Sakarya Büyükşehir Belediyesi Sanat ve Meslek Eğitimi Kursları (SAMEK)35

Inicialmente, 1,5 g do pó do caule foi homogeneizado em 20 mL de uma solução gelada de acetona contendo 10% de TCA e 2% de β-Mercaptoetanol (2-ME) durante 1 h a 4 °C. Em seguida, a precipitação foi realizada por meio da armazenagem do homogeneizado a - 80 ºC durante 2 h. Após centrifugação (15,000 x g, 20 min, 4 ºC) o precipitado resultante foi lavado duas vezes com 15 mL de acetona contendo 2 % de 2-ME, para remoção do TCA, e

centrifugado como anteriormente. O precipitado foi, por fim, submetido à secagem em dessecador na presença de sílica gel, a 4 ºC, durante à noite.

3.3.5.2 Extração das proteínas totais, lavagem e secagem do precipitado proteico

Ao precipitado obtido na etapa anterior, foram adicionados 10 mL do Tampão Tris- HCl 0,1 M, pH 8,65, contendo 30% de sacarose, 2% de SDS, 0,001 M de PMSF, 2% de 2-ME e 1% de PVPP. A amostra foi homogeneizada por 1 h e 30 min e, posteriormente, centrifugada a 10.000 x g, 10 min, 4 ºC. O sobrenadante foi armazenado temporariamente a 4 ºC, e o precipitado submetido à re-extração com 5 mL do tampão de extração sob agitação durante 30 min. Após centrifugação (10.000 x g, 10 min, 4 ºC), o sobrenadante obtido foi adicionado ao sobrenadante coletado anteriormente, e o conjunto considerado o Extrato proteico. Posteriormente, a esse extrato foi adicionado o mesmo volume do reagente Fenol- Tris, pH 8,0. A mistura obtida foi agitada durante 15 min a 4 ºC. As proteínas presentes na fase fenólica superior, gerada após centrifugação (10.000 x g, 10 min, 4 ºC), foram precipitadas pela adição de quatro volumes de 0,1 M de acetato de amônio em metanol, a -80 ºC, durante 2 h. Após centrifugação (15.000 x g por 30 min, 4 ºC), o precipitado foi lavado com 0,1 M de acetato de amônio em metanol gelado e, em seguida, três vezes com acetona 80% gelada. Entre cada lavagem com acetona, o precipitado foi incubado a 4 °C por 20 min e a suspensão centrifugada a 10.000 x g, 10 min, 4 ºC. O precipitado proteico resultante foi seco em dessecador na presença de sílica gel, a 4 ºC, durante à noite.

3.3.5.3 Ressupensão do precipitado proteico

O precipitado foi ressuspendido em 200 µL de Úreia: Tiouréia: Chaps [7 M: 2 M: 2% (m/v)] por meio de agitação a 120 rpm por 20 min, seguido de sonicação durante 10 min e repouso à temperatura ambiente, no intervalo de 20 min. Após centrifugação (10.000 x g, 10 min, 4 ºC), o sobrenadante obtido foi armazenado a 4 °C e o precipitado resultante submetido a uma nova ressuspensão pela adição de 70 µL da mesma solução de Úreia: Tiouréia: Chaps, citada acima. Ao término da centrifugação (10.000 x g, 10 min, 4 ºC), o sobrenadante foi adicionado ao obtido na ressuspensão inicial, sendo o teor de proteína do extrato final dosado.

3.3.6 Dosagem de Proteínas

O teor de proteínas totais nos extratos obtidos foi determinado conforme metodologia descrita por Bradford (1976). 2,5 mL do reagente Bradford foram adicionados a alíquotas de 0,1 mL dos extratos totais. Após 10 min de repouso, a absorbância foi determinada a 595 nm em espectofotômetro (Novaspec III da Pharmacia). Albumina sérica bovina foi utilizada para obtenção de uma curva padrão e definição do fator de correção, necessário para determinar o teor de proteínas solúveis nos extratos.

