Taipei Medical University Institutional Repository:Item 987654321/4231
47
0
0
Tam metin
(2) 2.
(3) 致謝 兩年的碩士班生涯以來，不管是在研究或是做人處事方面，都讓 我獲得了許多的寶貴經驗。首先要感謝的是指導教授—柯文昌和林建 煌老師。老師平時的處事態度積極認真、實事求是，亦以身作則指導 我們，為我們實驗上的疑難解惑之外，無形中更使我們學到了許多做 事的正確態度。 另外非常感謝子容學姐和政穎學長，無私且詳盡的教導我們實驗 上的技巧；更感謝同學超賢和莉玟這兩年來的互相協助及包容，讓我 得以順利完成實驗。 感謝家人對我付出的溫暖關懷和體諒；此外，感謝隆俊的鼓勵和 適時給予建議，讓我無後顧之憂，得以完成這兩年的學業。 特別感謝醫技系的陳健民老師、聖豪學長及大學部學弟妹慧美、 偉呈、孟榕、怡蓁、雅筑在實驗上的幫助，以及口試委員們提出了相 當寶貴的意見，才讓這本論文更加的充實且完備。 所有在研究過程中曾不吝於提供幫助的人事物，謝謝你們!. 沈欣儀 于 2008.7.23. 3.
(4) 目錄 標題…………………………………………………………………1 圖表簡介……………………………………………………………5 縮寫…………………………………………………………………6 中文摘要……………………………………………………………8 英文摘要……………………………………………………………10 壹、緒論……………………………………………………………13 貳、實驗材料與方法………………………………………………18 参、結果……………………………………………………………27 肆、討論……………………………………………………………33 伍、參考文獻………………………………………………………37 圖表…………………………………………………………………41 圖解…………………………………………………………………47. 4.
(5) 圖表簡介. 圖 1. Chemical structures of ayanin (A) and biochanin A (B) ………..41. 圖 2. Effects of ayanin and biochanin A on Penh (A, D), inflammatory cells (B, E), and cytokines (C, F) in sensitized and challenged mice…...42 圖 3. Effects of ayanin and biochanin A on total IgE (A, B, E, F), and OVA-specific IgE (C, D, G, H) in serum (A,C, E, G) and BALF (B, D, F, H) of sensitized and challenged mice…………………………………...43 圖 4. Effects of ayanin (A) and biochanin A (B) on total IgG2a in serum of sensitized and challenged mice………………………………………44 圖 5. Effects of subcutaneously administered ayanin (A) and biochanin A (B) on the duration of xylazine/ketamine-induced anesthesia in mice ………………………………………………………………….…45 圖 6.. Effects of ayanin (A) and biochanin A (B) on cumulative. ovalbumin (OVA)-induced contractions in isolated sensitized guinea pig trachealis………………………………………………………………...46 圖解 1. …………………………………………………………………..47. 5.
(6) 縮寫 AHR. airway hyperresponsiveness. ANOVA. analysis of variance. BALF. bronchoalveolar lavage fluid. BSA. bovine serum albumin. cAMP. cyclic 3’, 5’-adenosine monophosphate. cGMP. cyclic 3’, 5’-guanosine monophosphate. COPD. chronic obstructive pulmonary disease. DMSO. dimethyl sulfoxide. EAR. early phase response. EPO. eosinophilic peroxidase. ECP. eosinophil cationic protein. FBS. fetal bovine serum. HARBS. high affinity rolipram binding sites. IgE. immunoglobulin E. IgG2a. immunoglobulin G2a. IFN -γ. interferon-γ. IL. interleukin. LAR. late phase response. LARBS. low affinity rolipram binding sites. LTs. leukotrienes. MBP. major basic protein. MCh. methacholine. OVA. ovalbumin 6.
(7) PAF. platelet-activating factor. PBS. phosphate-buffered saline. PDE. phosphodiesterase. PEI. polyethyleneimine. Penh. enhanced pause. SAv-HRP. streptavidin-horseradish peroxidase conjugate. TMB. 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine. TNF-α. tumor necrosis factor-α. 7.
(8) 中文摘要 Ayanin (quercetin-3,4′,7-O-trimethylether)為 quercetin 之甲基衍生 物 。 報 告 指 出 它 對 phosphodiesterase (PDE) 有 抑 制 作 用 ， 它 的 PDE4H/PDE4L 比值大於 19； Biochanin A 為紅花苜蓿(red clover， Trifolium pretense L.)之主成分，除了有植物性雌激素的功能外，亦有 抑制 PDE 的作用，它的 PDE4H/PDE4L 比值則大於 35。因此，我們有 興趣探討它們是否具有抗氣喘的作用。 在雌性的 BALB/c 小鼠因注射卵蛋白 (ovalbumin, OVA)引起的過 敏性氣喘(allergic asthma) 模式，顯示 ayanin (30~100 µg/kg, p.o.)可以 有意義且劑量依存性地減少小白鼠由 MCh (25~50 mg/ml)所增加的 enhanced pause (Penh)值，亦可有意義地減少肺泡灌洗液(BALF)中總發 炎細胞、巨噬細胞、淋巴球、嗜中性白血球和嗜酸性白血球的數目。 Ayanin 10~100 µmol/kg 有意義地減少 BALF 中 IL-2、IL-4、IL-5 及 TNF-α 的含量，但少劑量(10 µmol/kg)不能有意義地減少 TNF-α 的含 量，是唯一例外。Ayanin 高劑量(100 µmol/kg)會增加 IFN-γ 的含量。 Ayanin 30~100 µmol/kg 有 意 義 地 減 少 血 清 和 BALF 中 total 及 OVA-specific IgE 的含量，但它會增加血清中 total IgG2a 的含量。皮 下注射 ayanin 300 µmol/kg 並不會縮短小白鼠因 xylazine (10 mg/kg)/ ketamine (70 mg/kg)引起的麻醉時間。. 8.
(9) 口服給予 Biochanin A 100 µmol/kg 可以有意義地減少小白鼠由 MCh (25~50 mg/ml)所增加的 enhanced pause (Penh)值，亦可有意義地 減少肺泡灌洗液中總發炎細胞、嗜中性白血球和嗜酸性白血球的數 目。細胞激素方面，biochanin A 在 30~100 µmol/kg 能有意義地減少 BALF 中 IL-2、IL-4、IL-5 及 TNF-α 的含量，但 30 µmol/kg 不能有意 義地減少 IL-2 及 TNF-α 的含量，是例外。 Biochanin A 30~100 µmol/kg 都不會減少 IFN-γ 含量。Biochanin A 100 µmol/kg，但非 30 µmol/kg ， 能有意義地減少血清和 BALF 中 total 及 OVA-specific IgE 的含量。 高劑量(100 µmol/kg)的 biochanin A 能有意義地使 total IgG2a 含量上 升。皮下注射 biochanin A 300 µmol/kg 時不會縮短小白鼠因 xylazine (10 mg/kg)/ ketamine (70 mg/kg)引起的麻醉時間。 Ayanin 及 biochanin A 高濃度 (100 µM) 時均可抑制卵蛋白累加 所引起之離體天竺鼠氣管的收縮。 結論，Ayanin 與 biochanin A 具有防止氣道過度反應及抗發炎的 作用，亦有可能安定肥胖細胞，使其避免去顆粒化 (degranulation)。 兩者均不縮短麻醉時間，也顯示嘔吐等副作用可能不明顯，故均具有 抗氣喘發展的潛力。. 9.
(10) Abstract Ayanin (quercetin-3,4′,7-O-trimethylether) is a methyl derivative of quercetin, it have been reported to inhibit phosphodiesterase (PDE) activities. The PDE4H/PDE4L ratio of ayanin was reported to be more than 19. Biochanin A, known as one of phytoestrogens, is the main ingredient of the red clover (Trifolium pretense L.), and has been reported to inhibit PDE activities. The PDE4H/PDE4L ratio of biochanin A was reported to be more than 35. Therefore we are interested in their mechanisms of anti-asthmatic effect. In the OVA-induced allergic asthma model of BALB/c mice, ayanin (30~100 µmol/kg, p.o.) revealed it dose-dependently and significantly attenuated the enhance pause (Penh) value induced by MCh (25~50 mg/ml). Ayanin (30~100 µmol/kg, p.o.) also significantly reduced total inflammatory. cells,. macrophages,. lymphocytes,. neutrophils. and. eosinophils. Ayanin (10~100 µmol/kg, p.o.) significantly attenuated the release of IL-2、IL-4, IL-5 and TNF-α, with the exception that ayanin (10 µmol/kg) did not attenuate the release of TNF-α. Ayanin at 100 µmol/kg significantly increased the release of IFN-γ. Ayanin (30~100 µmol/kg, p.o.) also significantly reduced total and OVA-specific IgE levels in the. 10.
