TUZ STRESĐ Đ BÖRÜLCE (Vigna unguiculata L.) YAĞ ASĐTĐ ĐÇERĐĞĐ E ETKĐSĐ Đ
ARAŞTIRILMASI Dursun KISA Yüksek Lisans Tezi Biyoloji Anabilim Dalı Doç. Dr. Lokman ÖZTÜRK
2010
FE BĐLĐMLERĐ E STĐTÜSÜ BĐYOLOJĐ A ABĐLĐM DALI
YÜKSEK LĐSA S TEZĐ
TUZ STRESĐ Đ BÖRÜLCE (Vigna unguiculata L.) YAĞ ASĐTĐ
ĐÇERĐĞĐ E ETKĐSĐ Đ ARAŞTIRILMASI
Dursun KISA
TOKAT 2010
i
Tez yazım kurallarına uygun olarak hazırlanan bu tezin yazılmasında bilimsel ahlak kurallarına uyulduğunu, başkalarının eserlerinden yararlanılması durumunda bilimsel normlara uygun olarak atıfta bulunulduğunu, tezin içerdiği yenilik ve sonuçların başka bir yerden alınmadığını, kullanılan verilerde herhangi bir tahrifat yapılmadığını, tezin herhangi bir kısmının bu üniversite veya başka bir üniversitedeki başka bir tez çalışması olarak sunulmadığını beyan ederim.
ii
TUZ STRESĐĐ BÖRÜLCE (Vigna unguiculata L.) YAĞ ASĐTĐ ĐÇERĐĞĐE ETKĐSĐĐ ARAŞTIRILMASI
Dursun KISA
GAZĐOSMAPAŞA ÜĐVERSĐTESĐ FE BĐLĐMLERĐ ESTĐTÜSÜ
BĐYOLOJĐ AABĐLĐMDALI Danışman: Doç. Dr. Lokman ÖZTÜRK
Bu çalışmada iki börülce çeşidine (Karnıkara, Poyraz) 10 gün süre ile 50 mM ve 100 mM NaCI uygulandı. Bitkilerin kök ve yapraklarında malondialdehit (MDA), hidrojen peroksit (H2O2) ve yağ asidi miktarları belirlendi. Tuz stresi her iki çeşidin kök ve yapraklarında MDA miktarını azaltmıştır. 50 mM NaCI poyraz köklerinde % 25, 100 mM NaCI’de ise karnıkara köklerinde % 27 oranında MDA miktarında azalmaya neden olmuştur. Fakat tuz stresi her iki çeşitte H2O2 miktarını artmıştır. Bitkilerin kök ve yapraklarında doymuş yağ asidi yüzdesi artan tuz stresiyle birlikte artmıştır. 100 mM NaCI, poyraz çeşidinin köklerinde de doymuş yağ asidi yüzdesini kontrole göre yaklaşık 2,5 kat artırdığı görülmüştür. Bununla birlikte, tuz uygulaması 100 mM NaCI uygulanan karnıkara çeşidinin yaprakları hariç börülce çeşitlerinin kök ve yapraklarında çoklu doymamış yağ asidi yüzdesini azaltmıştır.
2010, 69 sayfa
Anahtar Kelimeler: Börülce, hidrojen peroksit, lipid peroksidasyonu, tuz stresi, yağ asiti
iii Ms Thesis
IVESTIGATIOS OF THE EFFECT OF SALT STRESS O FATTY ACID COMPOSITIO I COWPEA (Vigna unguiculata L.)
Dursun KISA Gaziosmanpasa Universty
Graduate School of atural and Appliedd Sciences Departman of Biyology
Supervisor: Assoc. Prof. Dr. Lokman ÖZTÜRK
In this study 50 mM and 100 mM NaCI were applied to two different types of cowpea (Karnıkara, Poyraz) for 10 days period. Quantities of malondialdehyde (MDA), hydrogen peroxide (H2O2) and fatty acids were determined in roots and leaves of plants. Salt stres decreased MDA amount in both types of plants’ roots and leaves. 50 mM NaCI caused 25 % decrease of MDA in poyraz roots, 100 mM NaCI caused 27 % decrease of MDA in Karnıkara roots. However salt stress increased H2O2 amount for both types. Saturated fatty acid percentage in roots and leaves of plants increased together with increasing salt stres. 100 mM NaCI was seen to increase saturated fatty acid percentage about 2,5 times compared to group. Nevertheless salt application decreased polyunsaturated fatty acid percentage in roots and leaves of cowpea types except for leaves of karnıkara in 100 mM dosage.
2010, 69 pages
iv
Tez konusunun seçiminde ve çalışmalarım esnasında her türlü desteğini, yardımını ve ilgisini esirgemeyen değerli danışman hocam Doç. Dr. Lokman ÖZTÜRK’ e, Laboratuar çalışmaları esnasında yardımlarını esirgemeyen sayın hocam Doç. Dr. Necmettin YILMAZ’ a ve deneyler sırasında desteklerini esirgemeyen birlikte çalıştığım arkadaşlarım Emel ÖZSOY, Đbrahim TETĐKTABANLAR ve Bülent AKGÜL’ e teşekkürlerimi sunarım.
Yüksek lisans araştırmalarım için gerekli olan tohum ihtiyacımı en kısa sürede ve hiçbir ücret talep etmeden karşılayan Balıkesir Tohumculuğa da ayrıca teşekkür ederim.
v ĐÇĐDEKĐLER Sayfa TEZ BEYAI ... i ÖZET ... ii ABSTRACT ...iii TEŞEKKÜR... iv ĐÇĐDEKĐLER ... v
ŞEKĐLLER LĐSTESĐ ...viii
TABLOLAR LĐSTESĐ ... ix
SĐMGE ve KISALTMALAR DĐZĐĐ ... x
1. GĐRĐŞ ve LĐTERATÜR ÖZETĐ ... 1
1.1. Stres ve Stres Çeşitleri ... 4
1.1.1. Stres ... 6
1.1.2. Tuz Stresi ... 8
1.1.3. Tuzluluk Bitkilerde Büyüme ve Fotosentezi Baskı Altına Alır ... 10
1.1.4. Tuzluluk Bitkilerde Ozmotik Dengeyi Bozar ... 11
1.2.1. Bitkiler Tuz Zararını Azaltmak Đçin Farklı Adaptasyonlar Geliştirirler ... 11
1.2.1. 1. Đyon düzenlenmesi ve Lokalizasyonu ... 13
1.2.1.2. Uyuşabilir Bileşiklerin Biyosentezi ... 13
1.2.1.3. Antioksidan Enzimlerin Đndüksiyonu ... 15
1.2.1.4. Tuza Tolerans Fonksiyonel Genetik Yaklaşım Yoluyla Belirlenir ... 15
1.3. Bitkilerde Oksidatif Stres ve Serbest Oksijen Türleri ... 17
1.3.1. Superoksit Radikali (O2˙⁻) ... 20
1.3.2. Hidrojen Peroksit (H2O2) ... 22
1.3.3. Hidroksil Radikali (OH˙⁻) ... 24
1.3.4. Singlet Oksijen (1O2) ... 26
1.3.5. Nitrik Oksit (NO˙) ... 26
1.3.6. Peroksil (ROO˙) ve Alkoksil (RO˙) Radikalleri ... 27
1.4. Radikallerinin Meydana Getirdiği Hasarlar ... 27
1.4.1. Proteinlerde Meydana Gelen Hasarlar ... 28
1.4.2. DNA’da Meydana Gelen Hasarlar ... 28
1.4.3. Lipitlerde Meydana Gelen Hasarlar ... 29
vi
1.5.3. Lipit Peroksidasyonu Đlerleme Evresi ... 34
1.5.4. Lipit Peroksidasyonu Yıkım Evresi ve Oluşan Çeşitli Organik Radikaller ... 35
1.5.4.1. Organik Peroksit Radikali (RCOO˙) ... 35
1.5.4.2. Peroksil Radikali (ROO˙) ... 35
1.5.4.3. Alkoksil Radikali (RO˙) ... 35
1.5.5. Lipit Peroksidasyonu Sonlanma Evresi ... 35
1.6. Antioksidan Savunma Sistemleri ... 36
1.6.1. Enzimatik Olmayan Savunma Sistemi ... 37
1.6.1.1. Askorbik Asit (Vitamin C) ... 38
1.6.1.2. Glutatyon ... 38
1.6.1.3. α-Tokoferol (E Vitamini) ... 40
1.6.1.4. Karotenoidler ... 41
1.6.1.5. Fenolik Bileşikler (Flavonoidler) ... 42
1.6.2. Enzimatik Savunma Sistemi ... 43
1.6.2.1. Superoksit Dismutaz (SOD) ... 43
1.6.2.2. Katalaz (CAT) ... 44
1.6.2.3. Peroksidaz (POD)... 45
1.6.2.4. Askorbat Peroksidaz (APX) ... 45
1.6.2.5. Glutatyon Redüktaz (GR) ... 46
1.6.2.6. Fenilalanin Amonyum Liyaz (PAL) ... 46
2. MATERYAL VE METOD ... 48
2.1. Materyal ... 48
2.1.1. Kullanılan Kimyasal Maddeler ... 48
2.1.2. Kullanılan Cihaz ve Aletler ... 48
2.1.3. Kullanılan Çözeltiler ... 49
2.1.3.1. Hidrojen Peroksit Miktarının Belirlenmesinde Kullanılan Çözeltiler ... 49
2.1.3.2. Malondialdehit Miktarının Belirlenmesinde Kullanılan Çözeltiler ... 49
2.1.3.3. Yağ Asiti Tayininde Kullanılan çözeltiler ... 49
2.2.Metot ... 49
2.2.1. Bitkilerin Yetiştirilmesi ve NaCI Uygulaması ... 49
2.2.2. Hidrojen Peroksit Miktarının Belirlenmesi ... 50
2.2.3. Malondialdehit Tayini ... 51
vii
2.2.7. Đstatistik Analiz ... 52
3. ARAŞTIRMA SOUÇLARI ... 54
3.1. Malondialdehit Miktarı Sonuçları ... 54
3.2. Hidrojen Peroksit Miktarının Belirlenmesinde Kullanılan Standart Grafik ... 55
3.3. Hidrojen Peroksit Miktarı Sonuçları ... 56
3.4. Yağ Asiti Tayini Sonuçları... 57
4. TARTIŞMA ... 60
viii
Şekil Sayfa
1.1. Bitkilerin farklı stres faktörlerine karşı cevabı ... 7
1.2. Atriplex halimus ve tuz bezinin yapısı ... 12
1.3. Bitkilerde serbest oksijen radikallerinin (ROS) metabolik kaynakları ... 18
1.4. Hücrelerde oksidatif ve antioksidatif sistem ... 22
1.5. Lipit Peroksidasyonu ... 33
1.6. Serbest radikallerin etkisinin antioksidant ile uzaklaştırılması ... 37
1.7. Askorbat – Glutatyon döngüsü... 39
1.8. Askorbik asitle tokoferolün rejenerasyonu ... 41
1.9. Bitkilerde reaktif oksijen türlerini zararsız hale dönüştüren hücresel ana metabolik yol ... 47
3.1. Börülce çeşitlerinin yapraklarında MDA miktarı ... 54
