı ile karıĢtırılmıĢtır. Süre sonunda karıĢım kaba filtre kağıdından süzülerek hekzan ayrılmıĢtır. Bu iĢlem en az dört kez tekrarlanarak yağın uzaklaĢması sağlanmıĢtır. Hekzanın tamamen uzaklaĢması için bir gece çeker ocak içerisinde bekletilen örnekler sızdırmaz Ģekilde kapanabilen cam kavanozlara aktarılmıĢ ve kullanılıncaya kadar oda sıcaklığında muhafaza edilmiĢtir.
3.2.2. Mahlep Çekirdeği İçi Protein Konsantresinin (MÇİPK) Hazırlanması
Yağı alınmıĢ mahlep çekirdeği içi örneklerinden proteinlerin izole edilmesinde, katı/sıvı oranı 1:20 Ģeklinde kullanılmıĢtır. Saf su içerisinde dispers edilen yağsız unun pH değeri dijital pH metre (inoLab WTW pH 720, Weilheim, Almanya) yardımıyla 2 N NaOH kullanılarak 10,0’a ayarlanmıĢtır. Daha sonra karıĢım 150 dakika süreyle manyetik karıĢtırıcıda (Heidolph MR 3001, Schwabach, Almanya) karıĢtırılmıĢtır. Bu süre içerisinde karıĢımın pH değeri her 30 dakikada bir kontrol edilerek sabit tutulmuĢtur. KarıĢım 3 000 x g’de 15 dakika santrifüj edilerek çökelti uzaklaĢtırılmıĢtır. Elde edilen sıvı kısmın pH’sı 2 N HCl ile 4,5’e ayarlandıktan sonra 15 dakika dinlendirilmiĢtir. KarıĢım 4 000 x g’de 10 dakika santrifüj edilerek çökelti kısmı toplanmıĢ ve bir miktar saf su ile dispers edilerek pH değeri 7,0’ye ayarlanmıĢtır. Bu Ģekilde elde edilen ekstrakt 50ºC’lik hava akımlı etüvde (Memmert 100-800, Schwabach, Almanya) 12-18 saat süreyle kurutulmuĢ ve kullanılıncaya kadar -18ºC’de depolanmıĢtır.
3.2.3. Mahlep Çekirdeği İçi ve Ürünlerinin Fiziksel ve Kimyasal Nitelikleri 3.2.3.1. Mahlep Çekirdeği İçi ve Ürünlerinin Kurumadde Analizleri
ÖğütülmüĢ yağlı mahlep çekirdeği içi, yağsız mahlep çekirdeği içi ve protein konsantresinin kurumadde oranları gravimetrik yöntemle belirlenmiĢtir (AOAC, 1997). Darası alınmıĢ paslanmaz çelik kaplara (G2) yaklaĢık ikiĢer gram örnek (G1) tartılarak 105±2ºC’lik hava
sonunda kaplar desikatöre alınıp 1 saat süre ile soğuması sağlandıktan sonra ağırlıkları (G3)
belirlenmiĢtir. Bu iĢleme sabit tartım elde edilinceye kadar devam edilerek yüzde (%) kurumadde miktarları aĢağıdaki formül kullanılarak hesaplanmıĢtır.