(11) BALF and the serum, but increased IgG2a level in the serum. In the present results, ayanin (300 µmol/kg, s.c.) did not significantly shorten duration of anesthesia induced by xylazine (10 mg/kg)/ketamine (70 mg/kg). Biochanin A (100 µmol/ml, p.o.) significantly attenuated the enhanced pause (Penh) value induced by MCh (25~50 mg/ml), and also significantly reduced total inflammatory cells, neutrophils and eosinophils. Biochanin A (30~100 µmol/kg p.o.) significantly attenuated the release of IL-2, IL-4, IL-5, and TNF-α, with the exceptions that it at 30 µmol/kg did not significantly inhibit the release of IL-2 and TNF-α. Biochanin A 100, but not 30 µmol/kg, p.o., significantly reduced total and OVA-specific IgE levels in the BALF and the serum, but increased IgG2a levels in the serum. In the present results, Biochanin A (300 µmol/kg s.c.) did not significantly shorten the duration of anesthesia induced by xylazine (10 mg/kg)/ketamine (70 mg/kg). Ayanin (100 µM) and biochanin A (100 µM) significantly relaxed the baseline tension of isolated sensitized guinea pig trachealis, and also significantly suppressed cumulative OVA (10~100 µg/ml)–induced contractions.. 11.
(12) In conclusion, ayanin and biochanin A possessed anti-inflammatory effects and prevented airway hyperresponsiveness. Furthermore, they may prevent from degranulation of mast cells. Therefore, they have the potential in treating asthma.. 12.
(13) 壹、緒論 氣喘是一種慢性呼吸道發炎的現象。 許多過敏原如塵螨、花粉、 黴菌、氣溫變化、運動、刺激性化學物品或一些藥物，都可造成氣喘 的發作或惡化。氣喘的症狀包括間歇性的呼吸困難、喘鳴、胸悶以及 咳嗽，當遇到各種內因性或外因性的刺激時，會造成不同程度的支氣 管壁水腫、黏液分泌增加、氣道過度反應(airway hyperresponsiveness, AHR) 、氣道阻塞 (airway obstruction) 以及發炎細胞如肥胖細胞 (mast cells)、淋巴球 (lymphocytes, CD4+ T cells)、嗜中性白血球和嗜 酸性白血球的滲入。 氣喘的發展可分為兩個時期：早期反應 (early phase response, EAR)和晚期反應 (late phase response, LAR)。早期的反應通常在與過 敏原接觸的 5~60 分鐘內發生，主要原因為過敏原和附在肥胖細胞上 的 IgE 結合後， 造成肥胖細胞的去顆粒化 (degranulation)，釋放一些 發炎介質 (inflammatory mediators)，如白三烯素 (cysteinyl-LTs)、組 織胺、 血小板活化因子 (platelet-activating factor, PAF) 和胰蛋白 (tryptase) 等等，使氣管平滑肌收縮，造成急性的氣道阻塞 (airway obstruction) [1]。晚期反應則在之後的 4 ~24 小時發生， 發炎細胞不 斷釋放發炎物質造成持續性的肺部發炎及氣道過度反應 (AHR) [2]。氣道過度反應的產生主要是活化的嗜酸性白血球穿透到氣道釋. 13.
(14) 放嗜酸性過氧化酶 (eosinophilic peroxidase, EPO)、嗜酸性陽性蛋白 (eosinophilic cationic protein, ECP) 、 嗜酸性白血球顆粒中的神經毒 素 (eosinophil derived neurotoxin,. EDN) 和主要鹼性蛋白 (major. basic protein, MBP)，這些物質會破壞氣道的上皮細胞，進而造成支氣 管收縮 [3]。 目前治療氣喘的藥物主要分為氣管擴張劑和抗發炎藥物。氣管擴 張 劑 主 要 如 吸 入 性 β2 受 體 致 效 劑 、 吸 入 性 抗 膽 鹼 藥 物 (anti-cholinergics) 和茶鹼 (theophylline)。短效型的吸入性 β2 受體致 效劑主要用於緩解急性症狀，長效型的吸入性 β2 受體致效劑則是輔 助抗發炎藥物以達到氣喘的控制；抗發炎藥物能夠降低氣管發炎反 應、減低氣管黏膜的水腫、防止肺功能惡化和預防運動前的氣喘發 作，包括類固醇 (corticosteroids) 、白三烯素阻斷劑 (anti-LTs)等。由 於類固醇良好的抗發炎作用，所以被廣泛使用，但長期使用容易造成 人體某些不良副作用，如月亮臉、水牛肩、成長遲緩、骨質疏鬆及腎 上腺萎縮等等. [4] ； 而 茶 鹼 為 非 選 擇 性 的 磷 酸 二 酯 酶. (phosphodiesterase, PDE) 抑制劑，主要能造成支氣管擴張的作用，但 其安全範圍狹窄，也可能產生胃腸不適、心悸、血壓下降、和失眠等 副作用 [5]；短效的 β2 受體致效劑常會造成 down regulation，而使受 體數目減少。. 14.
(15) 磷酸二酯酶 (phosphodiesterase, PDE) 的主要作用是分解 cAMP 或/和 cGMP，目前已知可依對抑制劑的敏感度、胺基酸序列、受質專 一性及生化特性等分為 11 種亞型。較為人知的亞型如磷酸二酯酶亞 型五(PDE5)，存在於陰莖海綿體組織中，抑制 PDE5 能夠治療勃起障 礙[6]。磷酸二酯酶亞型四(PDE4)主要存在於支氣管平滑肌、發炎細 胞和免疫細胞中，因此抑制 PDE4 可造成氣管平滑肌鬆弛，抑制發炎 細胞的活性和化學趨化作用，可治療氣喘和慢性阻塞性肺病(COPD) [7]。 選擇性的磷酸二酯酶亞型四 (PDE4)抑制劑雖然兼具有支氣管擴 張及抗發炎的效果，但是由於會產生一些副作用，如噁心、嘔吐和胃 酸分泌增加等，使它的發展和使用還未能普遍 [8]。選擇性的 PDE4 抑制劑 rolipram 對 PDE4 有兩種不同的結合點，分別為 rolipram 高親 和 力 結 合 點 (high-affinity rolipram binding sites, HARBS) ， 簡 稱 PDE4H，和 rolipram 低親和力結合點 (low-affinity rolipram binding sites, LARBS)，簡稱 PDE4L。HARBS 主要存在於大腦，包括海馬迴 (hippocampus)、額前腦皮質 (frontal cortex) 和嗅球 (olfactory bulb)， 副作用的產生可能是與腦部 HARBS 結合所造成 [9]，其 EC50 表示取 代結合腦部顆粒 HARBS 一半之[3H]-rolipram 所需的藥物濃度； LARBS 主要存在於肺部和支氣管的周邊組織， 和抗發炎和支氣管擴. 15.
(16) 張有關 [10]，此結合能力與抑制受質 cAMP 被 PDE4 分解的能力相 當 [11]，故結合 LARBS 之 EC50 值可視為藥物抑制 cAMP 被分解一 半所需之 IC50 值 [12]。目前大多以 PDE4H/PDE4L 之比值作為本類藥 物的治療指數(therapeutic index) [13]。. 類黃酮化合物 (flavonoids)廣泛的存在於蔬果植物中，被證實具 有許多生物活性如抗發炎、抗氧化等等，其中許多亦具有磷酸二酯酶 (phosphodiesterase, PDE) 抑制劑的功能 [14, 15]。Flavonoids依構造的 不同可有許多大分類，如flavonols、flavones 、flavanones、catechines、 anthocyanidins、isoflavones。其中來自槐花萃取物的化合物rutin，經 動 物 體 內 glucosidase 的 水 解 後 會 去 除 第 3 位 上 的 rutinose 形 成 quercetin，而ayanin (quercetin-3,4′,7-O-trimethylether)為一種quercetin 的甲基衍生物 [16]。由本實驗室之前的研究結果指出， ayanin的 PDE4H/PDE4L 之比值大於19 [17]，因此ayanin在作為抗氣喘藥物方 面，應有研究的價值。然而它抗氣喘及抗發炎的作用仍需進一步證 實，為本篇論文主要探討的目標。. 紅花苜蓿 (red clover，Trifolium pretense L.)是一種二年生的豆科 草本植物，其莖、葉中富含有植物性雌激素(phytoestrogens)，包括 biochanin A、genistein與daidzein等，同屬isoflavones類。紅花苜蓿在. 16.