3.2. Börülce çeşitlerinin köklerinde MDA miktarı ... 55
3.3. Hidrojen peroksit miktarının belirlenmesinde kullanılan standart grafik ... 55
3.4. Börülce çeşitlerinin yapraklarında H2O2 miktarı ... 56
ix
Tablo Sayfa
1.1. Bitkileri etkileyen stres faktörleri... 5 1.2. Optimum çevre koşullarında farklı bitkilerden alınan ürünlerin abiyotik stres etmenleri sonucu kaybolan ürün miktarları ... 6 1.3. Türkiye topraklarının tuzluluk derecesi ve alanları ... 8 1.4. Toprakların elektriksel iletkenlik (EC) değerlerine göre tuzluluk derecesi ve
bitkilerin tepkileri ... 9 1.5. Gen aktarımı yoluyla tuza toleransı tanımlanan bitkiler ... 16 1.6. Başlıca reaktif oksijen türleri (ROS) ... 20 3.1. Farklı NaCI konsantrasyonlarında Karnıkara yaprak ve köklerinde yağ asidi
yüzdeleri ... 58 3.2. Farklı NaCI konsantrasyonlarında Poyraz yaprak ve köklerinde yağ asidi
x AOS Aktifleşmiş oksijen türleri APX Askorbat peroksidaz CAT Katalaz GC Gaz kromotografisi GR Glutatyon redüktaz GSH Glutatyon H2O2 Hidrojen peroksit L˙ Lipit radikali MDA Malondialdehit MDHA Monodehidroksiaskorbat MUFA Tekli doymamış yağ asiti NO˙ Nitrik oksit
1
O2 Singlet oksijen O2˙¯ Süperoksit radikali OH¯ Hidroksil radikali
PAL Fenilalenin amonyum liyaz
POD Peroksidaz
PUFA Çoklu doymamış yağ asiti RO˙ Alkoksil radikali
ROO˙ Peroksil radikali ROS Reaktif oksijen türleri SFA Doymuş yağ asiti SOD Süperoksit dismutaz USFA Doymamış yağ asiti
1. GĐRĐŞ ve LĐTERATÜR ÖZETĐ
Börülce Afrika, Asya ve Latin Amerika’nın kurak ve yarı kurak bölgelerinde temel, ekonomik önemli ürünlerden biridir (Huang ve Bie, 2010). Tropikal kökenli olan bu bitki diğer yemeklik tane bitkilerin yetişemediği yüksek sıcaklıklarda yetişebilme özelliğine sahiptir. Börülce ekiminin % 99’u Afrika kıtasında ve bununda % 86’sını Nijer ve Nijerya oluşturur. Dünya da geniş ekim alanlarına rağmen birim alan verimi düşük olduğu için az üretimi olan baklagil bitkisidir (Özdemir, 2002).
Türkiye’de börülce daha çok Ege Bölgesi’nin bir ürünü olarak görülmektedir. Birinci derecede Isparta, Manisa ve Muğla’da daha sonra Denizli, Đzmir, Çanakkale ve Balıkesir’de yetiştiriciliği yapılır. Börülce yetiştirilen ikinci bölge Akdeniz Bölgesi olup Antalya ve Hatay’da yetiştiriciliği yapılmaktadır.
Ülkemizde 1.040.204 ha alan üzerinde yaklaşık 26 milyon ton kadar sebze üretilmektedir. Bunun 12.500 tonunu börülce oluşturmaktadır. Toplam börülce üretiminin 10.000 tonu taze, 2.500 tonu ise tane üretimidir. Ülkemizde börülce ekim alanının az olmasına neden olarak; bu bitkinin insan gıdası olarak memleketimizde pek fazla tanınmaması, birim alandan kaldırılan ürünün düşük oluşu, yurt içi börülce talebinin azlığı nedeniyle birim fiyatının düşmesi köylünün bu bitkinin kültüründen vazgeçerek daha kârlı bitkilere yönelmesi ve ihracat olanağının azlığı gösterilebilir (Ünlü ve Padem, 2005). Yemeklik tane baklagiller içinde bezelyeden sonra en az ekim alanı ve üretimi olan bir bitkidir.
Börülce tek yıllık bir bitkidir. Genel karakteri gereği sıcaktan hoşlanır. En iyi yetiştirme sıcaklığı 20-30 °C arasındadır. Yıllık yağış 600 mm kadar olan yerlerde sulamaya ihtiyaç duyulmaksızın yetişebilmektedir. Donlara karşı çok hassastır 1°C sıcaklıkta zarar görür. Kısa gün bitkisi olup fotoperyoda hassastır, optimum ışıklandırma süresi 8-14 saattir.
Morfolojik özellikleri ve yetişme koşullarının fasulyeye çok benzemesi, yakın zamana kadar börülcenin fasulye cinsi içerisinde bir bitki olarak sınıflandırılmasına neden olmuştur. Börülce Phaseoleceae familyası içerisinde yer almaktadır. Dünyada yaklaşık 150 kadar börülce türü bulunmaktadır.
Ülkemizde yetiştirilen börülce türü Vigna unguiculata (L.) Walp (Cowpea)’dır. Türk Standartları Enstitüsü tarafından yapılan sınıflandırmaya göre ülkemizde ak kız, karnıkara, sarı göbek ve kırmızı börülce (poyraz) çeşitleri yetişmektedir (Özdemir, 2002). Araştırmalarımızda börülcenin karnıkara ve poyraz çeşitleri kullanılmıştır. Çeşitli stres faktörleri bitkilerde aktifleşmiş oksijen türlerinin oluşmasına neden olurlar. Meydana gelen reaktif türler radikal olarak adlandırılır ve bu radikaller bitki dokularında çeşitli yüzeylere saldırarak hasarlara sebep olurlar. Radikallerin en fazla saldırdıkları yüzeyler, hücre membranlarında bulunan, çoklu doymamış yağ asitleridir. Doymamış yağ asitleriyle radikallerin etkileşimi sonucu hücre zarlarının doymuş ve doymamış yağ asidi oranları değişmektedir. Meydana gelen reaksiyonlar sonucunda MDA gibi çeşitli lipit peroksidasyon ürünleri oluşur. Tuz stresinin bir sonucu olan oksidatif stresin bitkilere etkisi sonucu meydana gelen radikaller, oluşan son ürünler ve yağ asidi oranlarındaki değişiklikler araştırmacılar tarafından incelenmektedir.
Cavalcanti ve ark. (2007) tarafından börülceye 200 mM NaCI uygulayarak kök ve yapraklardaki MDA değişimlerini araştırmışlardır. Tuz etkisinin sonucunda yaprak MDA miktarında tedrici bir artış görülmüşken, köklerde kontrol grubuna göre önemli derecede azalma meydana gelmiştir.
Vaidyanathan ve ark. (2003) tuz stresinin pirinç çeşitlerinde H2O2 ve MDA miktarlarında meydana getirdikleri değişiklikleri incelemişlerdir. Farklı konsantrasyonlarda uyguladıkları tuz stresine karşı strese toleranslı olan çeşitte tuz konsantrasyonlarına bakılmaksızın tüm uygulamalarda H2O2 içeriği değişmeden kalırken, tuza hassas olan çeşitte ise tuz miktarının artmasıyla H2O2 miktarı da artmıştır. MDA miktarında tuz miktarının artışına paralel olarak her iki çeşitte de artış görülmüş fakat dirençli türde daha az lipit peroksidasyonu oluşmuştur.
Peygamber çiçeği üzerinde tuz stresinin etkisini araştıran Radic ve ark. (2006) H2O2 ve MDA miktarlarına bakmışlardır. MDA ve H2O2 miktarı on günlük stres süresince gövdelerde artmış fakat köklerde kontrol gruplarına göre önemli bir değişim olmamıştır. Pirinç yapraklarına 200 mM NaCI stresinin H2O2 üzerine etkisi Lin ve Kao (2000) tarafından incelenmiştir. Tuz uygulamasının H2O2 birikimine neden olmamış ve lipit peroksidasyonunda da artış görülmemiştir.
Esfandiari ve ark. (2007) tuz stresinin iki farklı çeşit buğday fideleri üzerinde lipit peroksidasyonunun etkisini araştırmışlardır. Bu çeşitlerden birinde artan tuz konsantrasyonuna paralel olarak MDA miktarı da artmış fakat diğerinde değişiklik meydana gelmemiştir.
50 mM ve 100 mM NaCI uygulamasının susam kültürlerinde lipit peroksidasyon ve antioksidatif enzimler üzerine etkisi Koca ve ark. (2007) tarafından incelenmiştir. 40 günlük tuz uygulamasından sonra tuzluluğun neden olduğu oksidatif stresin üstesinden gelme yeteneği susam çeşitleri arasında farklılık göstermiştir. MDA miktarı her iki çeşitte de kontrol grubuna kıyasla tuz konsantrasyonunun artmasıyla artmıştır fakat tuza nisbi toleranslı olan çeşitte daha az lipit peroksidasyonu olduğunu bulmuşlardır.
Koca ve ark. (2006), Shalata ve Tal (1998) tuz stresinin Lycopersicon pennellii de lipit peroksidasyonu üzerine etkilerini çalışmışlardır. NaCI uygulaması sonucu direçli çeşitte düşük miktarda MDA tespit etmişlerdir. Bu sonucu antioksidatif enzim sisteminin iyi çalışmasından kaynaklanabileceğini ileri sürmüşlerdir.
Stres faktörlerinin bitki lipit peroksidasyonu üzerine etkisi, Demiral ve Türkan (2005), Dionisio-Sese ve Tobita (1998), Khosravinejad ve ark. (2008), Türkan ve ark. (2005), Gehlot ve ark. (2005), Ashraf ve ark. (2010) ve Neto ve ark. (2006) gibi araştırmacılar tarafından incelenmiştir.
