sperma-sulandiricilari-ve-sperma-sulandirilmasi

(1)

Sperma Sulandırıcıları ve Spermanın

Sulandırılması Spermanın Kısa ve Uzun

Süreli Saklanması ve Kryobiyoloji

Prof.Dr.Serhat PABUCCUOĞLU

(2)

Sperma Sulandırıcısı Nedir?

Spermanın ihtiyaçlarını karşılayan, dış

etkenlere karşı spermatozoanın

bütünlüğünü ve fertilite yeteneğini

koruyan, dişi genital sistemine zarar

vermeyen, spermanın hacmini istenilen

düzeye çıkarabilen spermatozoa için

geliştirilmiş sıvı besi ortamlarıdır.

(3)

SULANDIRICILARIN KULLANIM

AMAÇLARI

Spermayı hacim olarak artırmak Spermatozoanın canlılığını daha uzun süre devam ettirebilmek Spermatozoayı ani ısı değişikliklerinden koruyabilmek Mikroorganizmaların spermatozoaya zarar vermesini önlemek

(4)

Spemanın hacmini artırmak

Bir ejakulasyon sonunda elde edilen, örneğin bir boğa

sperması ortalama 5 mL’dir.

Bu sperma ile sun'i tohumlama yöntemi kullanılarak 100

- 500 adet inek tohumlanabilir.

Ancak 5 mL spermayı hiçbir şey yapmadan 100 - 500 eşit

hacime bölmek mümkün değildir. Bunu bölebilmek için

spermatozoaya zarar vermeden hacmini uygun bir

şekilde artırmak gerekir. Bunun için de «SPERMA

SULANDIRICISI» kullanılır

(5)

Spermatozoanın canlılığını daha uzun

süre devam ettirebilmek

Testislerde üretilip ejakulasyon ile dışarıya bırakılan sperma seminal

plazmada bulunan maddeler sayesinde canlılıklarına devam ederler. Ancak

bu stoklar sadece dişi genital kanalın bir kısmındaki yaşama payını

karşılayabilir. Dış ortamda daha uzun süre canlı ve fertil kalabilmeleri için

mutlaka daha fazlasına ihtiyaç vardır.

Sulandırıcılarda bulunan basit şekerler gibi enerji veren maddeler,

spermatozoanın canlılığını sürdürmesinde yardımcı olurlar.

Ayrıca makromoleküler yapıdaki maddeler (özellikle lipoproteinler) membran

bütünlükleri ve oksidadif strese karşı koruyucu etkiye sahiptirler.

Metabolizma artıkları ekarte edilerek oksidatif strese bağlı hem membran

hem de DNA üzerinde şekillenecek önemli bozulmaların önüne geçilir.

Tampon ortamlar sayesinde ortamın pH değişimlerinin önüne geçilir.

(6)

Spermatozoayı ani ısı değişikliklerinden

koruyabilmek.

Spermanın daha uzun süre saklanabilmesi için 5o_{C'a soğutulması veya dondurulması}

zorunludur. Böylece sperma çok daha uzun süre potansiyel fertilitesini koruyabilir.

Spermatozoanın membran yapısı lipoprotein yapısındadır ve içinde kolesterol molekülleri bulunur. Kolesterolün temel görevi hücre membranının düşük ısılardaki dayanıklılığını artırmaktır. Kolesterol miktarları düştükçe ısı değişimlerine karşı spermatozoanın

dayanıklılığı da azalır. Sulandırıcıların içinde bulunan makromoleküller özellikle lipoprotein, phospholipid, Lesitin, β-Lipovitellin ve

glikoproteinler bu değişimlere karşı spermatozoayı korurlar.

(7)

Mikroorganizmaların spermatozoonlara

zarar vermesini önlemek.