(17) 歐美為常見的保健食品，主要被用來減緩婦女更年期的不適及骨質疏 鬆症的保健。其中含量最多的biochanin A (5,7-dihydroxy-4'-methoxyisoflavone)，除了有植物性雌激素的作用外，也具有磷酸二酯酶抑制 劑 的 功 能 [18] 。 Biochanin A 對 PDE 4 的 IC50 為 8.5 µM ， 其 PDE4H/PDE4L比值大於35 [17]，對抗氣喘的作用似乎更具潛力，值得 探討。. 17.
(18) 貳、實驗材料與方法 一、藥品和動物 Ayanin 是由本實驗室在陳繼明教授的指導下依 Kupchan and Bauerschmidt 描述的方法合成的 [19]；Biochanin A、bovine serum albumin (BSA)、dl-dithiothreitol (DTT)、dimethylsulfoxide (DMSO)、 ethylene glycol (EG)、indomethacin、methacholine (MCh)、ovalbumin (OVA) 、 polyethyleneimine solution 、 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine substrate (TMB) solution 等購自 Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA。 Freund’s complete adjuvants 購自 Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA。 Dextrose 購自 Nihon Shiyaku, Osaka, Japan。 Pentobarbital sodium solution 購自 Abbott lab., North Chicago, IL, USA。Mouse IgE、 IgG2a ELISA Set 及 Mouse Th1/Th2 Cytokine CBA kits 購自 BD Bioscience Pharmingen, San Diego, CA, USA。其他試劑 ammonium chloride、calcium chloride、di-potassium hydrogen phosphate、95% ethyl alcohol、magnesium chloride、magnesium sulfate、potassium chloride、 potassium hydrogen carbonate、sodium azide、sodium chloride、sodium hydrogen carbonate 等皆為試藥級。 Biochanin A 溶解在 alcohol : DMSO (1 : 1, v/v)，ayanin 溶於 18.
(19) DMSO，indomethacin 溶於 95% ethyl alcohol，其餘試劑皆溶在蒸餾水 中。所有藥物最終濃度以 molarity 表示，溶劑最終濃度小於或等於 0.1%，並不影響實驗結果。 所有實驗在符合台北醫學大學動物實驗規範下，使用國科會動物 中心體重約 500-600 g 的雄性天竺鼠 (Dunkin-Hartley)，及 8-12 週的 雌性小白鼠 (BALB/c)。在餵食期間自由給予無卵蛋白 (OVA-free) 的 水和飼料。. 二、氣道過度反應的活體實驗 此實驗的動物是雌性小白鼠 (BALB/c)，約 8~12 週齡。首先在第 0、14 天，腹腔注射內含有 20 µg 卵蛋白 OVA 及 2.25 mg aluminum hydroxide 溶於 100 µl saline (0.9% sadium chloride)的乳化物，每隻給 予 0.1 ml 使其敏感化 (sensitization) 。於第 21 天則以 1％ OVA 與 Freund's complete adjuvant 1：1 等比例混合，以腹腔注射每隻給予 0.1 ml 加強其免疫反應。接著於第 28、29 及 30 天以 1% OVA 氣化噴霧 的方式讓小白鼠吸入 30 分鐘，此為卵蛋白激釁 (OVA challenge)。 各組動物於第 30 天給予 1% OVA 氣化噴霧 (OVA challenge) 前 2 小時、激釁後 6 小時及 24 小時，分別口服 (30~100 µmol/kg) 給予測. 19.
(20) 試藥物 ayanin 或其溶劑(DMSO)； biochanin A 或其溶劑(DMSO： alcohol = 1 : 1)，兩者均以 Tween 20 助溶，其比例為藥物或溶劑：Tween 20：生理食鹽水 = 1：1：8 (v/v)，每 10 克體重給予 0.1 ml 的容量。 在第 32 天 (OVA challenge 後 48 小時)監測各組動物的氣道過度反應 (AHR)。 測定的方式是將清醒的小白鼠不受拘束放入整體體積描述器 (Buxco﹐Troy﹐NY﹐USA)，利用氣壓體積描述法來分析 [20]，並且 以 Penh 值 (圖解 1) 來評估結果。 首先記錄未給予噴霧前的 Penh 值 3 分鐘當作 baseline，之後依序給予 saline、MCh 6.25、12.5、25、50 mg/ml 氣化噴霧三分鐘，每次噴霧後記錄 Penh 值的變化 3 分鐘，以 saline 的 Penh 值當做基準值 100% (即 1 倍)，給予 MCh 後皆用其倍數表示，以 上 Penh 值之計算全部利用電腦軟體 (Gould/PONEMAH´s Acquisition & Analysis Software packages, Valley view, OH, USA) 自動分析。. 三、肺泡灌洗液(BALF)及細胞激素(cytokines)之測定 在測完氣道過度反應後，接著用 pentobarbital sodium solution (50 mg/kg, i.p.) 將小白鼠麻醉，由氣管插管注入 1 ml 溫的 PBS 沖洗三 次，此為肺泡灌洗液。接下來以 630 g、7 分鐘離心，上清液用來測. 20.
(21) 定細胞激素，下層沉澱物加入 120 µl 之 ACK 崩解緩衝液 (1.658 g NH4Cl、0.2 g KHCO3 及 1.44 mg EDTA disodium salt 溶於 200 ml 的蒸 餾水中)，使紅血球崩解，剩下發炎白血球，用 hemacytometer (Hausser Sci.﹐Horsham﹐PA﹐USA) 計算發炎細胞總數。而發炎細胞的種類 則使用細胞抹片離心機 (Shandon Southern Instruments, Sewelicky, PA, USA)，用 170 g、3 分鐘離心，使其固定於抺片上，接下來用 Liu’s A (每公升的 methanol 中含有：1.8 g eosin Y、0.5 g methylene blue) 染 30 秒，然後用 Liu’s B (每公升的水中含有：12.5 g KH2PO4、25.2 g Na2HPO4·12H2O、1.4 g methylene blue、1.4 g azur I) 染 1 分鐘，在光 學顯微鏡下客觀地分析各類發炎細胞數，包含巨噬白血球、嗜酸性白 血球、嗜中性白血球及淋巴球，總共為 100 個。 細胞激素的測定是用. mouse Th1/Th2 cytokine CBA kit. (Pharmingen, San Diego﹐CA﹐USA)，取 200 µl 欲分析的標準品及樣 品和 25 µl 的 cytokine capture antibody (表面具有 IL-2、IL-4、IL-5、 IFN-γ、TNF-α 特異性的抗體) 混合，再加入 PE detection reagent 25 µl 避光反應二小時，加入 1 ml wash buffer，用 200 g 離心 5 分鐘，倒掉 上清液，再加入 300 µl wash buffer，以 FACS Calibur flow cytometer (Becton Dickinson﹐San Jose﹐CA﹐USA) 測定其螢光值，最後以 BD CBA Software (Pharmingen﹐San Diego﹐CA﹐USA) 分析 cytokine 的 21.