Tuz stresinin bitkilerde yağ asidi oranlarında meydana getirdiği değişiklikler üzerinde literatürde fazla çalışma mevcut değildir. Salama ve ark. (2007) NaCI’ün mısır kültürlerinde plazma membran lipitlerinde meydana getirdiği değişiklikleri çalışmışlardır. Đki farklı mısır çeşidine 150 mM NaCI uygulanarak yapılan çalışmada total doymuş yağ asidi oranı stres durumunda artış göstermiştir. Tuz stresi membranlarda yağ asidi dağılımını etkileyerek doymuş/doymamış yağ asidi oranını azalttığını bildirmişlerdir.
Taarit ve ark. (2010) tuz stresi altında adaçayı yapraklarında temel yağ asidi ve temel yağ kompozisyonunda meydana gelen değişimler üzerine çalışma yapmışlardır. Bu çalışmada 100 mM NaCI de total yağ asidi içeriği % 32 oranında azalmıştır. Bununla beraber artan tuz stresiyle tekli doymamış yağ asitleri oranı artarken çoklu doymamış yağ asitleri azalmıştır.
Tuz stresinde kişniş yapraklarında temel yağ ve yağ asidi kompozisyonunda meydana gelen değişimler Neffati ve Marzouk (2008) tarafından çalışılmıştır. Tuzluluk total yağ asidi içeriğini üst ve alt yapraklarda önemli oranda azaltmıştır. NaCI konsantrasyonunun artmasıyla doymamış/doymuş yağ asidi oranında azalmaya neden olduğu araştırmacılar tarafından bildirilmiştir.
Hamed ve ark. (2005) halofit kaya koruğu bitkisinde tuz stresi altında yağ asidi profillerindeki değişimleri araştırmışlardır. Tuz stresi membran total yağ asidi kompozisyonunda önemli bir değişikliğe neden olmamıştır. Elkahoui ve ark. (2004)
Catharanthus roseus hücre süspansiyon kültürlerinde tuz stresinin lipitlerde oluşturduğu
değişiklikleri çalışmışlardır. 100 mM NaCI de 16:0 olan palmitik asit oranında azalma, 18:2 linoleik asit oranında artma meydana gelmiştir.
Literatürlerde tuz stresinin börülce bitkisinde yağ asidi kompozisyonu üzerine etkisiyle ilgili çalışmalara rastlanmamıştır. Bu çalışmada karnıkara ve poyraz börülce çeşitlerinde tuz uygulamalarının kök ve yapraklardaki yağ asidi kompozisyonu ve yüzdesi, lipit peroksidasyonu ve H2O2 miktarı üzerine etkileri araştırılmıştır.
1.1. Stres ve Stres Çeşitleri
Dünya nüfusu hızlı bir şekilde artarken 2050 yılı sonu itibariyle yaklaşık 9 milyar olacağı tahmin ediliyor. Diğer taraftan insanoğlu için vazgeçilmez olan gıda üretimi çeşitli stres faktörleri tarafından olumsuz etkilenmektedir. Artan gıda talebinin üstesinden gelmek tüm ulusların temel ilgi alanlarından biri olmaktadır (Mahajan ve Tuteja, 2005).
Bitkisel üretimde stres; bitkinin yaşadığı ortamda bir veya birden fazla etkenin, büyüme ve gelişmeyi olumsuz yönde etkileyerek, verim düşüklüğü ile sonuçlanan bir dizi gerilemeye neden olarak algılanmaktadır (Kuşvuran ve ark., 2008). Bitkiler yaşamları sürecinde birçok stres faktörü ile karşılaşmaktadırlar. Bitki üzerinde ender olarak tek başlarına etki yapabilen bu stres faktörleri, genellikle etkilerini eş zamanlı olarak gerçekleştirmektedir (Kalefetoğlu ve Ekmekçi, 2005).
Tablo 1.1. Bitkileri etkileyen stres faktörleri
STRES FAKTÖRLERĐ
Abiyotik stres faktörleri Biyotik stres faktörleri Soğuk Sıcaklık Tuzluluk Kuraklık Radyasyon Kimyasallar ve kirleticiler Rüzgar
Toprakta besin eksikliği
Patojenler Böcekler Otçullar Kemiriciler
Bitkilerde strese neden olan etmenler genel olarak biyotik ve abiyotik stres faktörleri olarak ikiye ayrılır. Abiyotik etmenler canlı dışı durumların oluşturduğu olumsuz şartlar olup bitkilerde önemli ürün kayıplarına neden olmaktadırlar. Abiyotik stres faktörleri; soğuk, sıcaklık, tuzluluk, kuraklık, radyasyon, kimyasallar ve kirleticiler, oksidatif stres, rüzgâr ve topraklardaki besin eksikliği sayılabilir. Biyotik etmenler ise patojenler, böcekler, otçullar ve kemiriciler gibi çeşitli canlı faktörlerinin bitkilere verdiği hasarlardır.
Biyotik ve abiyotik stres etmenleri bitkilerde ürün azalmasına neden olarak insan ve hayvanların beslenmelerini olumsuz şekilde etkilemektedir. Abiyotik stres morfolojik, fizyolojik, biyokimyasal ve moleküler değişimlere neden olarak bitki büyüme ve verimliliğini olumsuz etkilemektedir (Yıldız ve Terzi, 2007). Abiyotik stres ürün verimini azaltmakta ve bu ürün kıtlığından dolayı her yıl milyonlarca dolar değerinde kayıplar oluşmaktadır (Mahajan ve Tuteja, 2005). Abiyotik etmenler bitkilerde %51 ile % 82 arasında değişen büyük ürün kayıplarına neden olmaktadır (Kacar ve ark., 2006). Gerçekte bu stresler, sürdürülebilir tarım endüstrisini tehdit etmektedir.
Tablo 1.2. Optimum çevre koşullarında farklı bitkilerden alınan ürünlerin abiyotik stres etmenleri sonucu kaybolan ürün miktarları (Kacar ve ark., 2006).
Bitki Optimum ürün miktarı, kg ha¯¹ Elde edilen miktarı, kg ha¯¹ Biyotik stres sonucu kaybolan ürün miktarı, kg ha¯¹ Abiyotik stres sonucu kaybolan ürün miktarı, kg ha¯¹ Abiyotik stres sonucu kaybolan % miktar Arpa 11 400 2 050 760 8 590 75.4 Buğday 11 500 2 880 720 11 900 82.1 Yulaf 10 600 1 720 920 7 960 75.1 Mısır 19 250 4 600 1 950 12 700 66.0 Sorgum 20 080 2 830 1 050 16 200 80.7 Soya fasulyesi 7 390 1 610 660 5 120 69.3 Patates 94 100 28 300 14 900 50 900 54.1 Şeker pancarı 121 000 42 600 42 600 61 300 50.7
Bitkiler maruz kaldığı stres etmenlerine karşı metabolik değişiklikler gerçekleştirerek stres hasarını en aza indirgemeye çalışırlar. Oluşturdukları cevaplar ya stresten kaçınma veya dayanıklılık mekanizmaları geliştirerek etkisi altında kaldıkları faktörlerin hasarını azaltırlar.
Bitkilerde çeşitli genler stres faktörlerine cevap olarak düzenlenir. Biyoteknolojik ve gen aktarımı teknikleriyle strese dayanıklı bitkiler geliştirilerek üretime sokulmasıyla yaşadığımız beslenme sorunlarının çözümüne yönelik adımlar atılmaya başlanmıştır.
1.1.1. Stres
Biyolojik olarak stres, bitkiler gibi biyolojik sistemin varlığını ve normal fonksiyonunu engelleyen olumsuz şartlardır. Stres bitkide büyüme ve gelişmeyi olumsuz etkiler, ürün kaybına ve bitkinin tamamen veya bazı organlarının yaşamını yitirmesine neden olur.
Bitkiler stres faktörlerinden tamamen aynı oranda etkilenmezler. Bir biyolojik durum, bir bitki için stres oluştururken diğeri için optimum olabilir. Bir bitki aynı ortamda yaşamını en iyi şekilde devam ettirebilirken, diğeri bu ortamdan etkilenerek gelişiminde yavaşlama meydana gelebilir. Bu gibi durumlar bitki çeşidine göre değişmektedir. Bitkiler strese cevap oluştururken hücresel veya tüm bitki yüzeylerinde değişiklikler meydana getirerek yanıt verirler. Bunlar gen aktivasyonu, bazı proteinlerin sentezi, yapraklarda küçülme, stoma sayısının azalması, kutikula kalınlaşması, ozmolit birikimi ve tuz keselerinin oluşması gibi çeşitli cevaplardır.
Strese karşı oluşturulan cevaplar; türe, genotipe, su kaybı şiddetine ve uzunluğuna, bitkinin gelişme durumuna, yaşına, organ ile hücre tipine ve hücresel kompartmanlaşmaya bağlı olarak değişmektedir. Oluşturulan cevaplar protein fosforilasyon derecesinde meydana gelecek bir değişiklikse birkaç saniye, gen ifadesinde meydana gelecek değişiklikse dakikalar veya saatler sürebilir (Kalefetoğlu ve Ekmekçi, 2005).
1.1.2. Tuz Stresi
En önemli stres faktörlerinden biri olan tuzluluk bitkilerde büyüme, gelişme ve ürün miktarını olumsuz şekilde etkiler. Tuzluluk genelde kurak ve yarı kurak bölgelerde görülür. Yağışlı bölgelerde ise tuzlar yıkanarak yer altı sularına karışır ve daha sonra da akarsularla denizlere taşınır. Bu nedenle tuzluluk yağışlı bölgelerde nadir olarak görülür (Kacar ve ark., 2006).
Günümüzde, çoğu yörelerde doğal kaynakların azalması veya kirlenmesi, düşük kaliteli tuzlu suların kullanımını zorunlu duruma getirmiştir. Tarım alanlarında sulamada kullanılan sular, mutlaka bünyelerinde belirli miktarlarda çözünmüş katı madde kısaca tuz içerirler. Tuzluluk dünya tarım alanlarının 930 milyon ha’ya denk gelen % 7’sini etkiler (Munns, 2002). Ülkemizde ise yapılan arazi etütlerine göre sulanabilir özellikteki 12.5 milyon ha arazinin yaklaşık 1.5 milyon hektarında tuzlu ve sodyumlu topraklar, 2.8 milyon hektarında ise yaş topraklar oluşmuştur. Bu rakamlara göre sorunlu araziler sulanabilir özellikteki alanlarımızın üçte birini kapsamaktadır (Öztürk, 2003).