% Kurumadde = [(G3 - G2) / G1] x 100
3.2.3.2. Mahlep Çekirdeği İçi ve Ürünlerinin Yağ Analizleri
ÖğütülmüĢ yağlı mahlep çekirdeği içi, yağsız mahlep çekirdeği içi ve protein konsantresinin yağ miktarının belirlenmesi için 1-2 gram örnek (G3) darası alınmıĢ kartuĢlar içerisine
tartılarak ağız kısımları yapıĢtırılmıĢtır. KartuĢ içeriği ile birlikte 105±2 ºC’lik etüvde kurutulduktan sonra toplam ağırlık (G2) kaydedilmiĢtir. Kurutulan örnekler, yağ ekstraksiyon
cihazının (Ankom XT10 Extractor, NJ, Amerika BirleĢik Devletleri) haznesine konularak dietil eter ile 95ºC’de 60-90 dakika süre ile ekstraksiyona bırakılmıĢtır. Ekstraksiyonu tamamlanan örnekler tekrar etüve alınarak 105±2ºC’de kalıntı çözücüden arındırılmıĢtır. Etüvden alınan örnekler desikatörde soğutulduktan sonra tartılıp (G1) aĢağıdaki formül ile
yüzde (%) yağ miktarları hesaplanmıĢtır. % Yağ = [(G2-G1) / G3] x 100
3.2.3.3. Mahlep Çekirdeği İçi ve Ürünlerinin Toplam Karbonhidrat Analizleri
Örneklerin toplam karbonhidrat içerikleri, fenol sülfürik asit metoduna göre belirlenmiĢtir. Örneklerden 75 mg alınıp üzerine 5 mL HCl (2,5 N’lik) ilave edildikten sonra vortex (Velp Scientifica ZX3, Usmate, Ġtalya) ile 10 saniye karıĢtırılmıĢtır. KarıĢtırılan örnekler 95ºC’lik su banyosunda 3 saat süreyle (Memmert WB 22, Schutzart, Almanya) hidrolizasyona bırakılmıĢtır. Su banyosundan alınan örnekler 5 dakika içerisinde 1ºC’ye soğutulmuĢtur. Soğutulan örnekler üzerine 750 μL NaOH (%40 w/w) eklenip vortex ile 5 defa onar saniye süreyle karıĢtırılmıĢ ve hacimleri saf su ile 250 mL’ye tamamlanmıĢtır. Bu Ģekilde hazırlanan örneklerden bir tüp içerisine 600 μL alınmıĢ ve üzerine 600 μL fenol (%5 w/w) ilave edildikten sonra vortex ile 30 saniye karıĢtırılmıĢtır. KarıĢım üzerine 3,0 mL konsantre sülfürik asit (H2SO4) eklenerek tekrar 30 saniye karıĢtırılmıĢtır. KarıĢtırılan örnekler 80ºC’de
30 dakika ısıtılmıĢ ve musluk suyuyla soğutulduktan sonra spektrofotometre (Perkin Elmer UV/Vis spectrometer, Lambda EZ 201, CA, Amerika BirleĢik Devletleri) ile 490 nm’deki
absorbans değerleri okunmuĢtur. Standart kurvenin çizilmesinde farklı konsantrasyonlarda glikoz içeren çözeltiler (0-100 μg/mL) kullanılmıĢtır (Geater ve Fehr, 2000).
3.2.3.4. Mahlep Çekirdeği İçi ve Ürünlerinin Protein Analizleri
Azot içeriklerinin belirlenmesinde Mikro Kjeldahl yöntemi kullanılmıĢtır (AOAC, 1997). Kjeldahl tüplerine 50-200 mg örnek tartılmıĢ ve üzerine 2 g K2SO4, 150 μL %5’lik CuSO4 ve
5 mL konsantre H2SO4 ilave edildikten sonra yaĢ yakma iĢlemine maruz bırakılmıĢtır.
Örnekler Kjeldahl yakma ünitesinde (Gerhardt KB8, Königswinter, Almanya) yaklaĢık 2-4 saat süreyle 400ºC’de berraklaĢıncaya kadar yakılmıĢtır. Yakılan örnekler soğuduktan sonra üzerine 20 mL saf su ilave edilip destilasyon ünitesine yerleĢtirilmiĢtir. Destilasyon ünitesinde örnek üzerine 15-20 mL %40’lık (w/w) NaOH ilave edilmiĢ ve destilatın 25 mL %4’lük borik asit çözeltisi içerisinde toplanması sağlanmıĢtır. Destilasyon sonrası borik asit içerisinde toplanan destilat 0,0200 N HCl ile titre edilerek aĢağıda verilen formül yardımıyla %azot değerleri bulunmuĢtur. Azot oranlarının 6,25 faktörü ile çarpılması ile de örneklerin protein içerikleri hesaplanmıĢtır.