(22) 種類及含量，包含 IL-2、IL-4、IL-5、TNF-α 及 IFN-γ，可測得最小 值為 1 pg/ml。. 四、Total IgE 及 OVA-Specific IgE 之含量測定 上述小白鼠抽取肺泡灌洗液後，採血，靜置後離心 (4 ℃, 3700g, 10 分鐘)，以取得血清樣本，適當稀釋後與肺泡灌洗之上清液分別測 定 total 及 OVA-specific IgE 含量，Total IgE 之測定是根據 Mouse IgE ELISA Set (Pharmingen﹐San Diego﹐CA﹐USA) 原廠建議的方法，在 每個 well 加入 100 µl 的 capture antibody (anti-mouse IgE,用 coating buffer 稀釋，pH 9.5)，放置於 4 ℃。隔天，先將 well 中的液體甩掉， 每個 well 用 300 µl 的 wash buffer (含 0.05% tween 20 的 PBS) 洗三 次，在最後一次 wash 後，將 plate 倒置並輕敲於吸水紙上以移除多餘 的液體。接著加入 200 µl 的 assay diluent (含 10% FBS 的 PBS)，於室 溫下反應一小時後，以 wash buffer 洗三次，接著將標準品 (1.5625~50 ng/ml) 及樣本溶液各取 100 µl 加入每個 well，反應二小時後，以 wash buffer 洗 五 次 ， 每 個 well 中 再 加 入 100 µl 的 working detector (biotinylated anti-mouse IgE plus SAv-HRP)，於室溫下一小時後，以 wash buffer 洗七次 (每次須等待 0.5~1 min)，之後，在避光的環境下 每個 well 加入 100 µl 的 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) substrate 22.
(23) solution 並在室溫下避光反應半小時後，再加入 50 µl 的 stop solution (2N H2SO4)。最後，用 ELISA reader (波長 450 nm) ，測定每個 well 中的 optical density (O.D.)，與標準品比較，即可算出 total IgE 的含 量。OVA-specific IgE 含量測定如上，但是在 coating 時，每個 well 則是以 OVA (20 µg/ml) 取代 capture antibody ，而以 unchallenged mice 合併之血清或肺泡灌洗上清液當作 1 個 arbitrary unit (A.U.)，其 他樣本的含量，皆以 A.U.表示之 [21]。. 五、Total IgG2a 之含量測定 根據 mouse IgG2a ELISA set (Pharmingen﹐San Diego﹐CA﹐USA) 原廠建議的方法，先將 100 µl 的 capture antibody ( anti-mouse IgG2a， 用 coating buffer 稀釋) 加入 well 中， 用 parafilm 封起來並在 4 ℃的 環境下隔夜，第二天早上，先將 well 中的液體甩掉，在每個 well 加 入 wash buffer (含有 0.05% tween 20 的 PBS) 300 µl 沖洗(甩掉)三次， 在最後一次 wash 後， 將 plate 倒置並輕敲於吸水紙上以移除多餘的 液體。 接下來加入 200 µl 的 assay diluent (含 10% FBS 的 PBS)，封 起來後並在室溫下反應一小時。反應完成時，甩掉 well 中液體後， 用 wash buffer 沖洗三次。再來以原廠提供的 mouse IgG2a 標準品稀 釋成 3.125~100 ng/ml，以及稀釋好的血清樣品溶液，各取 100 µl 加 23.
(24) 入 well 中，封起來並在室溫下反應兩小時。反應完成時，甩掉 well 中的液體後，再用 wash buffer 沖洗 5 次。接下來加入 100 µl 的 detection antibody (用 assay diluent 稀釋)，封起來並在室溫下反應一小時。反應 完成時，甩掉 well 中的液體後，再用 wash buffer 沖洗 5 次。接下來 加入 100 µl 的 enzyme reagent (用 assay diluent 稀釋)，封起來並在室 溫下反應 30 分鐘， 反應完成時，甩掉 well 中的液體後， 再用 wash buffer 沖洗 7 次 (此時每次需間隔 0.5~1 min)。之後， 在避光的環境 下，每個 well 加入 100 µl 的 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) substrate solution，並在室溫下避光反應 30 分鐘。反應後，在每個 well 中加入 50 µl 的 stop solution (2N H2SO4)。最後，用 ELISA reader，在 波長 450 nm 下，測定每個 well 中的 O.D.值，以標準品所得的 O.D.− 濃度 (ng/ml) 回歸線來分析樣本內 IgG2a 的含量。. 六、藥物縮短麻醉時間的測試 依照 Robichaud 等人的方法[22]，加以修飾，測試藥物 ayanin 與 biochanin A (皆為 300 µmol/kg, s.c.) 或其溶劑 (分別為 DMSO 與 DMSO : alcohol = 1: 1)兩者均以 Tween 20 助溶，其比例分別為藥物或 溶劑：Tween 20：生理食鹽水 = 1：1：8 (v/v)；藥物或溶劑：Tween 20：生理食鹽水 = 1：2：7 (v/v)皮下注射於 8~12 週齡的雌性小白鼠. 24.
(25) (BALB/c) 1 小時後，接著腹腔注射 xylazine (10 mg/kg)/ketamine (70 mg/kg)，等小白鼠麻醉後，將其背部著地且四肢朝上平放，確定無法 自動翻身時，開始計時，直到小白鼠自動翻身且四肢著地時(即正向 反射)，記錄下所需時間。. 七、離體天竺鼠氣管之實驗 在第 1 天、第 4 天及第 18 天給予雄性天竺鼠(500~600 g)每邊腿 部肌肉施打 0.7 ml 由 10% OVA (w/v) 和 Freund's complete adjuvant 1：1 等比例混合之 5% (w/v) 的 OVA，使其敏感化，於第 25 天將 其麻醉後斷頸，取出氣管，清除週邊多餘的結締組織，平均分成六段， 每段約含 3-4 個 C 形軟骨， 將一端夾住，連接於 force displacement transducer (Grass FT03, Quincy, MA, USA)，另一端用 L 型支架夾住使 氣管浸於 5 ml 37 ℃的 Krebs solution (118 mM NaCl、4.7 mM KCl、1.2 mM KH2PO4、1.2 mM MgSO4、2.5 mM CaCl2、25 mM NaHCO3 以及 10.1 mM dextrose)，為了消除前列腺素引起的自發性張力，因此加入 3 µM 的 indomethacin，並且同時持續給予氧氣 (含 95% O2 + 5% CO2)。之後預先給予氣管平滑肌 1.5 g 的起始張力，使其平衡一小時 後，加入 60 mM KCl，用 Krebs solution 洗掉後再給予 KCl，重覆數. 25.
(26) 次，直到收縮穩定，以此收縮當成 100%，然後用 Krebs solution 沖洗 使平滑肌鬆弛至穩定狀態再給藥。所有收縮均以等長(isometric)的方 式記錄在多功能記錄器上 (Gould RS3200, Valley view, OH, USA)。測 試藥物為 ayanin 及 biochanin A，其溶劑分別為 DMSO 及 DMSO: alcohol = 1 : 1，各預處理 15 分鐘後累積加入卵蛋白 (0.01~100 µg/ml)，觀察藥物本身是否能鬆弛氣管之基本張力，和是否能抑制累 加 卵 蛋 白 引 起 的 對 數 濃 度 − 反 應 曲 線 (log concentration−response curves)。. 八、統計分析 所有數據皆以平均值 ± 標準誤差 (mean ± SEM) 表示，兩組 數據比較以 Student’s t-test 來統計分析；三組以上各數據間以 one-way analysis of variance (ANOVA) 來統計分析，並以 Dunnett’s test 作事後 檢定，當 p 值小於 0.05 則表示有意義差。. 26.
(27) 参、結果 一、Ayanin 與 biochanin A 對氣道過度反應的活體實驗 口服 ayanin 依照其 control、non-challenged、ayanin 10 、30 和 100 µmol/kg 測定的 baseline enhanced pause (Penh)值分別為 3.43 + 0.04、2.45 + 0.03、2.41 + 0.05、2.40 + 0.06 及 2.39 + 0.03，此五組數 據之間並無意義差。吸入 saline 的 Penh 值也依序分別為 2.42 + 0.07、 2.46 + 0.06、2.42 + 0.07、2.40 + 0.07 及 2.39 + 0.03，此五組數據之間 也無意義差，吸入 saline 並不影響 baseline Penh 值，因此以各組吸入 saline 的 Penh 值當作基準值 1。經 OVA 激釁並敏感化的對照組(溶劑) 小白鼠會隨著吸入 MCh (6.25~50 mg/ml)而使得 Penh 值產生濃度依存 性地增加，而 Penh 值會由基準值的 0.99 + 0.04 倍 (n=11) 增加到 2.06 + 0.10 倍 (n=11)。經敏感化，但給予 saline 噴霧取代 OVA 激釁 (non-challenged)的小白鼠與對照組比較，對照組的的小白鼠吸入 MCh (25 和 50 mg/ml)所得的 Penh 值有意義地高於 non-challenged 的小白 鼠。與對照組比較，ayanin 30 和 100 µmol/kg 能劑量依存性地減少 MCh 25 和 50 mg/ml 增加的 Penh 值 (Fig. 2A)。 口服 biochanin A 依照其 control、non-challenged、biochanin A 30 和 100 µmol/kg 測定的 baseline Penh (enhanced pause)值分別為 2.45 + 0.05、2.45 + 0.03、2.44 + 0.10 及 2.49 + 0.04，此四組數據之間並無意 27.