Tablo 1.3. Türkiye topraklarının tuzluluk derecesi ve alanları (Öztürk, 2003).
Tuzluluk derecesi Alan (ha) Toplamdaki %’si
Hafif Tuzlu 614 617 41
Tuzlu 504 603 33
Alkali 8 641 0.5
Hafif Tuzlu Alkali 125 863 8
Tuzlu Alkali 264 958 17.5
Toplam 1 518 722 100
Tuzluluk, tarım yapılan alanlarda verimliliği olumsuz yönde etkileyen önemli bir etmendir. Tarım topraklarının önemli sorunlarından biri olan tuzluluk ve alkalilik son yıllarda sulamaya paralel olarak yetersiz drenaj ve sulama suyunun kalite özelliği nedeniyle giderek artmaktadır. Ülkemizde toplam olarak 2 749 057 hektarlık bir alan
kaplayan drenaj sorunu olan alanların 1 513 645 hektarında tuzluluk ve alkalilik sorunu görülmektedir. Drenaj bozukluğu gösteren topraklar ise genellikle kıyı ve Đç Anadolu ovalarında görülmektedir (Özcan ve ark., 2000).
Buharlaşma ve terleme yoluyla topraktan su kaybının fazla olduğu alanlarda toprak yüzeyinde tuz birikir. Ayrıca iyi drenaj sağlanmadan yapılan tarla sulamaları tuzluluğun artmasına neden olmaktadır. Sulama suyunda çözünmüş madde konsantrasyonu fazla ise ve biriken tuzlar drenaj sistemiyle yıkanmazsa, tuzluluk tuza hassas türlere zarar vermeye başlar (Taiz ve Zeiger, 2008).
Yüksek tuz konsantrasyonu, özellikle Na⁺, toprak gözeneklerinde birikerek toprak su iletiminde azalmaya neden olur. Topaklarda yüksek tuz varlığı düşük su potansiyeli zonu oluşturarak bitkiler için su ve besin maddeleri alımını zor hale getirir. Bu yüzden, temelde tuz stresi bitkilerde su eksikliğiyle sonuçlanır ve fizyolojik kuraklık durumu ortaya çıkar.
Toprak tuzluluğu kavramı, birim hacimdaki toprakta bulunan çözünebilir tuzların miktarını belirtir. Genellikle Cl¯ ve SO4¯2 anyonlarının iki değerlikli katyonlarla, özellikle Ca⁺2, toprağın tuz içeriği laboratuar koşullarında, elektrik geçirgenlik ölçüm cihazıyla belirlenir. Toprak tuzluluk seviyesi ve bitkilerin bu tuzluluk oranlarına tepkisi Tablo 1.4. deki gibi sınıflandırılır.
Tablo 1.4. Toprakların elektriksel iletkenlik (EC) değerlerine göre tuzluluk derecesi ve bitkilerin tepkileri
Tuzluluk, E.C. (25 0C’de dS/m) Bitki Tepkisi
0-2 Çok az tuzlu Tuzluluğun etkisi genelde ihmal edilebilir 2-4 Az tuzlu Çok duyarlı bitkilerin ürün verimleri
düşebilir
4-8 Tuzlu Birçok bitkinin ürün verimi düşer 8-16 Çok tuzlu Tuza dayanıklı bitkiler normal ürün
verebilir
> 16 Aşırı tuzlu Tuza çok dayanıklı birkaç bitki ürün verebilir
Aşırı tuzluluk, stres altındaki bitkinin yaşaması için gerekli biyokimyasal ayarlamayı yapması ve topraktan suyu alması için harcaması gereken enerjiyi artırarak bitki gelişmesini azaltmaktadır. Bitki, yaşaması için harcadığı bu enerjiyi, büyüme ve verim için kullanacağı enerjiden sağlamakta ve verimde azalmalar ortaya çıkmaktadır. Bitkilerin tuzluluğa dayanımı, kök bölgesindeki eriyebilir tuzların belli bir seviyesi için elde edilen verim ile tuzlu olmayan koşullarda elde edilen verimin karşılaştırılması olarak açıklanabilir. Dolayısıyla bitki tuz toleransı, bitkilerin yetişme koşullarına bağlı oransal bir değerdir.
Yüksek tuzluluğun bitkiler üzerindeki zararlı etkileri bitkinin ölümü ve/veya üretimin düşmesi şeklinde gözlenebilir. Birçok bitki türü ya hücrelerine tuzu almayarak ya da tuzu hücre içinde tolere edecek mekanizmalar geliştirmişlerdir. Tuz stresi etkisinde fotosentez, protein sentezi, enerji ve lipit metabolizması etkilenir. Esas anlamda tuz stresine ilk cevap yaprak yüzey alanının büyümesinde azalma şeklinde kendini gösterir. Hücre büyümesi için gerekli olan karbonhidratlar fotosentez esnasında sağlanır. Fotosentez oranları bitki tuz stresi (özellikle NaCl stresi) altında iken genelde düşüktür (Doğan, 2005).
Bitki hücrelerinde tuz stresiyle meydana gelen hasarların nedenleri,
• Na⁺ hücre metabolizması için toksiktir ve bazı enzimlerin fonksiyonlarını inhibe eder,
• Yüksek Na⁺ yoğunluğu ozmotik dengesizlik, membran düzensizliği, hücre bölünme, büyüme ve çoğalmasında yavaşlamalara neden olur,
• Yüksek Na⁺ seviyesi fotosentezi yavaşlatarak reaktif oksijen türlerinin artmasına neden olur (Mahajan ve Tuteja, 2005).
Tuz stresi bitki gelişimini, fotosentezi yavaşlatır ve su dengesini bozar. Tuzun verdiği hasarlara karşı bitkiler faklı adaptasyonlar kazanır.
1.1.3. Tuzluluk Bitkilerde Büyüme ve Fotosentezi Baskı Altına Alır
Bitkiler tuza olan duyarlılıklarına göre temelde iki gruba ayrılırlar. Halofitler tuzlu topraklara özgü olup tüm yaşam devrelerini bu topraklarda devam ettirirler. Glikofitler
ise tuzlu topraklara halofitler kadar dirençli olmayıp tuza karşı duyarlı bitki gruplarını oluştururlar. Aşırı tuz stresi bitkilerde bodur büyümeye ve kök sistemlerinin gelişmesinde yavaşlamalara neden olur. Tomurcuk oluşumu azalır, topraküstü organların ve yaprakların gelişiminde yavaşlamalar meydana gelir. Tuz etkisinden dolayı hücrelerin ölmesi köklerde, tomurcuklarda, yaprak kenarlarında ve büyüme uçlarında sararmalar meydana gelir (Kacar ve ark., 2006). Kloroplastlarda yüksek konsantrasyonda Na⁺ ve/veya Cl¯ birikince fotosentez engellenir. Karbohidrat metabolizması ve fotofosforilasyon tuza karşı hassastır. Hassasiyet bu mekanizmalarda rol alan enzimlerin tuzluluğa duyarlılığından ileri gelir (Taiz ve Zeiger, 2008).
1.1.4. Tuzluluk Bitkilerde Ozmotik Dengeyi Bozar
Köklenme bölgesinde çözünmüş olarak bulunan maddeler, düşük ozmotik potansiyele sahiptirler. Düşük ozmotik potansiyel toprağın su potansiyelini düşürür. Dolayısıyla tuz konsantrasyonu arttıkça bitki topraktan daha az su alır. Ortamda Na⁺, Cl⁻ ve SO₄⁻ iyonlarının artması protoplazma iyon dengesinin bozulmasına neden olarak iyon toksitesi sorunu ortaya çıkar. Normal topraklarda bitki sitosolü 100-200 mM K⁺ ile 10 mM Na⁺ içerir (Taiz ve Zeiger, 2008). Na⁺’un K⁺’a oranının artması enzimleri etkisizleştirir, protein sentezini engeller, membran permeabilitesi azalır ve kloroplastlar zarar görür.
1.2.1. Bitkiler Tuz Zararını Azaltmak Đçin Farklı Adaptasyonlar Geliştirirler
Bitkilerin tuza tolerans kazanabilmesi için hem iyonik hem de ozmotik denge gereklidir. Hücre içi iyon dengesi toksik iyon alınımını ve iyonların vakuolde kompartmentalizasyonunu sağlayan belirleyicileri gerektirir. Vakuolde iyon birikimini ozmotik düzenleme sağlar. Ozmotik düzenleme hücre içi homeostazi için sitosolde ozmolitlerin birikimiyle sağlanır. Tuz stresinden sonra ozmotik ve iyonik dengenin kurulması yalnız hücre ölümünü önlemez aynı zamanda büyüme ve yaşam döngüsünü tamamlamak için gerekli fizyolojik ve biyokimyasal reaksiyonların devamını sağlar (Jenks ve Hasegawa, 2005).
Tuzlu topraklarda yetişen bitkiler bünyelerine fazla miktarda tuz almışlarsa, transpirasyon yoluyla tuzları üst organlarına doğru taşırlar. Bitkiler tuzun zararlarını en aza indirgemek için, sürgünlerden, meristemlerden ve yapraklardan tuzu dışarı atarlar. Tuz sediri, tuz çalısı ve Atriplex halimus (Deniz semizotu) gibi bazı bitkiler iyonları köklerden uzaklaştıramadıkları için yapraklarda tuz bezleri oluşturarak iyonlar zararsız hale getirilir (Şekil 1.2.). Halofitler yaprak hücrelerinde Na⁺ ve CI¯ iyonlarını biriktirseler de, üst organlarına taşınan tuz miktarı turgoru düzenlemek için ihtiyaç duyulan miktardan çok fazladır. Yapraklardan tuz bezleriyle fazla iyonların kaldırılması bitkiler için önemli bir mekanizmadır. Tuz, tuz bezlerine apoplastik ve simplastik yollarla taşınır (Pessarakli, 1999).
Şekil 1.2. Atriplex halimus ve tuz bezinin yapısı (Pessarakli, 1999).