Spermatozoa, herhangi bir hastalık etkeni söz konusu olmadığı sürece üretildiği testis bölgesinden üretraya gelinceye kadar steril ortamdadır. Ejakülasyon sırasında üretra içinde saprofit mikroorganizmalarla karşılaşır ve karışır

Dış ortama atıldığında ise çevrede bulunan tüm mikroorganizmalar spermayı

kontamine eder. Bu kontaminasyonun önlenmesi veya mikroorganizmaların etkisiz hale getirilmesi için gereken önlemler:

– Kullanılan tüm malzemenin temizliğine, asepsisine ve sterilizasyonuna dikkat edilir – Sulandırıcılar içine mutlaka antibiyotik ilave edilir

• streptomycin B sulfat (1000 µg/ mL) + Penicillen G (1000 IU/mL) • Gentamycin (500 µg/mL),

• Tylosin (100 µg/mL)

• Linco-spectin (300-600 µg/mL)

(8)

Sulandırıcılarda Aranan Temel

Özellikler

• Ozmotik basıncı seminal plazmanın ozmotik basıncına eşit

olmalı ve bu denge saklama süresince bozulmamalıdır.

• Spermatozoanın metabolizmasında gerekli olan mineral

maddeleri taşımalıdır.

• Spermatozoanın enerji gereksinimini karşılayabilecek

maddeleri içermelidir.

• Isı değişimlerine karşı spermatozoayı koruyan maddeler

bulunmalıdır.

• Spermatozoanın metabolik artıklarını elimine edebilmelidir.

• İçinde patojen mikroorganizma bulunmamalı bakteriyel

kontaminasyonun kontrolü için antibiyotikler içermelidir.

(9)

Sulandırıcılarda Aranan Temel

Özellikler: OZMOTİK BASINÇ

Seminal plazma ozmotik basıncı 300-340 mOsmol/kg

civarındadır. Sulandırıcı içine koyulacak olan mineral

tuzlar, şekerler, tampon sistemler, yumurta sarısı gibi

maddeler bu basıncın sağlanmasında büyük rol oynar.

Gliserol ozmotik basınç üzerinde en etkin olan maddedir.

O nedenle gliserol katma işleminden sonra sulandırılmış

olan spermanın ozmotik basıncının 1200 mOsmol/kg

üzerine çıkması istenmez.

(10)

Sulandırıcılarda Aranan Temel

Özellikler: ENERJİ MADDELERİ

• Eklenti üreme bezleri tarafından yapılan salgı

tarafından oluşturulan seminal plazma farklı

türlerde farklı miktarlarda FRUKTOZ içerir. Bu

basit şeker spermatozoa hareketi için olmazsa

olmaz bir maddedir. Sulandırıcılara bu

maddenin ilave edilmesi şarttır. FRUKTOZ

yerine GLİKOZ da kullanılabilir.

(11)

Sulandırıcılarda Aranan Temel

Özellikler: pH TAMPON SİSTEMLERİ

• pH değişimlerine karşı koruyucu tampon sistemlerini

içermelidir(spermanın pH değeri 6,8’dir).

–

Na-citrat

–

TRIS

Sperma ejakule edilirken eklenti üreme bezlerinden yapılan

salgılar öncelikle üretra ve daha sonra spermanın gideceği dişi

genital kanalı spermatozoa için uygun bir yer haline getiren pH

tampon sistemlerini içerir. Dış ortamda da spermatozoanın

metabolizması sonucunda ortam pH’sı değişeceği için bu

sistemlerin ortamda bulunması gerekir.

(12)

Sulandırıcılarda Aranan Temel Özellikler:

MEMBRAN BÜTÜNLÜĞÜ KORUMASI

Spermanın gerek +5o_{C'a soğutulması ve burada saklanması}

veya daha uzun süre kullanılabilmesi için dondurulması zorunludur. Bu aşamada hem plazma mebranının hem de akrozom membranı ve yapısının korunması fertilite için olmazsa olmazdır.

Spermatozoanın membran yapıları lipoprotein yapısındadır ve içinde kolesterol molekülleri bulunur. Kolesterolün temel görevi hücre membranının düşük ısılardaki esnekliğini dolayısı ile dayanıklılığını artırmaktır.

Kolesterol miktarları düştükçe ısı değişimlerine karşı spermatozoanın dayanıklılığı da azalır.

Sulandırıcıların içinde bulunan makromoleküller özellikle lipoprotein, phospholipid, Lesitin, B-Lipovitellin ve

glikoproteinler bu değişimlere karşı spermatozoayı korurlar.