(28) 義差。吸入 saline 的 Penh 值也依序分別為 2.40 + 0.05、2.46 + 0.06、2.40 + 0.08 及 2.43 + 0.09，此四組數據之間也無意義差，吸入 saline 並不 影響 baseline Penh 值，因此以各組吸入 saline 的 Penh 值當作基準值 1。 經 OVA 激 釁 並 敏 感 化 的 對 照 組 ( 溶 劑 )小 白 鼠 會 隨 著 吸 入 MCh (6.25~50 mg/ml)而使得 Penh 值產生濃度依存性地增加，而 Penh 值會由 基準值的 1.01 + 0.16 倍(n=10) 增加到 2.00 + 0.20 倍 (n=10)。經敏感 化，但給予 saline 噴霧取代 OVA 激釁 (non-challenged)的小白鼠與對 照組比較，對照組的的小白鼠吸入 MCh (25 和 50 mg/ml)所得的 Penh 值有意義地高於 non-challenged 的小白鼠。與對照組比較， 口服高 劑量的 biochanin A (100 µmol/kg) 能減少 MCh 25 和 50 mg/ml 增加的 Penh 值 (Fig. 2D)。. 二、Ayanin 與 biochanin A 對發炎細胞的抑制 對照組與 non-challenged 的小白鼠比較，前者肺泡灌洗液中總發 炎細胞、巨噬細胞、淋巴球、嗜中性白血球和嗜酸性白血球的數目均 有意義地增加 (Fig. 2B, E)，而口服 ayanin 30~100 µmol/kg 能有意義 地減少肺泡灌洗液中總發炎細胞、巨噬細胞、淋巴球、嗜中性白血球 和嗜酸性白血球的數目 (Fig. 2B)。 與對照組比較，口服 biochanin A 100 µmol/kg 能有意義地減少肺 28.
(29) 泡灌洗液中總發炎細胞、嗜中性白血球和嗜酸性白血球的數目，但對 巨噬細胞和淋巴球並無影響 (Fig. 2E)。. 三、Ayanin 與 biochanin A 對細胞激素的抑制 對照組與 non-challenged 的小白鼠比較，前者 BALF 中的細胞激 素包括 IL-2、IL-4、IL-5 與 TNF-α 皆有意義地增加 (Fig. 2C, F)。Ayanin 10~100 µmol/kg 有意義地減少 BALF 中 IL-2、IL-4、IL-5 的含量，且 30~100 µmol/kg 也會有意義地減少 TNF-α 的含量。但其並不會影響 IFN-γ，高劑量時 (100 µmol/kg)甚至於有意義地增加其含量 (Fig. 2C)。 與對照組比較，biochanin A 在 30~100 µmol/kg 能有意義地減少 BALF 中 IL-4、IL-5 的含量，在 100 µmol/kg 能有意義地減少 IL-2 及 TNF-α 的含量。但 30~100 µmol/kg 都不會增加 IFN-γ 的含量 (Fig. 2F)。. 四、Ayanin 與 biochanin A 對 IgE 的抑制 Ayanin 的對照組與 non-challenged 的小白鼠比較時，對照組有意 義地增加血清和 BALF 中 total IgE 的含量，可分別由 8.7 + 0.7 µg/ml 增至 33.5 + 3.3 µg/ml 及由 14.1 + 2.8 ng/ml 增至 100.4 + 10.0 ng/ml 29.
(30) (Figs. 3A, B)。對照組也會有意義地增加血清及 BALF 中 OVA-specific IgE 的含量，可分別由 1 增至 1.85 + 0.17 AU 及由 1 增至 3.23 + 0.37 AU (Figs. 3C, D)。與對照組比較，Ayanin 30~100 µmol/kg 能有意義 地減少血清和 BALF 中 total IgE (Figs. 3A, B) 及 OVA-specific IgE 的 含量 (Figs. 3C, D )。 Biochanin A 之對照組與 non-challenged 的小白鼠比較時，對照組 會有意義地使血清和 BALF 中的 total IgE 增加，分別由 8.7 + 0.7 µg/ml 增至 31.0 + 2.1 µg/ml 及由 14.1 + 2.8 ng/ml 增至 98.5 + 19.1 ng/ml (Figs. 3E, F)。對照組也會有意義地增加血清及 BALF 中 OVA-specific IgE 的含量，分別由 1 增至 1.74 + 0.13 AU 及由 1 增至 3.81 + 0.49 AU (Figs. 3G, H) 。與對照組比較，Biochanin A 100 µmol/kg 能有意義地 減少血清和 BALF 中 total IgE (Figs. 3E, F) 及 OVA-specific IgE 的含 量 (Figs. 3G, H)。. 五、Ayanin 與 biochanin A 對 IgG2a 的作用 Ayanin 之對照組與 non-challenged 的小白鼠比較，對照組會有意 義地使血清中 total IgG2a 的含量下降，由 4420 + 888 µg/ml 降至 2070 + 108 µg/ml。與對照組比較，ayanin 30 和 100 µmol/kg 能有意義地使. 30.
(31) total IgG2a 含量上升 (Fig. 4A)。 Biochanin A 之對照組與 non-challenged 的小白鼠比較，對照組 會有意義地使血清中 total IgG2a 的含量下降，由 4420 + 888 µg/ml 降 至 1850 + 376 µg/ml。與對照組比較，Biochanin A 100 µmol/kg 能有意 義地使 total IgG2a 的含量上升 (Fig. 4B)。. 六、Ayanin 與 biochanin A 對 xylazine/ketamine 引起麻醉時 間的影響 腹腔注射 xylazine (10 mg/kg)/ketamine (70 mg/kg)引起的對照組 (溶劑) 小白鼠麻醉時間平均為 32.17 + 8.52 分鐘。與對照組比較，測 試藥物 ayanin 在高劑量時 (300 µmol/kg, s.c.) 並不會縮短小白鼠麻 醉時間 (Fig. 5A)。 Biochanin A 及 ayanin 高劑量 (300 µmol/kg, s.c.) 並不會縮短 小白鼠之麻醉時間 (Fig. 5B)。. 七、Ayanin 及 biochanin A 抑制離體氣管因卵蛋白引起的收 縮. 31.
(32) 敏感化離體的天竺鼠氣管因外加 60 mM KCl 會引起 0.868 ± 0.037 g (n=46) 的最大收縮，以此當作 100%，累積加入卵蛋白 (0.01~100 µg/ml)會使其張力產生濃度依存性的增加，測試藥物 ayanin 的溶劑(DMSO)預處理 15 分鐘會使基本張力輕微鬆弛 0.08 + 0.15 g (n= 10)，但統計沒有意義。以 Ayanin 30 µM 預處理 15 分鐘可使基本 張力有意義地鬆弛 0.190 + 0.049 g (n=5)但並不會抑制卵蛋白引起的 收縮；以高濃度 Ayanin (100 µM) 預處理會使基本張力有意義地鬆弛 0.205 + 0.036 g (n=5)，且會有意義地抑制卵蛋白(10~100 µg/ml)引起 的收縮 (Fig. 6A)。 測試藥物 biochanin A 的溶劑 ( DMSO: alcohol= 1 : 1)預處理 15 分鐘會使基本張力輕微鬆弛 0.086 + 0.052 g (n= 9)，但統計沒有意 義。Biochanin A (30 µM) 預處理 15 分鐘會使基本張力有意義地鬆弛 0.217 + 0.044 g (n= 3)，但不會抑制卵蛋白引起的收縮；Biochanin A (100 µM) 預處理 15 分鐘會使基本張力有意義地鬆弛 0.416 + 0.076 g (n= 6)，且能有意義地抑制卵蛋白(1~100 µg/ml)引起的收縮 (Fig. 6B)。. 32.