Bitkiler tuz stresinin üstesinden gelmek için değişik moleküler ve biyokimyasal mekanizmalar geliştirmiştir. Tuzluluğa adaptasyonu sağlamak için prolin, glisinbetain, trehaloz ve mannitol gibi çeşitli organik maddeler sentezleyerek moleküler olarak su potansiyellerini ayarlamaya çalışırlar. Biyokimyasal mekanizmalar iyonları seçici biriktirme veya kabul etmeme, kökler tarafından iyon alınımının kontrolü ve yapraklara transportu, hücresel ve tüm bitki düzeyinde iyonların kompartmantalizasyonu, uyumlu
bileşiklerin sentezi, fotosentetik yolda değişme, membran yapısında değişme, antioksidan enzimlerin bitki hormonlarının indüksiyonunu içerir (Parida ve Das, 2005).
1.2.1. 1. Đyon Düzenlenmesi ve Lokalizasyonu
Bitkilerde iyon alınımı ve lokalizasyonunun dengelenmesi tuzlu koşullarda daha da önem kazanır. Gerek glikofit gerekse halofit bitkiler sitoplazmada yüksek miktarlarda tuzu tolere edemezler. Bu nedenle aşırı tuzu ya vakuolde tutarlar ya da farklı dokularda metabolik fonksiyonlarda kullanmak için lokalize ederler. Glikofitler sodyum alınımını sınırlandırır ya da yaşlı dokuları depo komponenti gibi kullanarak sodyumu biriktirirler (Doğan, 2005).
NaCl bitkilerin en fazla karşılaştıkları tuz olduğundan, Na⁺’un vakuolde birikimini kolaylaştıran taşınım sistemleri mevcuttur. NHX (vakular Na⁺/H⁺ değiştiricisi) fazla sodyum iyonlarının kofulda birikmesini sağlar. Ca⁺ ve K⁺ hücre içi Na⁺ konsantrasyonunu etkiler. Yüksek Na⁺ konsantrasyonlarında, K⁺ alımı, HKT1ile engellenir. HKT1, Na⁺’a ilgisi fazla olan bir K⁺-Na⁺ taşıyıcısıdır. Kalsiyum ise K⁺/Na⁺ seçiciliğini ve dolayısıyla bitkilerin tuza toleransını artırır (Taiz ve Zeiger, 2008). HKT1’in Na⁺’a ilgisi düşük olduğundan Na⁺’un sitoplazmaya girişi engellenir.
1.2.1.2. Uyuşabilir Bileşiklerin Biyosentezi
Sitoplazmadaki ozmotik denge metabolik etkileşim göstermeyen, uyuşabilir ozmolit olarak adlandırılan, organik solutların birikimiyle sağlanır. Bu solutların fonksiyonu ozmotik dengeyle sınırlı değildir. Bunlar tipik olarak hidrofiliktir ve proteinlerin veya membranların yüzeyinde suyun yerini alabilir ve böylece düşük molekül ağırlıklı şaperonlar olarak görev yaparlar. Ayrıca, bu solutlar reaktif oksijen türleri (ROS) giderici olarak hücresel yapıları korurlar (Jenks ve Hasegawa, 2005). Bunlar biyokimyasal reaksiyonlarda suyun yerini alırlar. Bu uyuşabilir bileşikler prolin, glisin betain, karbohidratlar ve poliollerdir.
Polioller, küçük moleküler ağırlıklı şaperonlar ve stres tarafından oluşturulmuş reaktif oksijen radikallerinin temizlenmesinde görev yapan uyuşabilir bileşiklerdir. Polioler siklik (örneğin pinitol) ve asiklik (örneğin mannitol) olarak sınıflandırılır. Bir alkol şekeri olan ve tuz stresinde uyuşabilir bir solut olan mannitol, kerevizde mannoz-6-fosfat redüktaz enziminin etkisiyle sentezlenir. Pinitol ononitol epimeraz ve inositol-o-metiltransfreaz enzim yoluyla miyo-inositolden sentezlenir. Polioller osmotik ayarlama ve ozmoprotektan olarak fonksiyon yaparlar. Ozmotik ayarlamada sitoplazmada suyun alıkonmasını kolaylaştırıcı ozmolitler olarak ve sodyumun apoplast ve vakuollerde tutulmasını sağlarlar. Ozmolitler; protein kompleksler, membranlar veya enzimler ile etkileşerek hücresel yapıları korumaktadır. Bu bileşikler, artan iyonik stresin olumsuz etkilerinden makromolekülleri korumak için hidrojen bağlarına sahiptirler (Parida ve Das, 2005).
Glukoz, fruktoz, sukroz, fruktanlar ve nişasta gibi karbohidratlar tuz stresi altında biriktirilir. Bunların önemli foksiyonları ozmotik koruma, ozmotik ayarlama, karbon depolama ve radikal temizlemedir. Tuz stresinin birçok bitkide indirgen şekerleri (glukoz ve fruktoz), sukroz ve fruktanları artırdığı bildirilmiştir.
Bitkiler tuz stresi altında azot içeren bileşikleri (NCC) de biriktirirler. Azot içeren bileşiklerin en önemlileri aminoasitler, amidler, proteinler, kuaterner amonyumlu bileşikler ve poliaminlerdir. Spesifik azot içeren bileşikler bitkilerin değişik yerlerinde tuzlu ortamlarda biriktirilirler. Stres şartlarında bu bileşikler ozmotik ayarlama, makro moleküllerin korunması, azot depolanması, hücresel pH’nın korunması, hücrelerin detoksifikasyonunda ve serbest radikallerin temizlenmesinde işlev yapmaktadırlar. Bu bileşiklerin birikimi genellikle tuz stresi ile korelasyon gösterir. Tuz stresine bırakılan bitkilerin serbest aminoasit ve diğer azot içeren bileşiklerin birikimi ile ilgili birçok rapor vardır. Glisin betain içeriği birçok bitkide tuz stresinde artmıştır. Birçok bitki tuzlu şartlarda toksik olmayan ancak koruyucu ozmolit olarak görev yapan prolin biriktirir. Uyuşabilir bileşikler hücre içi biyokimyayı bozmadan yüksek miktarlarda biriktirilebilirler. Bu bileşikler tuz stresi altında enzimlerin normal aktivite gösterebilmesi için koruyucu rol oynamaktadırlar (Parida ve Das, 2005).
1.2.1.3. Antioksidan Enzimlerin Đndüksiyonu
Tuz stresi hücresel düzeydeki mevcut suyun ozmotik olarak bağlanmasına ve bitkilerin fizyolojik olarak karışıklığa girmesine neden olur (Doğan, 2005). Su eksikliği süperoksit, hidrojen peroksit, hidroksil radikali ve singlet oksijen (O2), gibi reaktif oksijen türlerinin sitoplazmada hızlı artmasına yol açar. Bu sitosolik aktive edilmiş oksijen türleri lipidler, protein ve nükleik asitlerde oksidatif hasar yoluyla normal metabolizmayı ciddi bir biçimde bozabilir. Đnternal O2 konsantrasyonları fotosentez sırasında yüksek olduğundan kloroplastlar genellikle aktive edilmiş oksijen türlerini üretme eğilimindedirler. Süperoksit üretildiğinde enzimatik ya da enzimatik olmayan reaksiyonlarla hızlı bir şekilde hidrojen peroksit (H2O2) ve O2’ye dönüştürülür.
Bitkiler reaktif oksijen türlerine çeşitli seviyelerde antioksidanlarla karşı koyarlar. Metaloenzim süperoksit dismutaz süperoksidi H2O2’ye dönüştürür. Katalaz ve çeşitli tipteki peroksidazlar H2O2’nin parçalanmasını katalizler. Katalaz kloraplastlarda olmadığından dolayı bu organelde hidrojen peroksit askorbata, askorbat-glutatyon döngüsü yoluyla, detoksifikasyona uğratılabilir. Askorbat ve glutatyonun her ikisinin de kloroplastlarda milimolar düzeylerde olduğu rapor edilmiştir. Askorbat okside α-tokoferolün α-kromoksil radikalinin bir indirgeyicisi gibi işlev yaparak ya da süperoksit radikali ile direkt reaksiyona girme yoluyla da okside edebilir. Tilakoid membranlar α-tokoferol bakımından zengindir. Bu antioksidan sadece süperoksitle reaksiyona girmez, bunun yanında hidroksil, peroksil ve alkoksil radikallerinin temizlenmesine de yardımcı olur (Parida ve Das, 2005).
Tuz stresi altındaki bitkilerde antioksidan enzimlerin aktivitesi artar ve bu enzimlerin seviyesi tuz stresinin varlığıyla korelasyonludur. Soya fasulyesi kök nodüllerinde, tuz stresi altında, askorbat peroksidaz, katalaz, glutatyon redüktaz aktivitekeri azalmış, süperoksit dismutaz artmış ve malondialdehit, total protein değişmeden kalmıştır (Parida ve Das, 2005).
1.2.1.4. Tuza Tolerans Fonksiyonel Genetik Yaklaşım Yoluyla Belirlenir
Tuza tolerans sağlayan genler iki fonksiyonel grupta katogarize edilir. Birinci grup efektörleri kodlayan genlerdir. Bunlar stresten kaçınım veya adaptasyon için gerekli
olan işlemlerden sorumludur. Đkinci grup düzenleyici genler birinci grup efektör genlerin ifadesini ve aktivitesini kontrol eder. Efektörler, taşıyıcılar gibi, sitoplazmik yüksek Na⁺’dan hücreleri koruyarak fonksiyon yapan proteinler, çeşitli uyuşabilir solutların biyosentezini gerektiren enzimler, LEA proteinleri, şaperonlar ve detoksifikasyon enzimlerini içerir. Regülatör moleküller trankripsiyon faktörleriyle ilgili protein kinaz ve enzimler gibi sinyal düzenleyicilerden oluşur (Jenks ve Hasegawa, 2005).
Tuz stresine toleranslı bitkilerin yetiştirilmesi için izlenebilecek biyoteknolojik bir yol diğer canlılar tarafından üretilen koruyucu bir protein veya enzimi kodlayan genlerin transferidir. Çeşitli genler bitkilere aktarılarak stres faktörlerine karşı direnç kazanarak stres faktörlerinin üstesinden gelmişlerdir (Tablo 1.5.).