Bazal çukurluk

Plazma membranı

Dış akrozom membranı akrozom

(13)

Sperma sulandırmada kullanılan

sulandırıcılar

• Na-sitrat Yumurta Sarısı Sulandırıcısı

• TRIS Bazlı Sulandırıcılar

• Yağsız Süt veya Süt Tozu İle Hazırlanmış

Sulandırıcılar

• Ticari Sulandırıcılar

–

BTS (domuz)

–

BIOXEL (boğa)

–

CANİN-EXT (köpek)

(14)

Yumurta Sarısı ve Sulandırıcılardaki Önemi

Yumurta sarısı ticari ürünler dışında hazırlanan tüm

sulandırıcıların içinde %20 oranında mutlaka vardır.

Yumurta sarısı içinde bulunan lipoproteinler ve

diğer glikoproteinler membran koruyucu

özelliklerinin yanı sıra içerdiği antioksidan maddeler

ile oksidatif stresin de önlenmesinde katkı sağlar.

Bu sayede hem membranların hem de DNA’ların

hasarlanmasının önüne geçilmiş olur.

(15)

Yağsız Süt veya Süt Tozu

Yağsız süt tozu veya yağı alınmış süt ile hazırlanacak olan

sulandırıcıların mutlaka 92–95

o

_{C ısıda 8–10 dakika}

ısıtılması gerekir.

Süt proteinleri arasında bulunan «LACTENİN» bu süreçte

inaktive edilmiş olur. Bu proteinin spermatozoa üzerinde

toksik etkisinin olduğu belirlenmiştir.

UHT sütler çok yüksek ısılara maruz bırakıldığı için bu

ısıtma sürecine ihtiyaç yoktur doğrudan kullanılabilir

(16)

Anabioz ve kryobiyoloji nedir

• ANABİOZ:

Canlı metabolizmasının 5

o

_{C gibi düşük ısılarda yavaşlatılarak}

yaşam süresinin ve buna bağlı olarak yaşamsal ve işlevsel

yeteneğinin bozulmadan uzatılmasına anabiose adı verilir.

• KRİYOBİYOLOJİ (DONMA BİLİMİ):

Canlı materyallerinin –196°C gibi çok düşük ısılarda,

canlılıklarını ve fonksiyonel özelliklerini kaybetmeksizin

saklanabilmesi ile ilgilenen bilim dalıdır.

Kriyobiyoloji kavramının içerisinde; sulandırıcılar, sulandırma,

KRYOPROTEKTAN, soğutma, dondurma ve depolama

tekniklerinin yanı sıra eritme teknikleri de yer alır.

(17)

Spermanın kısa ve uzun süreli

saklanması

• Spermanın kısa süreli saklanması (ANABİOZ):

Oda ısısında ancak bir kaç saat süre ile fertilizasyon yeteneğini koruyabilen

spermatozoa, sulandırılırsa ve 5

o

_{C‘de saklanırsa bu yeteneğini bir kaç gün}

sürdürebilir (yaklaşık 72 saat). Spermatozoa metabolizmasının 5

o

_{C gibi}

düşük ısılarda yavaşlatılarak yaşam süresinin ve buna bağlı olarak

fertilizasyon yeteneğinin uzatılmasında ANABİOSE’dan yararlanılır.

• Spermanın uzun süreli saklanması (DONDURULMASI):

Spermanın dondurularak metabolizmasının durma noktasına

yaklaştırılmasına ve böylece canlılığını yıllarca koruyabilmesine de

anabiose denilebilir.

Spermatozoa, özel olarak hazırlanmış ve KRYOPROTEKTAN içeren

sulandırıcılar içerisinde, bir dizi soğutma aşamalarından sonra

dondurularak –196°C gibi çok düşük ısılarda depolanır.

(18)

Biyolojik materyallerin dondurulmasında

koruyucu olarak kullanılan malzemeler:

KRİYOPROTEKTANLAR

Biyolojik materyallerin dondurulmasında donma işleminin oluşturacağı olumsuz

etkilere karşı suyun fizikokimyasal yapısını değiştirerek korumak ve oluşacak hasarı en aza indirebilmek amacıyla hücrelerin bulunduğu ortama bir takım koruyucu maddeler ilave edilir. Bu maddelere genel olarak KRİYOPROTEKTAN adı verilir. Sperma, embriyo, oosit ve vücut hücrelerinin dondurulmasında en yaygın olarak kullanılan kimyasal kriyoprotektanlar aşağıda sıralanmıştır.