(33) 肆、討論 目前 PDE4 抑制劑在臨床上治療氣喘的應用尚未普遍，主要原因 是它的副作用。已知 PDE4 抑制劑最常見的副作用為噁心、嘔吐及胃 酸分泌過多，腹痛等等。這些副作用發生與否，可能是抑制劑和腦部 HARBS 結合所造成 [8]。 由本實驗室先前的研究發現，ayanin 取代結合在敏感化天竺鼠全 腦細胞顆粒 HARBS 之 [3H]-rolipram 的 EC50 值＞300µM，因此其 PDE4H/PDE4L (> 300 µM /15.8 µM) 比值大於 19 [17]，與進入臨床試 驗第三期的第二代 PDE4 選擇性抑制劑 cilomilast (比值為 1) [9]及 roflumilast (比值為 3) [9, 23]相較，其比值大很多。Cilomilast 因副作 用太大，於 2003 年抗氣喘的臨床試驗第三期後終止試驗，抗慢性阻 塞性肺病(COPD) 的臨床試驗仍在進行，而 roflumilast 則兩種臨床試 驗都在進行 [24]。目前已進入臨床試驗第二期的選擇性 PDE4 抑制 劑 AWD 12-281 之 PDE4H/PDE4L 比值為 11 [25]。推測 ayanin 副作用 如噁心、嘔吐及胃酸分泌過多並不明顯。因此，ayanin 有其發展空間。 Biochanin A 是由紅花苜蓿(red clover)中萃取出來的主成分，目前 多被用為植物性雌激素的補充來源。但，先前研究顯示它亦有 PDE4 較具選擇性的抑制效果(IC50 值為 8.5 µM)。雖然對 PDE1 (IC50 值為 29.1 µM)及 PDE2 (IC50 值為 27.9 µM)也有抑制作用，然而對 PDE3 和 PDE5 33.
(34) 均無抑制作用(IC50 值均> 100 µM) [18]。其 PDE4H/PDE4L 比值更大於 35 [26]，顯示 biochanin A 做為氣喘及慢性阻塞性肺病之治療有值得 開發的潛力。 本次實驗結果發現，ayanin及biochanin A皆能減少MCh所引起的 Penh值增加，抑制氣道過度反應。此外，口服ayanin 30~100 µmol/kg 也能有意義地減少總發炎細胞、巨噬細胞、淋巴球、嗜中性白血球和 嗜酸性白血球數目的增加，減少血清和BALF中Total及OVA-specific IgE，及抑制細胞激素(cytokines)如IL-2、IL-4、IL-5、TNF-α的釋放。 高劑量(100 µmol/kg)甚至於有意義地增加IFN-γ的含量。這些都說明 ayanin具有抗發炎的作用。 而口服biochanin A 100 µmol/kg 能減少肺泡灌洗液中總發炎細 胞、嗜中性白血球和嗜酸性白血球數目的增加。也可減少血清和BALF 中Total及OVA-specific IgE的含量，及抑制細胞激素(IL-2、IL-4、IL-5 及TNF-α)的釋放，說明biochanin A具有抗發炎的效果。根據本實驗室 先前的研究結果，biochanin A對於PDE1~5的IC50分別為29.1、27.9、 >100、8.5、>100 µM [18]。比較上，biochanin A是一個選擇性的PDE4 抑制劑。雖然有報告指出，同時抑制PDE3/4要比單獨抑制PDE4的效 果來得好 [27]，但同時也可能伴隨著更明顯的心血管副作用 [28]， 如心律不整 [29]、血壓降低 [30]以及頭痛 [31]等。故biochanin A可. 34.
(35) 提供抗氣喘藥物發展的研究方向。 Ayanin 與 biochanin A，對於敏感化天竺鼠的離體氣管，在高濃 度(100 µM) 皆可抑制卵蛋白累加所引起的收縮。因此，推測兩者均 能安定肥胖細胞，避免肥胖細胞去顆粒化(degranulation) [32]。 根據 Robichaud 等人的報告指出，選擇性的 PDE 4 抑制劑會經 由 presynaptic α2-adrenoreceptor inhibition 而造成嘔吐反應 [33]。他們 發現 clonidine (α2-adrenoceptor agonist)可以防止 PDE 4 選擇性抑制劑 及一些 α2-adrenoceptor antagonist(如 yohimbine, MK-192)在雪貂所引 起的嘔吐反應[34]，顯示 α2-adrenoceptor inhibition 可能會造成嘔吐反 應，而選擇性 PDE 4 抑制劑也可能具有 α2-adrenoceptor inhibition 的 作用。另外，以合併 xylazine/ketamine 肌肉注射於大白鼠[35]及腹腔 注射於小白鼠[22]，是經由 α2-adrenoceptor activation 而產生麻醉作 用，前述的 yohimbine 會劑量依存性的縮短這些動物麻醉的時間， PDE4 選擇性抑制劑也會縮短其麻醉時間；但其他 PDE 亞型的抑制劑 卻不會。這些結果說明了藉由測試 PDE4 選擇性抑制劑是否縮短動物 經由 α2-adrenoceptor activation 的麻醉時間，可推測可能的嘔吐反應 [33, 34]。由於小白鼠、大白鼠等齧齒類動物並不會產生嘔吐反應， 因此簡單的藉由此種縮短麻醉時間的測試是相當值得研究的。在本篇 論文實驗結果顯示，ayanin 與 biochanin A 在高劑量時(300 µmol/kg, 35.
(36) s.c.) 皆不會縮短小白鼠麻醉時間。 因此推測它們嘔吐的副作用極不 明顯。 綜合以上結果，ayanin 與 biochanin A 這兩個化合物，有抗發炎 及防止氣道過度反應的效果，且能安定肥胖細胞，避免去顆粒化 (degranulation)，嘔吐等副作用可能並不明顯，有抗氣喘作用發展的潛 力。. 36.
(37) 伍、參考文獻 1. Bousquet J, Chanez P, Lacoste JY, Barneon G, Ghavanian N, Enander I, Venge P, Ahlstedt S, Simony-Lafontaine J, Godard P, Eosinophilic inflammation in asthma. N. Engl. J. Med. 323: 1033-1039, 1990. 2. Frew AJ, Moqbel R, Azzawi M, Hartnell A, Barkans J, Jeffery PK, Kay AB, Scheper RJ, Varley J, Church MK, T lymphocytes and eosinophils in allergen-induced late-phase asthmatic reactions in the guinea pig. Am. Rev. Respir. Dis. 141: 407-413, 1990. 3. Hatzelmann A, Tenor H, Schudt C, Differential effects of non-selective and selective phosphodiesterase inhibitors on human eosinophil functions. Br. J. Pharmacol. 114: 821-831, 1995. 4. Bleecker E, Inhaled corticosteroids: current products and their role in patient care. J. Allergy Clin. Immunol. 101: S400-S402, 1998. 5. Persson CG, Overview of effects of theophylline. J. Allergy Clin. Immunol. 78: 780-787, 1986. 6. Rotella DP, Phosphodiesterase 5 inhibitors: current status and potential applications. Nat. Rev. Drug Discov. 1: 674-682, 2002. 7. Spina D, The potential of PDE4 inhibitors in respiratory disease. Curr. Drug Targets Inflamm. Allergy 3: 231-236, 2004. 8. Giembycz MA, Phosphodiesterase-4 inhibitors and the treatment of asthma: where are we now and where do we go from here? Drugs 59: 193-212, 2000. 9. Zhao Y, Zhang HT, O'Donnell JM, Inhibitor binding to type 4 phosphodiesterase (PDE4) assessed using [3H]-piclamilast and [3H]-rolipram. J. Pharmacol. Exp. Ther. 305: 565-572, 2003. 10. Souness JE, Rao S, Proposal for pharmacologically distinct conformers of PDE4 cyclic AMP phosphodiesterases. Cell Signal. 9: 227-236, 1997. 11. Barnette MS, Bartus JO, Burman M, Christensen SB, Cieslinski LB, Esser KM, Prabhakar US, Rush JA, Torphy TJ, Association of the 37.