Tablo 1.5. Gen aktarımı yoluyla tuza toleransı tanımlanan bitkiler (Jenks ve Hasegawa, 2005)
Adı Tür
Kaynağı
Gen Ürünü Fonksiyonu Tanımlama Metodu
Bitki ProDH A. thaliana Prolin
dehidrogenaz
Prolin
degradasyonu
Antisens Arabidopsis BADH D. carota Betain aldehit
dehidrogenaz
Betain sentezi Gen ifadesi Havuç GS2 O. sativa Glutamin
sentetaz
Glutamin sentezi Gen ifadesi Pirinç Glyl O. sativa Glioksilaz Metilglioksial
detoksifikasyonu
Gen ifadesi Tütün AtNRTC A. thaliana NADPH
triodoksin redüktaz
ROS
detoksifikasyonu
Mutasyon Arabidopsis
HVA1 H. vulgare LEA proteini Protein korunması
Gen ifadesi Pirinç SOS5 A. thaliana Hücre yüzey
adezyon proteini
Hücre gelişimi Mutasyon Arabidopsis
NPK1 . tabacum MAPKK kinaz Sinyalizasyon Gen ifadesi Tütün
IMT1 M. crystalinum Miyoinosito-O-metil transferaz D-ononitol sentezi Gen ifadesi Tütün
Alfin1 M. sativa Transkripsiyon faktörü
Gen regülasyonu Gen ifadesi Alfalfa DREB1A O. sativa Transkripsiyon
faktörü
1.3. Bitkilerde Oksidatif Stres ve Serbest Oksijen Türleri
Dünya üzerindeki hayata ait önemli bir gizem de aerobik yaşamı destekleyen oksijen molekülünün yalnız enerji metabolizması ve solunum için önemli olmakla kalmayıp, aynı zamanda canlı için zararlı durumlara ve hastalıklara da zemin hazırlamasıdır. Yaşlanma, kanser vs. gibi birçok durumun temel sebebi oksijenin indirgenmiş formlarıdır (Toprak, 2007).
Oksijen, bütün aerobik organizmalarda, oksidatif reaksiyonlar için son oksidan olarak işlev yapmaktadır. Ancak, aerobik organizmaların yaşamsal bir bileşiği olan oksijen çok fazla olduğu zaman oldukça yıkıcı etkilere neden olmaktadır (Polat, 2007). Oksijenin canlılardaki toksik etkilerinin oksijen radikalleri olarak adlandırılan ve oksijenin vücuttaki metabolizması sırasında oluşan reaktif türlerden kaynaklanır. Başka moleküller ile çok kolayca elektron alışverişine giren bu moleküllere oksidan moleküller ya da reaktif oksijen türleri (ROS) de denmektedir. Serbest radikaller, hücrelerde endojen ve eksojen kaynaklı etmenlere bağlı olarak oluşan eşleşmemiş elektrona sahip, kısa ömürlü, kararsız, molekül ağırlığı düşük ve çok etkin moleküller olarak tanımlanırlar (Eryılmaz, 2007).
Serbest radikal bir veya daha fazla eşleşmemiş elektrona sahip olan herhangi bir tür olarak tanımlanır. Oksijen ve oksijen türevli radikallerden başka pek çok radikal canlı organizmalarda serbest radikal olarak üretilir (Halliwell ve Gutteridge, 1998). Bitkilerde reaktif oksijen türlerini üreten pek çok yer vardır. Herhangi bir elektron taşınım veya transferinin olduğu yerler ise potansiyel ROS üretici kaynaklardır. Fotosentezin gerçekleştiği kloroplastlarda suyun oksidasyonu sırasında, mitokondride elektron transferi gerçekleşirken aktifleşmiş oksijen türleri oluşur. Bununla birlikte peroksizom, endoplazmik retikulum, vakuol ve plazma membranlarında reaktif oksijen türleri meydana gelir (Şekil 1.3.).
Eğer iki serbest radikal karşılaşırsa, bir kovalent bağ oluşturmak için eşleşmemiş elektronlarını paylaşırlar ve sonuçta yeni oluşan ürün non-radikaldir.
NO˙ + O2˙⁻ ONOO⁻ (peroksinitrit) (1.1)
Ancak bir serbest radikal bir non-radikalle reaksiyona girerse yeni radikaller oluşur ve zincir reaksiyon devam eder.
Bir radikal C – H bağından hidrojen atomunu çıkarabilir. Hidrojen atomu yalnız bir elektrona sahip olduğu için karbonda eşleşmemiş bir elektron bırakır. Örneğin, hidroksil radikali yağ asitinin hidrokarbon yan zincirinden hidrojeni çıkararak lipit peroksidasyonunu başlatır.
̶ CH + OH˙ ̶ C˙ + H2O (1.2) Ortaya çıkan karbon merkezli radikal genellikle O2 ile reaksiyona girerek peroksil radikalini oluşturur. Sonuçta lipit peroksidasyon zinciri ilerleyerek devam eder (Hallıwell ve Gutterıdge, 1998).
̶ CH + O2 ̶ C – O – O˙ (1.3)
Şekil 1.3. Bitkilerde serbest oksijen radikallerinin (ROS) metabolik kaynakları (Gechev ve ark., 2006).
Moleküler oksijen biradikal olup dış yörüngesinde eşleşmemiş iki elektron çifti bulundurmaktadır. Đki elektron farklı yörüngelerde olduğu zaman, oksijen sadece her seferde bir elektron ile tepkimeye girebilir, bu yüzden bağlanma çok reaktif değildir. Dış orbitallerden her biri birer elektron kabul etmektedir. Bu orbitallerin tek elektron alması ile süperoksit anyonu, iki elektron alması ile peroksi anyonu (O22⁻) oluşmaktadır. Oluşan peroksi anyonu ortamdan iki proton alarak hidrojen peroksiti (H2O2) oluşturmaktadır. Moleküler oksijen eşleşmemiş elektron çiftleri ile tepkimeye girebilen güçlü aktifleşmiş oksidan türleri oluşmaktadır (Polat, 2007).
Serbest radikaller, bulunduğumuz çevrede çeşitli fiziksel etkenler ve kimyasal olaylar nedeniyle devamlı oluşmaktadır. Hücrelerde de ciddi bir miktarda ve çeşitlilikte radikal üretilmektedir. Nerede ve nasıl üretildiklerine bakılmaksızın radikaller başlıca 3 temel mekanizma ile oluşur.
I. Kovalent bağların homolitik kırılması ile;
Yüksek enerjili elektromanyetik dalgalar ve yüksek sıcaklık (500-600°C) kimyasal bağların kırılmasına neden olmaktadır. Kırılma sırasında bağ yapılarındaki iki elektronun her biri ayrı ayrı atomlar üzerinde kalıyorsa, bu tür kırılmaya homolitik kırılma denir ve her iki atom üzerinde de paylaşılmamış elektron kalmaktadır. Organik moleküllerdeki bağların heterolitik kırılması durumunda zıt yüklü iyon çiftleri oluşmaktadır ve bu türler de reaktiftir.
II. Formal bir molekülün elektron kaybetmesi ile;
Radikal özelliği bulunmayan bir molekülden elektron kaybı sırasında dış orbitalinde paylaşılmamış elektron kalıyorsa, radikal formu oluşmaktadır.
III. Formal bir moleküle elektron transferi ile;
Radikal özelliği taşımayan bir moleküle tek elektron transferi ile dış orbitalinde paylaşılmamış elektron oluşturuluyorsa, bu tür indirgenme radikal oluşumuna neden olmaktadır (Demirci, 2006).
Singlet oksijen (1O2), hidrojen peroksit (H2O2), süperoksit (O2.⁻), hidroksil (OH˙) ve perhidroksil (HO2⁻), alkoksil (RO˙), peroksil (ROO˙) radikaleri ve organik
hidroperoksid (ROOH) gibi reaktif oksijen türleri (ROS), birçok fizyolojik işlev için çok önemli olup genellikle hücre içerisinde biyokimyasal antioksidanlar ile denge halinde bulunmaktadır. Büyük oranlarda, fizyolojik ve kimyasal streslere maruz kalmak ROS miktarını artırır ve normal fonksiyonların bozulmasına yol açar. Bu durum oksidatif stres olarak tanımlanır (Polat, 2007).
Serbest radikaller en sık lipid yapılarla oluşmaktadır. Doymamış yağ asitlerinin alil grubundan bir hidrojen çıktığında lipid radikali meydana gelmektedir. Oluşan lipid radikali oksijen ile reaksiyona girerek ve lipid peroksi radikalini oluşturmaktadır. Lipid peroksi radikali diğer lipidlerle zincir reaksiyonu başlatmakta ve lipid hidroperoksitler oluşturmaktadır.
Bütün aerobik organizmalarda lipid peroksidasyonunun önlenmesi temel süreçtir. Çünkü lipit peroksidasyon ürünleri DNA hasarına neden olabilir. Lipit peroksidasyonu artıp antioksidan savunma azaldığında genellikle; epoksitler nükleofilik merkezlerle kendiliğinden reaksiyona girmektedir ve bu yüzden DNA, RNA ve proteinlere kovalent olarak bağlanmaktadır (Demirci, 2006).
Tablo 1.6. Başlıca reaktif oksijen türleri (ROS)
1.3.1. Superoksit Radikali (O2˙⁻)
Süperoksit radikali mikrozomal ve mitokondrial elektron taşıma sistemlerinin dahil olduğu birçok hücresel yollarda oluşur. O2·⁻ radikali hem oksitleyici hem de indirgeyici özelliklere sahiptir (Keser, 2005). Süperoksit anyonu bir elektron alarak moleküler
Radikaller Radikal olmayanlar
Superoksit radikali (O2˙⁻) Hidrojen peroksit (H2O2) Hidroksil Radikali (OH˙⁻) Lipit hidroperoksit (LOOH) Peroksil radikali (RO2˙) Hipoklorik asit (HOCI) Alkoksil radikali (RO˙) Ozon (O3)
Hidroperoksil radikali (HO2˙) Peroksinitrit radikali (ONOO˙)
oksijenin indirgenmiş şeklidir. O2·⁻ anyonu mitokondrial elektron taşıma sisteminde meydana gelen başlangıç serbest radikalidir. Mitokondri dört elektron zincir reaksiyonu kullanarak oksijenin suya indirgenmesiyle enerji üretir. Mitokondrinin zincir reaksiyonlarından çıkan elektronların bazıları doğrudan oksijen ile tepkimeye girer ve süperoksit anyonu meydana gelir (Lee ve ark., 2003).
Moleküler oksijen (O2) bir elektron alarak kararsız bir yapı olan superoksit O2·⁻ radikaline dönüşmektedir.