V1: Titrasyonda örnek için harcanan HCl miktarı (mL)
V0: ġahit için harcanan HCl miktarı (mL)
N: Titrasyonda kullanılan HCl’in normalitesi
3.2.3.5. Mahlep Çekirdeği İçi Protein Konsantresinin Kül Analizi
Kül miktarının belirlenmesi AOAC (1997)’de belirtilen Ģekilde örneklerin kül fırınında (Protherm PLF 115 M, Ankara, Türkiye) yakılmasıyla gerçekleĢtirilmiĢtir. Darası alınmıĢ porselen kroze içerisine (G2) 1-3 gram örnek (G1) tartılmıĢ ve krozeler, suyu uzaklaĢtırmak
için çeker ocağın içinde, elektrikli ısıtıcı üzerinde 30 dakika ön yakma iĢlemine maruz bırakılmıĢtır. Sonra örnekler kül fırınına alınarak sıcaklık kademeli bir Ģekilde 550±15ºC’ye çıkartılmıĢtır. Bu sıcaklıkta beyaz renkte kül elde edilinceye kadar (yaklaĢık 8 saat) yakılmıĢtır. Yakılan örnekler desikatöre alınarak soğutulmuĢ ve sonra tartılarak ağırlıkları (G3) kaydedilmiĢtir. Yüzde kül oranları aĢağıdaki formüle göre hesaplanmıĢtır.
% Kül = [(G3 - G2) / G1] x 100
(V1 - V0) x 0,014 x N
% Azot = x 100 Örnek miktarı (g)
3.2.3.6. Mahlep Çekirdeği İçi ve Ürünlerinin Renk Değerlerinin Ölçümü
Örneklerin L* (açıklık-koyuluk), a* (kırmızı-yeĢil) ve b* (sarı-mavi) değerleri (Hunter sistemi) kolorimetre (Minolta, CR-300, NJ, Amerika BirleĢik Devletleri) kullanılarak ölçülmüĢtür. Renk ölçüm cihazının kalibrasyonu standart beyaz plaka konularak yapılmıĢtır (L*: 96,97, a*: 0,16, b*: 1,86). Cam petri içerisine 1 cm kalınlığında örnek yayılmıĢ ve üç farklı noktadan yapılan ölçümlerin ortalaması kullanılmıĢtır (Singh ve ark., 2005). Ayrıca yağlı mahlep çekirdeği içine göre toplam renk değiĢimi (ΔE*) aĢağıdaki eĢitlik kullanılarak hesaplanmıĢtır.
ΔE*= [(L*
- L0)2 +(a* - a0)2 +(b* - b0)2]1/2
L0: Yağlı mahlep çekirdeği içinin L* değeri
a0: Yağlı mahlep çekirdeği içinin a* değeri
b0: Yağlı mahlep çekirdeği içinin b* değeri
3.2.3.7. Yağsız Mahlep Çekirdeği İçi ve Mahlep Çekirdeği İçi Protein Konsantresinin SDS-PAGE ile İncelenmesi
Örneklerdeki proteinlerin moleküler ağırlık profilleri Laemmli (1970) metoduna göre SDS-PAGE kullanılarak belirlenmiĢtir. Örnekler 2 mL örnek tamponunda [3,8 mL saf su, 1 mL 0,5 M Tris-HCl pH 6,8 tamponu, 0,80 mL gliserol, 1,6 mL %10’luk (w/v) SDS, 0,8 mL 2-β-merkaptaetanol, 0,4 mL %0,05 (w/v) bromfenol mavisi] 2 saat süre ile karıĢtırılarak çözündürülmüĢtür. Daha sonra örnekler 95ºC’lik su banyosunda 5 dakika süreyle ısıtılmıĢtır. Örnek tamponundaki protein konsantrasyonu 5 mg protein/mL olacak Ģekilde ayarlanmıĢtır. Katı parçacık içeren örneklerden santrifüj edildikten sonra 10 µL (0,05 mg protein) alınıp jele yüklenmiĢtir. Ayırma ve yığın jelinin akrilamid konsantrasyonu sırasıyla %12 (11,73 mL su, 8,75 mL 1,5 M Tris-HCl pH 8,8 tamponu, 0,35 mL %10’luk (w/v) SDS, 14 mL %30’luk akrilamid/Bis (30 g akrilamid + 0,8 g bis/100 mL), 175 µL %10’luk amonyum persülfat ve 17,5 µL TEMED) ve %4 (6,1 mL su, 2,5 mL 0,5 M Tris-HCl pH 6,8 tamponu, 100 