(38) anti-inflammatory activity of phosphodiesterase 4 (PDE4) inhibitors with either inhibition of PDE4 catalytic activity or competition for [3H]-rolipram binding. Biochem. Pharmacol. 51: 949-956, 1996. 12. Martin C, Goggel R, Dal P, V, Vergelli C, Giovannoni P, Ernst M, Uhlig S, Airway relaxant and anti-inflammatory properties of a PDE4 inhibitor with low affinity for the high-affinity rolipram binding site. Naunyn Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 365: 284-289, 2002. 13. Kim E, Chun HO, Jung SH, Kim JH, Lee JM, Suh BC, Xiang MX, Rhee CK, Improvement of therapeutic index of phosphodiesterase type IV inhibitors as anti-asthmatics. Bioorg. Med. Chem. Lett. 13: 2355-2358, 2003. 14. Peluso MR, Flavonoids attenuate cardiovascular disease, inhibit phosphodiesterase, and modulate lipid homeostasis in adipose tissue and liver. Exp. Biol. Med. (Maywood.) 231: 1287-1299, 2006. 15. Kawai M, Hirano T, Higa S, Arimitsu J, Maruta M, Kuwahara Y, Ohkawara T, Hagihara K, Yamadori T, Shima Y, Ogata A, Kawase I, Tanaka T, Flavonoids and related compounds as anti-allergic substances. Allergol. Int. 56: 113-123, 2007. 16. Hirano T, Higa S, Arimitsu J, Naka T, Ogata A, Shima Y, Fujimoto M, Yamadori T, Ohkawara T, Kuwabara Y, Kawai M, Matsuda H, Yoshikawa M, Maezaki N, Tanaka T, Kawase I, Tanaka T, Luteolin, a flavonoid, inhibits AP-1 activation by basophils. Biochem. Biophys. Res. Commun. 340: 1-7, 2006. 17. Chan AL, Huang HL, Chien HC, Chen CM, Lin CN, Ko WC, Inhibitory effects of quercetin derivatives on phosphodiesterase isozymes and high-affinity [3H]-rolipram binding in guinea pig tissues. Invest New Drugs, in press, 2008. 18. Ko WC, Shih CM, Lai YH, Chen JH, Huang HL, Inhibitory effects of flavonoids on phosphodiesterase isozymes from guinea pig and their structure-activity relationships. Biochem. Pharmacol. 68: 2087-2094, 2004. 19. Kupchan SM, Bauerschmidt E. Cytotoxic flavonols from Baccharis 38.
(39) sarothroides. Phytochemistry 10, 664-666. 1971. 20. Hamelmann E, Schwarze J, Takeda K, Oshiba A, Larsen GL, Irvin CG, Gelfand EW, Noninvasive measurement of airway responsiveness in allergic mice using barometric plethysmography. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 156: 766-775, 1997. 21. Cho YS, Kwon B, Lee TH, Kim TB, Moon KA, La S, Lee J, Lee SD, Oh YM, Moon HB, 4-1 BB stimulation inhibits allergen-specific immunoglobulin E production and airway hyper-reactivity but partially suppresses bronchial eosinophilic inflammation in a mouse asthma model. Clin. Exp. Allergy 36: 377-385, 2006. 22. Robichaud A, Stamatiou PB, Jin SL, Lachance N, MacDonald D, Laliberte F, Liu S, Huang Z, Conti M, Chan CC, Deletion of phosphodiesterase-4D in mice shortens α2-adrenoceptor-mediated anesthesia, a behavioral correlate of emesis. J. Clin. Invest 110: 1045-1052, 2002. 23. Hatzelmann A, Schudt C, Anti-inflammatory and immunomodulatory potential of the novel PDE4 inhibitor roflumilast in vitro. J. Pharmacol. Exp. Ther. 297: 267-279, 2001. 24. Lipworth BJ, Phosphodiesterase-4 inhibitors for asthma and chronic obstructive pulmonary disease. Lancet 365: 167-175, 2005. 25. Draheim R, Egerland U, Rundfeldt C, Anti-inflammatory potential of the selective phosphodiesterase-4 inhibitor N- (3,5dichloro-pyrid-4-yl)-[1-(4-fluorobenzyl)-5-hydroxy-indole-3-yl] -gly oxylic acid amide (AWD 12-281), in human cell preparations. J. Pharmacol. Exp. Ther. 308: 555-563, 2004. 26. Lai CY. Machanisms of anti-asthmatic action of hesperetin in vivo and in vitro. Master thesis, Graduate Institute of Pharmacology, Taipei Medical University, 2005. 27. Underwood DC, Kotzer CJ, Bochnowicz S, Osborn RR, Luttmann MA, Hay DW, Torphy TJ, Comparison of phosphodiesterase III, IV and dual III/IV inhibitors on bronchospasm and pulmonary 39.
(40) eosinophil influx in guinea pigs. J. Pharmacol. Exp. Ther. 270: 250-259, 1994. 28. Muller B, Lugnier C, Stoclet JC, Involvement of rolipram-sensitive cyclic AMP phosphodiesterase in the regulation of cardiac contraction. J. Cardiovasc. Pharmacol. 16: 796-803, 1990. 29. Naccarelli GV, Goldstein RA, Electrophysiology of phosphodiesterase inhibitors. Am. J. Cardiol. 63: 35A-40A, 1989. 30. Leeman M, Lejeune P, Melot C, Naeije R, Reduction in pulmonary hypertension and in airway resistances by enoximone (MDL 17,043) in decompensated COPD. Chest 91: 662-666, 1987. 31. Fujimura M, Kamio Y, Saito M, Hashimoto T, Matsuda T, Bronchodilator and bronchoprotective effects of cilostazol in humans in vivo. Am. J. Respir. Crit Care Med. 151: 222-225, 1995. 32. Underwood DC, Osborn RR, Novak LB, Matthews JK, Newsholme SJ, Undem BJ, Hand JM, Torphy TJ, Inhibition of antigen-induced bronchoconstriction and eosinophil infiltration in the guinea pig by the cyclic AMP-specific phosphodiesterase inhibitor, rolipram. J. Pharmacol. Exp. Ther. 266: 306-313, 1993. 33. Robichaud A, Savoie C, Stamatiou PB, Tattersall FD, Chan CC, PDE4 inhibitors induce emesis in ferrets via a noradrenergic pathway. Neuropharmacology 40: 262-269, 2001. 34. Robichaud A, Tattersall FD, Choudhury I, Rodger IW, Emesis induced by inhibitors of type IV cyclic nucleotide phosphodiesterase (PDE IV) in the ferret. Neuropharmacology 38: 289-297, 1999. 35. Robichaud A, Savoie C, Stamatiou PB, Lachance N, Jolicoeur P, Rasori R, Chan CC, Assessing the emetic potential of PDE4 inhibitors in rats. Br. J. Pharmacol. 135: 113-118, 2002.. 40.
(41) A H O H3 C O. O. O C H3. H3 C O O. H O. B O. O H. H3 C O. O. H O. Figure 1. Chemical structures of ayanin (mol. wt., 344) (A) and biochanin A (mol. wt., 284.27) (B).. 41.