– Gliserin(gliserol)

– DMSO( dimetilsulfoksit) – Etilen glikol

– Propilen glikol

Koruyucu özelliğe sahip sukroz, trehaloz gibi polisakkaritler, glikoproteinler,

lipoproteinler ve makromoleküler yapıdaki maddeler, dondurulacak olan biyolojik materyallerin özellikle membran yapılarının korunmasında yaygın olarak

kullanılmaktadır.

(19)

Kryoporotektanların etki mekanizması

• Kimyasal kryoprotektanlar su

moleküllerini kendi yapılarına çekme

özellikleri vardır

• Osmotik basıncı oldukça yükseltirler

• Hücre içinde dehidrasyon oluşumunu

sağlar

• Suyun donma sırasındaki davranışını

bozarak kristal oluşumu bozulur amorf

lameller şeklinde buz oluşumu şekillenir

• Hücre içinde mikro kiristallerin

şekillenmesi sağlanır mekanik DNA

hasarı önlenir

(20)

Sperma Sulandırılmasındaki Temel

Kurallar

• Sperma ile temas edecek olan tüm malzeme ve ekipmanın temiz

(kimyasal ve diğer kirleticiler açısından) ve mümkünse steril olması

sağlanmalıdır

• Sulandırıcılar içinde bulunan ve kısa sürede bozulabilen enzim ve

proteinleri içermesi nedeniyle taze olarak hazırlanmalıdır

• Sulandırıcı ve sperma her zaman karıştırılmadan önce aynı ısıya

getirilmelidir

• Her zaman sulandırıcı spermanın üzerine katılmalıdır

• Sulandırıcı sperma üzerine bir seferde değil, kısım kısım ayrılmış

hacimlerde (tercihen sırasıyla katılacak toplam sulandırıcı miktarının

%10, %20, %30, %40’ı veya %20, %30 ve %50’si şeklinde) kademeli

olarak ve 8-10 dakika aralıklarla sperma üzerine eklenmelidir

(21)

Spermanın taze kullanım amaçlı

sulandırılması

• Sulandırıcı taze olarak hazırlanır

– Kullanım günü hazırlanan sulandırıcı , içinde 26 - 32oC su bulunan ben-marey içine alınır

• Suni vajen veya elektroejakülatör ile sperma alınır

– Sperma alındıktan hemen sonra sulandırıcının içinde bulunduğu ben marey içine yerleştirilir. Buradaki amaç sulandırıcı ve sperma ısılarının bir birine eşitlenmesidir

• Makroskobik ve Mikroskobik Muayeneleri gerçekleştirilir

• Sulandırıcı miktarı hesaplanır

• Sulandırma işlemi gerçekleştirilir

• Sulandırma sonrasında mikroskobik muayeneler tekrarlanır

• +4 - +5

o

C’ye Soğutma işlemi gerçekleştirilir ve soğukta saklanır

• Kullanım öncesinde muayeneler tekrarlanır

(22)

Sulandırıcı Miktarının Hesaplanması

(23)

Sulandırıcı Miktarının Hesaplanması

• Yapılan hesaplamada 100 adet inek tohumlanabileceği belirlenmiştir.

• Tohumlama dozunun hacmi 1 ml olacak ise çıkan bu rakam hacimle

çarpılmalıdır

100 x 1 mL = 100 mL (Sperma + Sulandırıcı)

Bu hacimden sperma miktarını çıkarttığımızda gerekli olan sulandırıcı miktarını hesaplamış oluruz

100 – 4 = 96 mL

sulandırıcı hazırlanması ve spermanın üzerine eklenmesi gerekir

(24)

Spermanın Soğutulması

Türler bazında farklılıklar göstermekle birlikte in vitro koşullarda dondurulmaksızın saklanabilmesi için veya donma öncesinde kryoprotektanların eklenmesi ve için spermanın 5o_{C'a soğutulması}

gerekmektedir.

Spermatozoon membranlarındaki yapısal özellik soğutma işlemine karşı hassasiyeti de

beraberinde getirmiştir. Bu nedenle yapısal ve fonksiyonel bütünlüğün korunabilmesi için

mutlaka soğutma işleminin de hassas ve yavaş bir şekilde gerçekleştirilmesi gerekir.