µL %10’luk (w/v) SDS, 1,3 mL %30’luk akrilamid/Bis, 50 µL %10’luk amonyum persülfat ve 10 µL TEMED) olacak Ģekilde 1 mm kalınlığında dökülmüĢtür. Elektroforez için pH 8,3, 5X elektrot tamponu (37,5 g tris, 180 g glisin, 12,5 g SDS saf su içerisinde çözündürülüp hacim 2,5 L’ye tamamlanmıĢtır) hazırlanarak kullanım esnasında 1:4 oranında saf su ile seyreltilmiĢtir. Elektroforezde örnekler 25 mA (yığma jeli) ve 35 mA (ayırma jeli) sabit
akımında (Consort 1200V-500 mA E815, Turnhout, Belçika) yaklaĢık 5 saat süreyle yürütülmüĢtür. Elektroforez jelindeki proteinler Commassie brilliant blue G250 (%0,1 Commassie brilliant blue G250, %40 metanol, %10 asetik asit, %50 su) ile boyanmıĢ ve %10’luk asetik asit ile boya uzaklaĢtırma iĢlemi gerçekleĢtirilmiĢtir. Moleküler ağırlık standardı olarak (Sigma katalog numarası S8445, MO, Amerika BirleĢik Devletleri) miyosin (200 000 Da) beta galaktozidaz (116 000 Da), fosforilaz b (97 000 Da), bovin serum albümini (66 000 Da), glutamik dehidrogenaz (55 000 Da), ovalbumin (45 000 Da), gliseraldehit-3-fosfat dehidrogenaz (36 000 Da), karbonik anhidraz (29 000 Da), tripsinojen (24 000 Da), tripsin inhibitörü (20 000 Da), α-laktalbumin (14 200 Da) ve aprotinin (6 500 Da) kullanılmıĢtır.
3.2.4. Mahlep Çekirdeği İçi Protein Konsantresinin Fonksiyonel Özelliklerinin Belirlenmesi
3.2.4.1. Protein Çözünürlüğünün Belirlenmesi
Örneklerdeki proteinlerin çözünürlük profilleri Beuchat ve ark. (1975) tarafından belirtilen yönteme göre saptanmıĢtır. %5 (w/v)’lik protein dispersiyonları hazırlanarak pH değerleri 1,0-12,0 aralığında olacak Ģekilde ayarlanmıĢtır (1 N NaOH veya 1 N HCl kullanılarak). pH değerleri kontrol edilerek oda sıcaklığında 90 dakika süreyle karıĢtırıldıktan sonra 4 000 x g’de 30 dakika süreyle santrifüj edilmiĢtir. Sıvı fazın protein içeriği mikro Kjeldahl yöntemi (AOAC, 1997) ile belirlenerek çözünürlük aĢağıdaki formül yardımıyla hesaplanmıĢtır.
SP
Protein Çözünürlüğü (%) = ——— X 100
TP
SP: Sıvı fazdaki çözünür protein oranı (g/100 mL) TP: BaĢlangıç protein oranı (g/100 mL)
3.2.4.2. Su ve Yağ Tutma Kapasitesinin Belirlenmesi
Protein örneklerinin su ve yağ tutma kapasiteleri Naczk ve ark. (1985) tarafından bildirilen yönteme göre saptanmıĢtır. Su tutma kapasitesi için 0,5 g örnek üzerine 4 mL saf su ilave edilmiĢtir (pH 6,7). Hazırlanan karıĢımlar toplam 70 dakika süre ile her 10 dakikada bir 30 saniye baget yardımıyla karıĢtırılmıĢtır. Bu iĢlem sonunda örnekler 25ºC ve 2 000 x g’de 15 dakika süreyle santrifüj edilmiĢtir. Santrifüj edilen örneklerin sıvı fazı uzaklaĢtırıldıktan sonra
tüplerin ağız kısmı zeminle 45’lik açı oluĢturacak Ģekilde yerleĢtirilerek 10 dakika boyunca sıvı fazın süzülmesi sağlanmıĢtır. Sıvı fazdan arındırılmıĢ olan katı kısım tartılarak ağırlık artıĢı belirlenmiĢtir. Sonuçlar g su/g örnek veya örnek ağırlığındaki artıĢ yüzde olarak ifade edilmiĢtir.