(42) A. D Control Non-challenged Ayanin 10 µmol/kg (p.o.) Ayanin 30 µmol/kg (p.o.) Ayanin 100 µmol/kg (p.o.). Penh (mutiple of the saline). 2.2 2.0. 2.0. ###. 1.8. Control Non-challenged Biochanin A 30 µmol/kg (p.o.) Biochanin A 100 µmol/kg (p.o.). 2.2. ###. **. 1.4. ###. 1.8. 1.6. **. ###. 1.6 1.4. **. ***. ***. 1.2. 1.2. *** 1.0. 1.0. 0.8. 0.8 10. 10. 100. MCh (mg/ml). B Control Non-challenged Ayanin 10 µmol/kg (p.o.) Ayanin 30 µmol/kg (p.o.) Ayanin 100 µmol/kg (p.o.). Number of cells (x 103 /ml). ###. 2000. Control Non-challenged Biochanin A 30 µmol/kg (p.o.) Biochanin A 100 µmol/kg (p.o.). ### 1500. 1500. *. * 1000. 1000. **. *. 500. #. ### ###. #. * ***. **. Mac. Lym. ###. # #. Total. ###. 500. 0. Neu. ##. **. **. **. **. 0. Total. Eos. C. Mac. Lym. Neu. Eos. F Control Non-challenged Ayanin 10 µmol/kg (p.o.) Ayanin 30 µmol/kg (p.o.) Ayanin 100 µmol/kg (p.o.). 40. ### 30. pg/ml. 100. MCh (mg/ml). E. 2000. Control Non-challenged Biochanin A 30 µmol/kg (p.o.) Biochanin A 100 µmol/kg (p.o.). 40. ### 30. *. * *. 20. 20. **. 10. * ** **. ## #. 0. ###. ***. IL-2. ##. 10. #. ** *** ***. ##. *. ##. #. *. *. *** ***. ** **. *. 0. IL-4. IL-5. IFN-γ. IL-2. TNF-α. IL-4. IL-5. IFN-γ TNF-α. Figure 2. Effects of ayanin (10~100 µmol /kg, p.o.) and biochanin A( 30~100 µmol /kg, p.o.) on Penh (A, D), inflammatory cells (B, E), and cytokines (C, F) in sensitized mice which received aerosolized methacholine (MCh, 6.25~50 mg/ml) 2 days after the last allergen challenge. #p < 0.05, ##p < 0.01, ###p < 0.001 when compared with the non-challenged group. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 when compared with the control (vehicle) group. Each value represents the mean + SEM. The number of mice in each group was 6~11. Total: total cells; Mac: macrophages; Lym: lymphocytes; Neu: neutrophils; Eos: eosinophils; IL: interleukin; TNF-α: tumor necrosis factor-α; IFN-γ: interferon-γ. 42.
(43) A. Total IgE (µg/ml). 40. ###. E. Control Non-challenged Ayanin 10 µmol/kg (p.o) Ayanin 30 µmol/kg (p.o) Ayanin 100 µmol/kg (p.o). 40. ###. 30. *. Control Non-challenged Biochanin A 30 mmol/kg (p.o.) Biochanin A 100 mmol/kg (p.o.). 30. * **. 20. 20. 10. 10. 0. 0. 125. B. 125. F. ##. Total IgE (ng/ml). ### 100. 100. 75. 75. **. **. 50. 50. 25. 25. 0. 0. OVA-specific IgE (arbitrary unit). C. G. 2.4. ##. ###. 2.0. 2.0. 1.6. 1.6. *. * 1.2. **. 1.2. 0.8. 0.8. 0.4. 0.4. 0.0. 0.0. 5. OVA-specific IgE (arbitrary unit). 2.4. *. D. 5. H ###. 4. ###. 4. 3. 3. ** 2. **. **. 2. 1. 1. 0. 0. Figure 3. Effects of ayanin (10~100 µmol/kg, p.o.) and biochanin A (30~100 µmol/kg, p.o.) on total IgE (A, B, E, F), and OVA-specific IgE (C, D, G, H) in serum (A,C, E, G) and BALF (B, D, F, H) of sensitized mice which received aerosolized methacholine (MCh, 6.25~50 mg/ml) after the last allergen challenge. ##p < 0.01, ###p < 0.001 when compared with the non-challenged group. *p < 0.05, **p < 0.01 when compared with the control (vehicle) group. Each value represents the mean ± SEM. The number of mice in each group was 6~11. 43.
(44) A. C o n tr o l N o n - c h a lle n g e d A y a n i n 1 0 µ m o l / k g ( p .o .) A y a n i n 3 0 µ m o l / k g ( p .o .) A y a n i n 1 0 0 µ m o l / k g ( p . o .). 6000. **. 5000. Total IgG. 2a (µg/ml). ** 4000. 3000 ###. 2000. 1000. 0. B C o n tro l N o n - c h a lle n g e d B i o c h a n i n A 3 0 µ m o l / k g ( p . o .) B i o c h a n i n A 1 0 0 µ m o l / k g ( p . o .). 6000. 5000. Total IgG2a (µg/ml). ** 4000. 3000 ## 2000. 1000. 0. Figure 4. Effects of ayanin (10~100 µmol/kg, p.o.) (A) and biochanin A (30~100 µmol/kg, p.o.) (B) on total IgG2a in serum of sensitized mice which received aerosolized methacholine (MCh, 6.25~50 mg/ml) 2 days after the last allergen challenge. ##p < 0.01, ###p < 0.001 when compared with the non-challenged group. **p < 0.01 when compared with the control (vehicle) group. Each value represents the mean ± SEM. The number of mice in each group was 6~11.. 44.
(45) A 50. C o n tr o l A y a n in 3 0 0 µ m o l/k g ( s .c .) Duration of anathesia (min). 40. 30. 20. 10. 0. B 50. C o n tr o l B io c h a n in A 3 0 0 µ m o l/k g ( s .c .) Duration of anathesia (min). 40. 30. 20. 10. 0. Figure 5. Effects of subcutaneously administered ayanin (A) and biochanin A (B) on the duration of xylazine (10 mg/kg, i.p.)/ketamine (70 mg/kg, i.p.)-induced anesthesia in mice. Ayanin and biochanin A was administered 15 min before the anesthesia. There was no significant difference when compared with the control (vehicle) group. Each value represents the mean ± SEM. The number of each group was 6~11.. 45.
(46) A Control Ayanin 30 µM Ayanin 100 µM. 160. Contraction (% 60 mM KCl). 140 120 100 80. * 60 40. *. 20 0. -9. -8. -7. B. -6. -5. -4. -3. Log [OVA] (g/ml). Control Biochanin A 30 µM Biochanin A 100 µM. 160. Contraction (% 60 mM KCl). 140 120 100 80 60. *. 40. *. 20. *. 0. -9. -8. -7. -6. -5. -4. -3. Log [OVA] (g/ml). Figure 6. Effects of ayanin (30~100 µM) (A) and biochanin A (30~100 µM) (B) on cumulative ovalbumin (OVA)-induced contractions in isolated sensitized guinea pig trachealis. *p < 0.05 when compared with the control (vehicle). Each value represents the mean ± SEM. The number of experiments was 3~10.. 46.
(47) (Hamelmann et al., 1997)[20] Scheme 1. Computation of the parameters measured by barometric Plethysmography. The box pressure wave in inspiration (down) and expiration (up) explaining the computation of the parameters measured by whole-body plethysmograph. Ti = inspiratory time (s), time from start of inspiration to end of inspiration; Te = expiratory time (s), time from end of inspiration to start of next inspiration; PIP = peak inspiratory pressure (cmH2O), maximal negative box pressure occurring in one breath; PEP = peak expiratory pressure (cmH2O), maximal positive box pressure occurring in one breath; Tr = relaxation time (s), time of the pressure decay to 36% of total box pressure during expiration. 47.
(48)
Benzer Belgeler
Kongenital kontraktürler, araknodaktili, skolyoz, anormal kulak görünümü ve musküler hipoplazi ile karakterize artrogripo- zis tip IX Beals Hecht tanısı alan olgumuz ışığında,
Ad› geçen eserde %50 oranla en yük- sek psikopatolojinin flâirlerde oldu¤u belirtilmifl, mü- zisyenlerde %38 ve ressamlarda %18 oran›nda psiko- patoloji tesbit
‹laç tipleri ile MS s›kl›¤› aras›nda istatistiksel ola- rak anlaml› bir fark görülmese de sadece tek bir tipik antipsikotik ilâç kullanan hastalarda MS s›kl›¤›
Blasco-Fontecilla ve arkadafllar› (2005) ise, yaklafl›k 1 y›ld›r parazitoz ve k›skançl›k heze- yanlar› bulunan 74 yafl›ndaki kad›n hastada 300 mg/gün ketiyapin ve
Klinik olarak RA hastalar›ndaki servikal tutulum esas olarak atlanto-aksiyel subluksasyon (AAS) (%65), odontoidin süperiora migrasyonu (%20) ve subaksiyel subluksasyon (SAS) (%15)
Öznel bir psiflik hâlin, afla¤› yukar› efl- zamanl› olarak fakat uzakta oluflan, eflzamanl›l›k nite- li¤e sâhip, nesnel bir olay›n asl›na uygun yans›mas›
of Psychiatry Sedat ÖZKAN, MD, Prof.. of Psychiatry Mine ÖZMEN,
Klini¤imizde, medikal tedavi ile fasial sinir paralizisinde iyilefl- me sa¤lanamam›fl, ENMG ile sa¤ fasial sinirde tam aksonal dejene- rasyon tespit edilmifl olan, Ramsay-Hunt