Yapılan çalışmalarda ön sulandırılması işlemi gerçekleştirilmiş olan spermanın dakikada 0,2-0,3

o_{C/dak hızla soğutulmasının en iyi sonucu verdiği}

anlaşılmıştır.

(25)

SPERMANIN UZUN SÜRELİ

SAKLANMASI İÇİN DONDURULMASI

Avantajları: Spermalar çok uzun yıllar saklanabilir ve kullanılabilir Çok küçük hacimdeki stoklarda çok yüksek miktarlarda damızlığın sperması saklanabilir Dondurulan spermalar uzun mesafelerde nakledilir Boğaların spermaları çok geniş coğrafik alanlarda kullanılabilir Kıymetli damızlıklardan daha fazla yararlanabilme imkanı sağlanır

(26)

Dondurularak Depolanmış Spermalar

(27)

Suni Tohumlama

sektöründeki

Dondurulmuş

spermanın

yerine bir örnek

(28)

Spermanın dondurma amaçlı

sulandırılması

• Sulandırıcı taze olarak hazırlanır

• Kullanılacak olan sulandırıcı miktarı ikiye ayrılır A (gliserolsüz sulandırıcı) ve B (gliserollü sulandırıcı) sulandırıcısı olarak işaretlenir

– Kullanım günü hazırlanan A sulandırıcı, içinde 26 - 32oC su bulunan ben-marey içine alınır – Kullanım günü hazırlanan B sulandırıcısı içine gliserol eklenir, 4oC soğuk vitrin içine alınır

• Suni vajen veya elektroejakülatör ile sperma alınır

– Sperma alındıktan hemen sonra sulandırıcının içinde bulunduğu ben marey içine yerleştirilir. Buradaki amaç sulandırıcı ve sperma ısılarının bir birine eşitlenmesidir

• Makroskobik ve Mikroskobik Muayeneleri gerçekleştirilir • Sulandırıcı miktarı hesaplanır

• Sulandırıcı A ile sulandırma işlemi gerçekleştirilir • Sulandırılmış sperma +4oC’a soğutulur

• Soğutma sonrası mikroskobik muayeneler tekrarlanır

• Soğutma işlemi tamamlandıktan sonra gliserollü sulandırıcı sulandırılmış spermanın üzerine eklenir «GLİSEROLİZASYON»

• Gliserolizasyon işlemi tamamlandıktan sonra spermatozoonların «EKİLİBRASYONU» yapılır • Dondurma yöntemine göre porsiyonlanır

• Dondurma işlemi gerçekleştirilir

• Dondurulmuş olan spermalar uygun koşullarda saklanır

• Donma sonrasında 37oC’daki su banyosunda çözündürülerek mikroskobik muayeneler gerçekleştirilir

• Bir hafta sonra yeniden örnek alınıp çözündürülerek mikroskobik muayeneler tekrarlanır ve uygun olan spermalar kullanılmak üzere depolanır.

(29)

Sperma dondurmada kullanılan

kryoprotektanlar,

• Süt lipidleri ve proteinleri de kryoprotektan olarak kabul edilirler. Süt proteinlerinin yanı sıra kazein iyonlarının fiziksel etkiden ziyade kimyasal yolla kryoprotektif

özellik gösterdikleri bilinmektedir.

• Yumurta sarısının sitratlı sulandırıcılarda yararlı etkisi 1939 yılında rapor edilmiştir. Yumurta sarısındaki fosfolipit, Lesitin, B-Lipovitellin, Lipoprotein ve glikoprotein'in kryoprotektif özellikte olduğu çeşitli araştırmalarda gösterilmiştir. Süt, yumurta sarısı gibi maddelerdeki makromoleküllerin varlığı da spermatozoanın yapısal ve fonksiyonel bütünlüğünün korunması için neredeyse zorunludur.

• Spermanın dondurulmasında en yaygın kullanılan kimyasal ajan GLİSEROL dür. – Gliserol türe bağlı olmakla birlikte genellikle hacmen %3-7 aralığında

sulandırıcılara katılır (boğa sperması için %5-7 en yaygın kullanılan orandır)

(30)

Dondurma amaçlı sulandırıcı

hazırlanması

• Alınan sperma muayene edildikten sonra kullanılacak

olan toplam sulandırıcı miktarı hesaplanır

• Hesaplanmış olan sulandırma sonrası ulaşılacak toplam

hacim ikiye bölünür

• Birinci hacim sperma + sulandırıcı A olarak belirlenir

• İkinci hacim ise Sulandırıcı B + total gliserol olarak

belirlenir.