O2 + e⁻ O2·⁻ (1.4) Hücresel metabolik etkinlikler sonucunda üretilen superoksit radikalinin oluşumu pek çok çevresel stres faktörleri altında indüklenmektedir. Anyonik yapıdaki bu radikaller, taşıdıkları yükten dolayı hücre ve organellerin membranlarından geçemezler ve dolayısıyla etkilerini genellikle üretildikleri yerde gösterirler. Superoksit bileşikleri; fosfolipitlerin varlığı nedeniyle asidik yapıdaki membran yüzeylerinin hidrofobik ortamlarında daha uzun ömürlüdür ve çözünürlükleri daha fazladır. Düşük pH’da aktivitesi artan superoksit anyonu buradan kolayca bir proton alarak kendisinden daha kuvvetli bir oksidan olan perhidroksil radikalini (HO2˙) oluşturmaktadır. Superoksite göre çok daha reaktif olan bu radikal, membranlarda lipit peroksidasyonunu başlatabilmekte ve bazı antioksidan bileşikleri oksitleyebilmektedir (Eryılmaz, 2007; Kohen ve Nyska, 2002). Üretildikleri hücre kısmında etkisiz hale getirilmek üzere superoksit dismutaz (SOD) enziminin yüksek katalitik aktiviteleri ile daha az zararlı olan H2O2’e dönüştürülerek hücrelerde birikimine izin verilmemektedir.
O2·⁻ radikali Haber-Weiss reaksiyonunda H2O2’den ˙OH üretmek için geçiş metal iyonlarının bir indirgeni olarak görev yapar. Aynı zamanda kinonların bulunduğu ortamda radikal zincir reaksiyonları oluşturur. Kinonlar bitki hücrelerinde çok fazla bulunan kinon redüktazlar tarafından semikinonlara indirgenir. Đndirgenmiş semikinonlarda moleküler oksijeni indirgeyerek süperoksit üretirler. O2·⁻, semikinonların farklılaştırılmasıyla üretilen kinonları yeniden semikinon oluşturmak için oksitler. Zincir reaksiyonlar SOD ile etkili bir şekilde sonlandırılır (Keser, 2005).
Şekil 1.4. Hücrelerde oksidatif ve antioksidatif sistem (Nordberg ve Arner, 2001).
1.3.2. Hidrojen Peroksit (H2O2)
H2O2 çoğu hücrede 10-100 µM seviyesine ulaştığında toksik etki yapar. Eski zamanlarda yaraları iyileştirmede kullanılan, balın zayıf antiseptik aktivitesi, içerdiği enzimlerle H2O2 oluşumundan ileri gelmektedir. H2O2, superoksit (O2˙⁻) radikaline elektronun eklenmesi (superoksit dismutasyonu) ya da O2’in doğrudan indirgenmesiyle oluşmaktadır (Hallıwell ve Gutterıdge, 1998). Dismutasyon kendiliğinden ya da superoksit dismutaz (SOD) enzimi aracılıyla katalize edilmektedir.
2H+
O2˙⁻ + 2e O2 H2O2 (1.5) SOD
2O2˙⁻ + 2H+ O2 + H2O2 (1.6) H2O2, oldukça yayılabilir özelliğe sahiptir ve superoksitin aksine plazma membranlarıdan kolaylıkla geçebilmektedir. Reaktif oksijen türleri içerisinde
diğerlerine göre daha uzun ömürlü olan H2O2; üretildiği yerden uzak kısımlara difüzyon yoluyla dağılmakta ve çeşitli organellerin membran yapılarına girerek hücre içi sinyal molekülü olarak da rol oynamaktadır (Lee ve ark. 2003; Eryılmaz, 2007; Nordberg ve Arner, 2001).
H2O2 pH 10’un altında radikal olmayan nötral bir moleküldür. Hidrojen peroksit Cu⁺2 ve Fe⁺2 elementlerinin varlığında süperoksit radikali ile reaksiyona girebilir ve daha reaktif OH˙’e dönüşür. Kloroplastik askorbat peroksidaz (APX) izozimleri, elektron donörü olmadığında H2O2 ile oksitlenir. Cu/Zn SOD, Cu+2 iyonlarının, reaksiyon merkezinde Cu+’ya indirgenmesi yoluyla H2O2 ile işlevsiz duruma getirilir ve OH˙ oluşumu gerçekleşir (Keser, 2005).
Hidrojen peroksit çiftlenmemiş elektrona sahip olmadığından radikal olarak adlandırılmaz. Hidrojen peroksit bir serbest radikal olmadığı halde reaktif oksijen türleri kapsamına girer. H2O2 reaktif oksijen türleri arasında en az reaktif moleküldür, fizyolojik pH’nın altında ve metal iyonlarının yokluğunda stabildir (Lee ve ark. 2003). Bitki hücrelerinde oksidan zararın önlenmesi için H2O2’in temizlenmesi büyük önem taşımaktadır ve oksitleyici özellikleri nedeniyle biyolojik sistemlerde oluşan H2O2’in derhal ortamdan uzaklaştırılması gerekmektedir. H2O2’in yıkımı bitkilerde öncelikle askorbat-glutatyon döngüsü ile hücrelerdeki önemli antioksidan enzimler olan katalaz ve peroksidaz enzimleri tarafından gerçekleştirilmektedir (Eryılmaz, 2007). Bir antioksidan olan askorbat, süperoksit veya hidrojen peroksitle reaksiyona girererek monodehidroaskorbik asit veya dehidroaskorbik asit oluşur. Đndirgenen bileşik NAD(P)H veya glutatyonun redüksiyonunu kullanarak monodehidroaskorbat redüktaz veya dehidroaskorbat redüktaz ile geri askorbik asite dönüşür. Dehidroaskorbat tartarat veya oksalata parçalanabilir.
H2O2, katalaz (CAT) ve peroksidazlar tarafından temizlenir. CAT, H2O2’yi O2 ve H2O’ya dönüştürür.
CAT peroksizomlarda yerleşmiştir ve lipitlerin β- oksidasyonunda ve solunumda üretilen H2O2’yi temizleme işinden sorumludurlar. Peroksidazlar bir elektron donörü (AH) kullanarak H2O2’i H2O’ya indirgeyerek temizlerler (Keser, 2005).
H2O2 + 2 AH 2 H2O + 2 A (1.8)
Başlangıçta H2O2’nin birikimi patojen saldırısı, yaralanma, kuraklık, ekstrem sıcaklıklar, fizyolojik ve kimyasal şoklar gibi çeşitli stres faktörlerine karşı cevap olarak bilinir. Çevresel stres H2O2’nin kloroplast, apoplasat ve diğer organellerde hızlı bir şekilde sentezlenmesine yol açar.
H2O2’nin oluşumu biyotik ve abiyotik stres altında bitki savunma mekanizmasının aktivasyonu için bir sinyal olarak düşünülür. Hidrojen peroksit miktarındaki değişimler gen ekspresyonunun düzenlenmesini sağlar.
Düşük konsantrasyonlarda uygulanan H2O2, Arabidopsis ve tütünde yapılan çalışmalarda yüksek ışık yoğunluğundan kaynaklanan oksidatif stresten bitkileri korur. Yine aynı şekilde sıcaklık stresinden de fasulye ve börülcede yapılan çalışmalarda bitkilerin strese karşı direnç kazandığı görülmüştür. Çalışmalar sonucunda H2O2 uygulamasının bazı antioksidan enzimlerin aktivasyonunda ve/veya glutatyon gibi bazı antioksidan bileşik seviyelerinde değişikliğe neden olduğu ileri sürülmüştür (Moskova ve ark., 2009).
1.3.3. Hidroksil Radikali (OH˙⁻)
Hidroksil radikalleri en reaktif serbest radikallerdir ve vücuttaki serbest radikal hasarının en önemli sorumlularıdır. ˙OH biyomoleküllere karşı güçlü saldırgan bir molekül olduğundan dolayı reaktif oksijen türleri arasında biyolojik sistemlere en fazla zarar veren bir radikaldir. Hidroksil radikalinin önemli bir kısmı canlılarda hidrojen peroksitin eksik indirgenmesi ile gerçekleşir (Nordberg ve Arner, 2001). Hidroksil radikalleri birçok yolla oluşabileceği gibi aşağıda belirtilen Fenton ve Haber-Weiss
reaksiyonlarıyla da oluşmaktadır. (Demirci, 2006). Hidroksil radikali H2O2’nin metal iyonlarıyla (Cu⁺2 veya Fe⁺2) katalizlenmesi sırasında meydana gelir.
Fe+2 + H2O2 Fe+3 + ˙OH + OH ⁻ (Fenton reaksiyonu) (1.9)
H2O2 + O2˙⁻ ˙OH + O 2 + OH ⁻ (Haber-Weiss reaksiyonu) (1.10)
Bu tepkime ile oluşan ˙OH miktarı; hücrede üretilen H2O2 derişimi ve serbest metal iyonlarının varlığına bağlıdır.
Hipoklorik asitin O2˙⁻ ile reaksiyona girmesi sonucu da ˙OH radikalli oluşur.
HOCL + O2˙⁻ O2 + CI⁻ + ˙OH (1.11)
Biyolojik sistemlerde ˙OH diğer moleküllere yüksek ilgisi olan kısa ömürlü bir radikaldir. Güçlü oksitleyici ajan olan ˙OH su dahil ortamda rastladığı her organik ve inorganik moleküllerle reaksiyona girer. Bütün hücresel yapıların hedefi olan ˙OH protein, lipit, amino asit, şeker ve nükleik asitler özellikle timin ve guanozin gibi bileşikler tercihli hedeflerdir (Kohen ve Nyska, 2002). Proteinlerin serbest radikallerce oksidasyonunda ˙OH amino asit yan zincirlerinin oksidasyonu, protein-protein çapraz bağlarının kırılması ve protein parçalanmalarına yol açarak hücreleri proteolitik yıkıma götürebilmektedir (Lee ve ark. 2003). ˙OH radikalinin sebep olduğu biyolojik zararlardan en iyi tanımlanmış olanı, lipit peroksidasyonu olarak bilinen serbest radikal zincir reaksiyonudur. Lipitlerin peroksidasyonu; membranın yapısını, bütünlüğünü ve seçici geçirgenliğini bozarak hücre ölümüne kadar varabilen olaylara neden olabilmektedir ˙OH’in nükleik asitler ile tepkimeleri sonucunda ise baz modifikasyonları, baz delesyonları ve zincir kırılmaları gerçekleşebilmektedir (Eryılmaz, 2007). Hidroksil radikali guonozin ve timini 8-hidroksi-2-deoksiguonozin ve timin glikole oksiteler. 8-hidroksi-2-deoksiguonozin oksidatif stresde biyolojik gösterge olarak kullanılır (Lee ve ark. 2003). DNA yapısında meydana gelen ileri derecedeki bozukluklar onarılamadığından serbest radikaller; mutasyon, yaşlanma ve hatta hücre ölümüne yol açabilmektedir. ˙OH yapımını katalizlemelerindeki etkileri
nedeniyle, canlılarda metal iyonları serbest radikallerin zararlarından birinci derecede sorumludurlar ve proteine bağlı tutulmaları gerekmektedir. Birçok canlı organizmada bu görev transferrin, ferritin ve ürik asit gibi bileşiklerce yapılırken, bitkilerde metallotiyoninler, glutatyon, fitoşelatinler ve fenolik bileşikler toksik metal iyonlarını bağlı formda tutarak zararlı etkilerini azaltmakta ya da ortadan kaldırmaktadır (Eryılmaz, 2007).