Yağ tutma kapasitesinin belirlenmesinde ise 0,5 g örnek üzerine 3 mL ticari ayçiçeği yağı (Ona) ilave edilmiĢtir. Hazırlanan karıĢım toplam 30 dakika süre ile her 5 dakikada bir 30 saniye baget kullanılarak karıĢtırılmıĢtır. KarıĢtırılan örnekler 25ºC’de 1 600 x g’de 25 dakika süreyle santrifüj edilmiĢtir. Santrifüj edilen örneklerin sıvı fazı uzaklaĢtırıldıktan sonra tüpler ters çevrilerek 5 dakika boyunca sıvı fazın süzülmesi sağlanmıĢtır. Sıvı fazdan arındırılmıĢ olan katı kısım tartılarak ağırlık artıĢı belirlenmiĢtir. Referans olarak sodyum kazeinat kullanılmıĢtır. Sonuçlar g yağ/g örnek veya örnek ağırlığındaki artıĢ yüzde olarak ifade edilmiĢtir.
3.2.4.3. Köpük Kapasitesi ve Stabilitesinin Belirlenmesi
Örneklerin oluĢturduğu köpüklerin kapasitesi ve stabilitesi çırpma yöntemiyle belirlenmiĢtir. 0,5 g örnek üzerine saf su ilave edilerek hacmi 40 mL’ye tamamlanmıĢtır (%1,25 w/v). Hazırlanan dispersiyon (pH 7,0) homojenizatör (Ultra Turrax, T18 basic, IKA-Werke GmbH & Co. KG, Staufen, Almanya) ile 20 000 devir/dakika’da 2 dakika süreyle karıĢtırılarak köpük oluĢumu sağlanmıĢtır. Örnekler bekletilmeden 100 mL’lik silindire alınıp toplam hacim ve sıvı fazın hacmi kaydedilmiĢtir. Örneklerin köpük kapasiteleri aĢağıdaki formülle hesaplanmıĢtır (Moure ve ark., 2001).
V1: Homejenizasyon sonrası toplam hacim
V2: Homojenizasyon öncesi toplam hacim
Örneklerin köpük stabilitesi ise 0, 10, 30, 60, 90 ve 120 dakika zaman aralıklarında köpük hacmindeki değiĢim ölçülerek aĢağıdaki eĢitlik ile hesaplanmıĢtır (Moure ve ark., 2001).
Vt: t zamanındaki köpük hacmi
Vk: Homojenizasyon sonrası 0. dakikadaki köpük hacmi
V1 – V2 Köpük Kapasitesi (%) = x 100 V2 Vt Köpük Stabilitesi (%) = x 100 Vk
3.2.4.4. Emülsiyon Aktivite İndeksi (EAİ) ve Emülsiyon Stabilite İndeksinin (ESİ) Belirlenmesi
Örneklerin EAĠ ve ESĠ değerleri Pearce ve Kinsella (1978) tarafından belirtilen metoda göre saptanmıĢtır. %0,1 (w/v)’lik 20 mL protein dispersiyonu (pH 7,0) ve 6,6 mL ayçiçeği yağı (Ona) emülsiyon oluĢturmak amacıyla homojenizatör (Ultra Turrax, T18 basic, IKA-Werke GmbH & Co. KG, Staufen, Almanya) ile 20 000 devir/dakikada 1 dakika süreyle homojenize edilmiĢtir. Emülsiyonun alt kısmından (sıvı faz) alınan 50 μL örnek 5 mL’ye %0,1’lik (w/v) sodyum dedosil sülfat (SDS) ile seyreltilmiĢtir (1:100 dilisyon). KarıĢımın 500 nm’deki absorbansı okunmuĢ (0. dakikadaki) ve bu absorbans değeri kullanılarak aĢağıdaki formül yardımıyla EAĠ değeri hesaplanmıĢtır.
A0: 0. dakikadaki absorbans
N: Seyreltme faktörü (100)
c: Protein dispersiyonun protein konsantrasyonu (0,001 g/ml) φ: Yağın hacimsel fraksiyonu (6,6/26,6 = 0,248)
Örneklerin ESĠ değerleri, emülsiyonun 10 dakika bekletilmesinden sonra alt kısmından (sıvı faz) alınan 50 μL örneğin 5 mL’ye %0,1’lik (w/v) SDS ile seyreltilmesi ve absorbansının 500 nm’de okunması (10. dakikadaki) sonucunda elde edilen verilerden aĢağıdaki formül yardımıyla hesaplanmıĢtır.