• B sulandırıcısı içine finalde belirlenen gliserol miktarı

eklenir.

(31)

Örnek

Sulandırılmış spermanın toplam hacmi 50 mL olacaksa ve bunun

içinde %5 oranında gliserol ilave edilecek ise finalde hacmi

oluşturan unsurlar şu şekilde sıralanabilir

5 mL sperma

2,5 mL gliserol

42,5 mL

sulandırıcı

Ön sulandırma işleminde 5 mL sperma üzerine sulandırıcı A’dan

20 mL kuralına uygun olarak eklenmesi gerekir

5 mL sperma

20 mL sulandırıcı A (2 mL, 4 mL, 6 mL ve 8 mL’lik

porsiyonlar halinde 10 dakika ara ile)

(32)

Spermanın Soğutulması

Spermanın gliserolizasyon ve dondurma işleminden önce +4o_{C’a soğutulması çok}

önemlidir.

Bu aşamada yapılacak olan bir hata donma sonrası yapısal ve fonksiyonel bütünlüğün (membran ve akrozom

bütünlüğü, motilite ve fertilite kabiliyeti) korunmasında da negatif etkileyecektir. Temel kural burada da aynıdır ve yapılan çalışmalarda ön sulandırılma işlemi

gerçekleştirilmiş olan spermanın dakikada 0,2-0,3 o_{C/dak hızla}

soğutulmasının en iyi sonucu verdiği gösterilmiştir.

(33)

Gliserolizasyon

Dondurulacak olan spermaya

gliserolün kademeli ve aralıklı olarak

alıştıra alıştıra katılması olayıdır

(34)

Gliserolizasyon

Soğutma işlemi tamamlandıktan sonra Gliserol içeren B sulandırıcısı eklenmesi gerekir. B Sulandırıcısı toplam hacimde bulunması gereken toplam gliserol miktarını içerir yani:

22,5 mL Sulandırıcı

2,5 mL gliserol eklenir ve iyice karıştırılır

Hazırlanan sulandırıcı B gliserolizasyon işleminde kullanılır

25 mL Sulandırıcı A ile sulandırılmış sperma

25 mL Sulandırıcı B (2 mL, 4 mL, 6 mL ve 8 mL’lik porsiyonlar halinde 10 dakika ara ile)

(35)

Örnek

(36)

Gliserolizasyon

Örnek: 5 ml boğa spermasının(1,25 x 10

9

_{spermatozoon/mL %80 motil) %7}

gliserollü sulandırıcı ile payet başına 12,5 milyon motil spermatozoon olacak

şekilde dozlandığında 400 doz sperma hesaplanır. Her bir tohumlama dozu

0,25 mL olursa toplamda ulaşılacak olan hacim 100 mL dir. Bu da

95 mL sulandırıcı + 5 mL sperma demektir

Sulandırıcı A ile 26 - 32

o

_{C’lik su banyosunda ön sulandırma}

Toplam Hacim 50 mL (Gliserolsüz)

45 mL sulandırıcı + 5 mL sperma = 50 mL

↓ (2 - 4 saat soğutma)

+5

o

_C

(37)

Gliserolizasyon

Sulandırıcı B’nin yapısı ve sulandırma işlemi (+ 5

o

_C)

Toplam hacim 50 mL (Gliserollü)

Sulandırıcı 43 mL + Gliserol 7 ml = 50 mL

Sulandırılmış sperma (50 mL) + 10ml Sulandırıcı B ↓ 10 dakika

Sulandırılmış sperma (60 mL) + 15 mL Sulandırıcı B ↓ 10 dakika

Sulandırılmış sperma (75 mL) + 25 mL Sulandırıcı B

Toplam = 100 mL içinde 7 mL gliserol = %7

(10 dakika ara ile gliserollü sulandırıcının önce %20'si sonra %30'u ve %50'sini ilave etme tekniğini gösteren örnektir.)