1.3.4. Singlet Oksijen (1O2)
Elektron taşıma sistemiyle ilişkili klorofil pigmenteleri singlet oksijenin ilk kaynağıdır (Arora ve ark. 2002). Singlet oksijen (1O2) aslında bir radikal değildir ve uyarılmış durumdadır. Diğer reaktif oksijen türleriyle kıyaslandğında singlet oksijen daha az reaktifdir ve memeli dokuları için toksik değildir (Lee ve ark. 2003). Tekil oksijen diğer moleküllerle etkileştiğinde ya içerdiği enerjiyi transfer etmektedir, ya da kovelent tepkimelere girmektedir. Özellikle karbon-karbon çift bağları singlet oksijenin tepkimeye girdiği bağlardır. Tekil oksijen lipitler, nükleik asitler ve proteinler gibi önemli hücresel makromolekülleri okside ederek lipit peroksidasyonu, membran hasarları ve hücre ölümlerine neden olmaktadır (Demirci, 2006).
Yüksek enerji ve dönme durumundan dolayı 1O2’nin organik moleküllere karşı reaktifliği moleküler oksijenden çok daha fazladır. 1O2 nükleofiliktir ve sıklıkla diğer molekülleri divalent olarak oksitler, hidroperoksit ve endoperoksit şekillerine çift bağlar ekler, proteinleri oksitleyerek zarar verir. 1O2 bir radikal olmadığı için bu reaksiyonlar radikal üretmez ve doğrudan zincir reaksiyonlar başlatmaz. Bununla beraber peroksitlerin indirgenmesi durumunda oldukça reaktif alkoksil radikaller meydana gelir (Keser, 2005).
1.3.5. Fitrik Oksit (FO˙)
Nitrik oksit (NO˙) tek eşleşmemiş elektron çiftine sahip serbest bir radikaldir, yağda çözünür ve biyolojik membranlardan kolaylıkla geçer ( Lee ve ark. 2003; Akkoç, 2008). Nitrik oksit L-arjininin terminal nitrojen atomlarının oksidasyonuyla oluşturulur. Bu
reaksiyon nitrik oksit sentaz enzimleriyle gerçekleşirken L-arjinin NO˙ ve L-sitrulline dönüştürülür (Kohen ve Nyska, 2002).
L-arginin + O2 + NADPH L-sitrullin + NO˙ + NADP⁺ (1.12)
Nitrik oksit tek başına çok reaktif bir radikal olmadığından biyomoleküllerle doğrudan reaksiyona girmez. Öteyandan NO˙ peroksil ve alkil gibi serbest radikallerle kolaylıkla reaksiyona girerek, daha az reaktif moleküller oluşturarak, gerçekte serbest radikal giderici bir fonksiyon yapar. Bir antioksidan olarak hücrelerde lipit peroksidasyonunu inhibe eder. Fizyolojik konsantrasyonlarda NO˙, guanilat siklaz ve protein kinazları uyararak, hücre içi mesajı olarak işlev yapar (Nordberg ve Arner, 2001).
1.3.6. Peroksil (ROO˙) ve Alkoksil (RO˙) Radikalleri
ROO˙ oksijenin alkil radikalleriyle (R˙) doğrudan reaksiyona girmesiyle oluşur. Ayrıca peroksil ve alkoksil radikalleri alkil peroksitlerin (ROOH) dekompozisyonuyla da meydana gelir. UV ışınları veya geçiş metal iyonlarının varlığında peroksitler peroksil ve alkoksil radikallerini oluşturur.
ROOH ROO˙ + H˙ (1.13)
ROOH + Fe⁺3 ROO˙ + Fe⁺2 + H⁺ (1.14)
Peroksil ve alkoksil radikalleri iyi okside edici ajanlardır ve hidrojeni diğer biyomoleküllerden ayırır. Reaksiyon genellikle lipit peroksidasyonunun ilerleme safhasında görülür (Lee ve ark., 2003).
1.4. Radikallerinin Meydana Getirdiği Hasarlar
Reaktif oksijen radikallerinin saldırısı sonucu meydana gelen oksidatif hasarlar her zaman hücre ölümlerine neden olmazlar fakat membran lipitlerine, proteinlere ve nükleik asitlere ciddi hasarlar verebilirler.
1.4.1. Proteinlerde Meydana Gelen Hasarlar
Proteinlere yapılan oksidatif saldırılar yüzey spesifik amino asit modifikasyonlarına, peptit zincirlerinin parçalanmasına, çapraz bağ kurmuş reaksiyon ürünlerinin kümeleşmesine, elektriksel yük değişimlerine, parçalanmalara duyarlılığın artmasına neden olur. Proteinlerin primer, sekonder ve tersiyer yapısı ve amino asitlerin çeşidi proteinlerin reaktif saldırılara karşı duyarlılığını değiştirir ve peptidin reaktivitesini etkiler. Özellikle kükürt içeren amino asitler ve tiyol grupları oldukça duyarlı alanlardır. Proteinlerin oksidatif olarak zarar görmesi durumu Fe⁺2 gibi redoks dönüşümü yapabilen metal kofaktörlerin varlığında artar. Böyle durumlarda metal, proteinin iki değerlikli katyonları bağlayan yüzeyine bağlanır. Sonra metal hidroksil radikali oluşturmak için hidrojen peroksit ile reaksiyona girer. Reaksiyon sonunda meydana gelen hidroksil radikali amino asit dizilerini oksitler (Cicerali, 2004).
Proteinlerdeki amino asit yan zincirlerinin oksidasyonu biyolojik sistemlerde tanımlanan önemli sinyal potansiyallerinden biridir. Tiyol gruplarının indüklenmesinin dönüşümlü oksidasyonu çoğunlukla metiyonin, prolin ve sisteindeki oksidatif strese bağlıdır.
Prolin peptid bağlarının hidrolizi için ilk hedef olabilir ve gruptaki N-terminal glutamat rezidülerini meydana getirir. Oksidatif saldırılarda kollajen bağları kurulur. Prolin amino asitine hidroksil radikallerinin saldırmasıyla O2 varlığında hidrojen çıkarılması meydana gelir ve bu organik peroksi radikali yoluyla 2- pirrolidonun oluşmasına neden olur. Peptid bağlarındaki değişikliklerle oluşan yeni N- terminal glutamatın hidroliziyle piroglutamat 6 meydana gelir (Sies, 1986).
1.4.2. DFA’da Meydana Gelen Hasarlar
DNA hasarı, hücrenin yaşamı boyunca yaygın olarak görülen ve mutasyon, kanser, yaşlanma ve sonuçta hücre ölümüne yol açabilen bir olaydır. DNA, yaşam boyunca hücresel metabolitler ve ekzojen ajanlar tarafından sürekli olarak değişimlere maruz kalır. Bu değişimler sonuçta tek hücreli organizmalarda hücresel ölüme veya çok
hücreli organizmalarda dejenerasyon ve yaşlanmaya sebep olabilir (Atmaca ve Aksoy, 2009).
Aktifleşmiş oksijen iyonize radyosyon gibi serbest oksijen radikallerini oluşturan ajanlar DNA’ da delesyon, mutasyon ve diğer ölümcül etkilere yol açan pek çok lezyona neden olur. DNA’nın şeker ve bazları oksidasyona karşı oldukça hassastır ve oksidasyon, baz degredasyonuna, tek iplik kırılmasına, çapraz bağlı proteine yol açar. Tek ipliğin açılmasının temel sebebi hidroksil radikali tarafından şeker kısmının oksidasyonudur (Davies, 2000). Hidroksil radikalinin DNA molekülünün tüm bileşenleriyle reaksiyona girdiği bilinmektedir. Pürin, primidin bazlarında ve deoksiriboz iskelette hasara yol açmaktadır. Hidroksil radikali DNA’nın çapraz bağlarına eklenebilmekte, timinin metil grubundan bir hidrojen atomu ve 2’ deoksiribozun beş karbon atomunu çıkarmaktadır. Baz ve şekerin ileriki reaksiyonları, oluşan modifiye baz ve şekerlerin, baz-serbest bölgelerin, kenar kırılmalarının ve DNA protein çapraz bağlanmalarının çeşitliliğine yol açmaktadır.
1.4.3. Lipitlerde Meydana Gelen Hasarlar
Hücre membranları içerdikleri çoklu doymamış yağ asitlerinden dolayı oksidasyonlara karşı savunmasızdırlar. Serbest oksijen radikalleri, hücre membranlarına lipit peroksidasyonu yoluyla zarar verir. Lipit peroksidasyonu oksidatif strese maruz kalan canlılarda meydana gelen hücresel hasarın temel nedeni olarak düşünülür. Yapısal hasarın drecesine göre, plazma membranlarında akışkanlığın azalması, membran geçirgenliğinin değişmesi, membran potansiyeli azalması, membrana bağlı enzimlerin aktivitelerinde azalma gözlenir. Peroksidasyon reaksiyonları yağ asidi zincirindeki çift bağlarla serbest oksijen radikalleri arasında gerçekleşir (Catala, 2006; Akkoç, 2008).
Lipit peroksidasyonu; başlama, ilerleme, yıkım ve sonlanma olmak üzere dört aşamada oluşmaktadır. Reaksiyon doymamış yağ asitlerine hidroksil radikallerinin saldırmasıyla başlar. Đlerleme basamağında ise ilk basamakta meydana gelen lipit radikali oksijenle reaksiyona girer ve ilerleyen reaksiyon basamaklarında lipit peroksitler oluşur. Bu reaksiyonlarda hidroksil radikallerinin rolü yangını başlatan kıvılcım gibidir. Lipit