ESĠ: Dakika
A0 : 0. dakikadaki absorbans
A10: Homojenizasyon iĢleminden 10 dakika sonra okunan absorbans
t: Emülsiyonun bekleme süresi (10 dakika)
3.2.4.5. Minimum Jel Oluşturan Konsantrasyonun (MJOK) Belirlenmesi 2 x 2,303 x A0 x N EAĠ (m2/g) = c x φ x 10000 A0 x t ESĠ = A0-A10
Örneklerin jelleĢme özellikleri Coffmann ve Garcia (1977) tarafından belirtilen yönteme göre ölçülmüĢtür. Sonuçlar minimum jel oluĢturan konsantrasyon olarak ifade edilmiĢtir. 2-14 g/100 mL konsantrasyon aralığında tüplere hazırlanan örnek dispersiyonları (pH 7,0) 1 saat süre ile kaynar su banyosunda bekletilmiĢtir. Örnekler su banyosundan alınıp bekletilmeden 4ºC’ye soğutulmuĢ ve 2 saat süre ile bu sıcaklıkta bekletilmiĢtir. Daha sonra örnek tüpleri ters çevrilerek jelleĢme düzeyi gözlenmiĢtir. JelleĢme gösteren tüpler + olarak iĢaretlenmiĢtir. Her bir örnek için üç tüp hazırlanmıĢ ve sonuçlar aĢağıda belirtildiği Ģekilde değerlendirilmiĢtir.
+ + + veya + + - jelleĢme var - - - veya - - + jelleĢme yok
3.2.5. İstatistiksel Değerlendirme
Üç tekerrürlü (n=3) olarak elde edilen analiz sonuçlarının ortalamaları alınarak standart sapmaları ile birlikte verilmiĢtir. Elde edilen verilerin istatistiksel değerlendirilmesi ve karĢılaĢtırılması Minitab programında (Minitab release 12.1, Minitab Inc., 1998) one-way ANOVA ve Tukey analizleri kullanılarak yapılmıĢtır.
4. BULGULAR ve TARTIŞMA
4.1. Protein Konsantresinin Hazırlanması
Proteinlerin maksimum düzeyde ekstraksiyonunu sağlamak amacıyla mahlep çekirdek içleri kahve değirmeniyle 1 mm’den küçük parçalar halinde öğütülerek yüzey alanı arttırılmıĢtır. Öğütülen örneklerdeki enzimatik aktiviteyi durdurmak için beklemeksizin hekzan ilavesiyle yağ ekstraksiyonu aĢamasına geçilmiĢtir. Hekzan gıda sanayinde yaygın olarak kullanılan bir çözgendir. Ancak hekzan kullanımı arzu edilmeyen durumların ortaya çıkmasına da neden olabilmektedir. Kullanım sırasında atmosfere yayılan hekzan, diğer kirleticiler ile reaksiyona girerek ozon gibi okside edici maddelerin üretimine sebep olabilmektedir. Buna ilave olarak, serbest yağ asitleri, mumlar ve sabunlaĢmayan maddeler tamamıyla uzaklaĢtırılamamaktadır (Hanmoungjai ve ark., 2002).
Yağca zengin materyallerden proteinlerin izolasyonu aĢamasında, protein-yağ etkileĢimleri sonucunda emülsiyon oluĢabilmekte ve bu nedenle proteinlerin izolasyonu imkansız hale gelebilmektedir (Cheftel ve ark., 1985). Bu duruma yol açmamak amacıyla yağın uzaklaĢtırılması gerekmektedir. Öğütülen mahlep çekirdek içleri, hekzan ilavesinden (1:6 oranında) sonra oda sıcaklığında (22-24ºC) bir saat manyetik karıĢtırıcı ile karıĢtırılmıĢtır. Süre sonunda karıĢım kaba filtre kağıdından süzülerek hekzan ayrılmıĢtır. Bu iĢlem en az dört kez tekrarlanarak yağın uzaklaĢması sağlanmıĢtır.
Ekstraksiyon sonucunda çekirdek içinin yağ oranı %32,47±1,74’den %1,59±0,10’a düĢürülmüĢtür (Çizelge 4.1). Yağın uzaklaĢtırılma oranı diğer çalıĢmalara benzer Ģekilde gerçekleĢmiĢtir. Protein geri kazanımını önemli ölçüde etkileyen baĢlangıç materyallerinin yağ içerikleri, baklada %2,02 (Fernandez-Quintela ve ark., 1997), sümbül fasulyesinde %1,10 (Subagio, 2006) ve yağsız nohut unlarında %0,53-1,21 (Kaur ve Singh, 2007) Ģeklinde bulunmuĢtur. Ancak Gedik (2011) tarafından yağsız viĢne çekirdeği içi için bildirilen %9’luk yağ oranı bizim sonucumuzdan oldukça yüksektir.