(38)

Ekillibrasyon

Spermanın gliserollü sulandırıcı ile işlem gördükten sonra

5

o

_{C’de geçirmek zorunda olduğu adaptasyon süresidir.}

Gliserolizasyon sonrası sperma hücresi ile sulandırıcı

(gliserol) arasındaki madde alış verişinin tamamlanması

ve ortamın dengeye ulaşması için beklenilir.

Ekilibrasyon sonrası sperma donma işlemine hazır hale

gelmiş olur. Bu süre türe ve bireye bağlı olarak yaklaşık

2-3 saat kadardır.

(39)

Ekilibrasyon Aşamasında Gerçekleşen

Olaylar

HİPEROSMOTİK BASINÇLI ORTAM

SU

(40)

Spermanın dondurulmasında

kullanılan yöntemler

• Ampul yöntemi ile spermanın dondurulması

–

Kuru buz – Etil Alkol banyosu kullanılarak gerçekleştirilen

yöntemdir. Etil alkol banyosu içine –79

o

_{C’deki kuru buz}

parçaları atmak suretiyle 2 aşamada gerçekleştirilir.

• Birinci aşamada alkol banyosunun ısısı 5

o

C’den -20

o

C'a kadar 1 -

2

o

_{C/dak hızında soğutulur}

• İkinci aşamada mümkün olan en yüksek donma hızı sağlanarak ısı

-20

o

_{C’den -79}

o

_{C'a soğutulur.}

Depolama aynı banyo kabında yapılır. Ancak kuru buz eksildikçe

takviyesinin yapılması ve ortamın -79

o

_{C’de tutulması zorunludur.}

(41)

Spermanın dondurulmasında

kullanılan yöntemler

• Pellet yöntemi ile spermanın dondurulması

–

79

o

C’deki kuru buz bloklarının üzerinde gerçekleştirilen şok dondurma

yöntemidir.

• Kuru buz (katı CO2) blokları üzerine ufak oyuklar açılır.

• Sonra bu çukurlara 5oC ısıda ekilibrasyonu tamamlanmış 0,1 – 0,2 ml kadar sıvı sperma damlatılır.

• Birkaç dakika (2 - 3 dakika) içerisinde donan sperma pellet tarzında elde edilir. • Pelletlerin üzerine önceden hazırlanmış hayvan, laboratuvar adı vb. bilgileri taşıyan

küçük kağıt parçaları yapıştırılır. Bu kağıt parçaları kuru buz üzerine sperma damlatıldıktan sonra donma öncesi yerleştirilmelidir.

• Pelletler özel yuvaları olan pellet taşıyıcılarına yerleştirildikten sonra, -196oC ısıdaki sıvı azot içinde depo edilirler.

(42)

Spermanın dondurulmasında

kullanılan yöntemler

• Payet yöntemi ile spermanın dondurulması

–

Günümüzde kullanılan en yaygın ve en pratik donma

yöntemidir

–

Sperma 0,25 ml veya 0,5 ml hacimli payet denilen

plastik çubuklarda dondurulur

–

Ülkemiz laboratuvarlarında 0,25 ml payetler

kullanılmaktadır. Payetlerin bir ucu açık, bir ucu

kapalıdır. Otomatik makine veya elle bu payetlerin

içine sulandırılmış sperma doldurulur ve açık ağızları

ısı veya polivinil alkol yardımı ile kapatılır

(43)

Payet Doldurma-kapatma Makinası

(44)

Spermanın Payet Yöntemi İle

Dondurulması

• Sperma ile dolu payetler yine 5

o

C'lık ortamda taraklara dizilirler. Buradaki

amaç payetlerin üst üste yığılmasını önlemek ve donma esnasında bütün

payetlerin sıvı azot buharı ile temas etmesini sağlamaktır.

• Taraklara dizilen payetler zaman geçirilmeksizin donma kazanına

aktarılırlar ve özel ızgara bölümüne yerleştirilirler. Dondurma kazanı daha

önceden hazırlanmalıdır. Dondurma kazanı içindeki sıvı azot seviyesi,

ızgaranın bulunduğu yüksekliğe kadar getirilmelidir. Payetler içindeki

sperma sıvı azot seviyesinin yaklaşık 4 cm yukarısında 7 – 10 dakika sürede

dondurulurlar. -110 ile -120

o