Çizelge 4.1. Mahlep çekirdeği içinin yağ ekstraksiyon öncesi ve sonrası bileĢimi. Değerler üç tekerrürün ortalaması olup standart sapması ile birlikte verilmiĢtir
Bileşen (%) Yağlı Mahlep Çekirdeği İçi
Yağsız Mahlep Çekirdeği İçi
Kurumadde 94,32±0,76 92,46±0,50
Protein 31,28±0,43 41,48±0,27
Yağ 32,47±1,74 1,59±0,10
4.1.2. Ekstraksiyon pH’sının Belirlenmesi
Proteinlerin izolasyonunda alkali koĢullarda ekstraksiyon ve sonrasında izoelektrik presipitasyon (Bilgi ve Çelik, 2004), ultrafiltrasyon, ters osmoz (Sumner ve ark., 1980), organik çözgenlerle ve nötral tuzlarla ekstraksiyon gibi değiĢik teknikler kullanılmaktadır. Alkali koĢullarda ekstraksiyon ve izoelektrik presipitasyon tekniğinde kullanılan kimyasalların ucuzluğu ve gerekli cihazların basitliği nedeniyle membran tekniklerinden daha avantajlı olduğu bildirilmektedir (Sanchez-Vioque ve ark., 1999).
AraĢtırmada mahlep çekirdeği içi proteinlerinin ekstraksiyonu için en uygun pH değerini belirlemek amacıyla yağı uzaklaĢtırılmıĢ örnekler %5 (w/v) oranında saf su içerisinde çözündürülüp pH değerleri 1,0–12,0 aralığına getirilmiĢtir. Sonra örnekler 150 dakika süre ile oda sıcaklığında çalkalama iĢlemine tabi tutulmuĢlar ve santrifüj edilerek toplam proteinin ne kadarının sıvı fazda bulunduğu belirlenmiĢtir. Elde edilen veriler ekstrakte edilen % proteine karĢılık pH grafiği formatında ġekil 4.1’de sunulmuĢtur.
Yağsız mahlep çekirdeği içi unlarından proteinlerin ekstraksiyonu 1,0 (88,770,44), 11,0 (87,401,07) ve 12,0 (90,602,48) pH’da yüksek düzeylerde gerçekleĢmiĢ ve bu pH değerlerinde elde edilen ekstraksiyon oranları arasında istatistiksel olarak önemli bir farklılık gözlenmemiĢtir (p>0,05). AĢırı asidik veya alkali Ģartlardaki yüksek ekstraksiyon oranının sebebi bu koĢullarda protein moleküllerinin birbirlerini iterek hidrofobik etkileĢimin azalmasına yol açan net pozitif veya negatif yüke sahip olmalarıdır (Cheftel ve ark., 1985; Adebowale ve Lawal, 2003).
40 50 60 70 80 90 100 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 pH Pr o te in Ek str ak si yo n O ra n ı (% )
ġekil 4.1. Yağsız mahlep çekirdeği içi örneklerinden proteinlerin ekstraksiyonuna pH’nın etkisi
Minimum düzeyde (%37,42±5,07) protein ekstraksiyonu pH 4,0’te gerçekleĢmiĢtir. Ġstatistiksel olarak pH 3,0, 5,0, 6,0 ve 7,0’deki ekstraksiyon oranları ile arasında önemli bir farklılık bulunmamakla birlikte (p>0,05) minimum protein ekstraksiyonu bu pH’da (4,0) gerçekleĢtiğinden mahlep çekirdeği içi proteinlerinin izoelektrik noktalarının yaklaĢık 4,0 olduğu kabul edilmiĢtir.
ġeftali çekirdeği (pH 4,3) (Rahma ve Abd El Aal, 1988), bezelye, bakla ve soya (pH 4,0) (Fernandez-Quintela ve ark., 1997) ve viĢne çekirdeği içi (pH 4,5) (Gedik, 2011) gibi ürünlerde de minimum ekstraksiyon benzer pH değerlerinde sağlanmıĢtır. Bu pH değerinde ekstrakte edilen %41,67±0,08 oranındaki protein, temel olarak izoelektrik noktası daha yüksek olan albüminlerden (Makri ve ark., 2005) ve ekstraksiyon aĢamasında gerçekleĢen hidroliz sonucu açığa çıkan küçük polipeptidlerden kaynaklanabilmektedir (Subagio, 2006). Çok yüksek ve düĢük pH değerlerinin proteinlerin yapısına zarar vermesi nedeniyle ekstraksiyon pH’sının belirlenmesinde tek baĢına en yüksek ekstraksiyon oranı değil, ılımlı koĢullarda sağlanan en yüksek ekstraksiyon oranı dikkate alınmaktadır. ÇalıĢmamızda en yüksek protein ekstraksiyon oranı pH 12,0’de (90,6±2,48) elde edilmesine karĢın, bahsedilen sakıncalar nedeniyle ekstraksiyon için uygun pH değeri 10,0 olarak belirlenmiĢtir. Bu pH değerinde %77,6±4,28 protein ekstraksiyonu sağlanmıĢtır.
4.1.3. Protein Konsantresinin Hazırlanması ve Bileşimi
Ekstraksiyon pH’sının belirlenmesi amacıyla yapılan çalıĢmalar sonucunda en uygun değerin 10,0 olduğu tespit edilmiĢtir. Ekstraksiyon tek aĢamada, oda sıcaklığında 150 dakika süreyle gerçekleĢtirilmiĢtir. Ekstraksiyon iĢlemi tamamlandıktan sonra, örnekler 3 000 x g’de 15 dakika süreyle santrifüj edilerek çökelti uzaklaĢtırılmıĢtır. Sıvı kısımdaki proteinlerin geri kazanılması amacıyla minimum çözünürlüğün olduğu pH 4,0 yerine çökelme iĢleminin daha kolay gerçekleĢtiği pH 4,5 değeri kullanılarak izoelektrik çöktürme sağlanmıĢtır. KarıĢım 4 000 x g’de 10 dakika santrifüj edilerek çökelti kısmı toplanmıĢ ve çökeltinin pH’sı 7,0’ye ayarlandıktan sonra 50°C’lik hava akımlı etüvde 12-18 saat süreyle kurutulmuĢtur. Kurutulan ürünün %73.11±0,80 (kurumaddesinde %78,84) protein içerdiği tespit edilmiĢtir (Çizelge 4.2). Kurumaddedeki protein oranı %90’ın altında kaldığı için elde edilen ürün protein konsantresi olarak kabul edilmiĢtir.
Çizelge 4.2. Protein konsantresinin bazı kimyasal nitelikleri. Değerler üç tekerrürün ortalaması olup standart sapması ile birlikte verilmiĢtir
Bileşen (%) Protein Konsantresi
Kurumadde 92,73±0,65
Protein 73.11±0,80
Yağ 1,42±0,09
Toplam karbonhidrat 6,02±0,35
Kül 6,29±0,12
Çizelgeden de izlenebileceği gibi mahlep çekirdeği içi protein konsantresi %92,73±0,65 oranında kurumadde içermektedir. Bu değer diğer araĢtırmacılar tarafından bildirilen sonuçlarla benzerlik göstermektedir. Bezelye protein izolatında %95,8 (Sumner ve ark., 1980), alkali ekstraksiyon ve izoelektrik çöktürme ile elde edilen Bülbül ve Tokak arpa protein konsantrelerinde sırasıyla %94,9 ve %92,7 (Bilgi ve Çelik, 2004) ve viĢne çekirdeği içi protein konsantresinde %95,97 (Gedik, 2011) kurumadde oranına ulaĢılmıĢtır.
Mahlep çekirdeği içi protein konsantresinin %1,42±0,09 oranında yağ içerdiği tespit edilmiĢtir. Diğer araĢtırmalarda elde edilen protein konsantreleri ve izolatlarının yağ içerikleri ise Ģu Ģekildedir: Soya protein izolatlarında %1,46 (Fernandez-Quintela ve ark., 1997), çökeltisi su ile yıkanan nohut izolatlarında %3,5, çökeltisi su, etanol ve aseton ile yıkanan nohut protein izolatlarında % 1,1 (Sanchez-Vioque ve ark., 1999), amaranth izoelektrik