3.3.7 Análise proteômica diferencial de caules de cajueiro infectados com L. theobromae A análise proteômica da expressão diferencial de proteínas em caules de cajueiro infectados com L. theobromae foi realizada por meio da eletroforese bidimensional (O'FARREL; KLOSE, 1975). Para tanto, foram utilizadas plantas do clone BRS 226 (resistente) controles e inoculadas, assim como plantas resistentes e suscetíveis à resinose, em condições de campo com alta pressão do patógeno. A eletroforese bidimensional consistiu, inicialmente, da separação das proteínas de acordo com seu ponto isoelétrico (pI), por meio de focalização isoelétrica. Nesta etapa, foram utilizadas fitas de gradientes de pH imobilizados em géis de poliacrilamida (IPG) de 13 cm, pH 3-10 (GE Healthcare). As amostras proteicas foram solubilizadas em solução de rehidratação [uréia 7M, tiouréia 2M, DTT 0,065 M, CHAPS 2% (m/v), tampão IPG 2% (v/v) e azul de bromofenol 0,02% (m/v)] durante 16 h em cubas de rehidratação (Reswelling Tray II, Pharmacia Biotech). Em seguida, as fitas rehidratadas foram submetidas à separação isoelétrica utilizando a seguinte programação: 200 V por 45 min; 500 V por 45 min; 1000 V por 1 h; 5000 V por 1 h; 8000 V até atingir 18000 Volts/hora totais.

Após focalização isoelétrica, as fitas foram equilibradas sob agitação lenta, por 20 min em solução de equilíbrio e redução [Tris-HCl 50 mM, pH 8.8, contendo glicerol 30% (v/v), ureia 6 M, SDS 2% (m/v), DTT 2% (m/v) e azul de bromofenol] e, posteriormente, lavadas com solução de alquilação [Tris-HCl 50 mM pH 8.8, glicerol 30% (v/v), ureia 6 M, SDS 2% (m/v), iodoacetamida 2,5% (m/v) e azul de bromofenol] por 20 min, sob leve agitação.

A 2º dimensão (SDS-PAGE) foi realizada em gel vertical homogêneo (14 x 14 cm) por meio da fixação das fitas focalizadas sobre o gel de poliacrilamida, utilizando solução de agarose 0,5% (m/v). A separação das proteínas, de acordo com suas massas moleculares, foi

realizada a 5 °C, usando a fonte Power-Pac 3000 (Bio-Rad). A corrida foi composta de duas etapas: 15 mA/gel durante 1 h, e 25 mA/gel até que o indicador (azul de bromofenol) saísse do gel (aproximadamente, 5:30 h). As proteínas foram visualizadas com Comassie Brilliant Blue (CBB) coloidal (CANDIANO, 2004). As imagens dos géis com proteínas coradas foram obtidas por meio do ImageScanner (Amersham Biosciences) e analisadas pelo programa LabScan v. 5.0 (GE Healthcare). As imagens dos géis foram processados e analisados utilizando o programa PDQuest, versão 7.3.1 (Bio-Rad, EUA). Para tanto, as etapas de processamento incluíram filtração da imagem, detecção dos spots e quantificação da intensidade, além da eliminação de back-ground. Os mapas bidimensionais foram avaliados como um conjunto único, representado por um gel de referência (máster), gerado a partir dos demais mapas experimentais. Dessa forma, os spots consistentemente presentes nos géis remanescentes foram adicionados ao máster, de modo que pudessem ser combinados para todas as amostras. Além disso, a massa molecular (kDa) de cada proteína foi estimada utilizando um conjunto padrão de marcadores e os pontos isoelétricos foram determinados pelas posições dos spots ao longo das tiras com gradiente de pH imobilizado. Então, os spots marcados nos géis, com intensidade registrada pelo PDQuest, foram submetidos à análise estatística.

3.3.8 Análise estatística da expressão diferencial de proteínas

As intensidades dos spots proteicos (medidas em pixels) registrados nos perfis bidimensionais foram avaliadas quanto à normalidade da sua distribuição utilizando o teste de Shapiro-Wilk, enquanto que para avaliação da assimetria e curtose, o procedimento UNIVARIATE foi empregado com a opção NORMAL do aplicativo estatístico SAS (v 9.0, 2002). Transformações logarítmicas [log (x+1)] foram realizadas quando necessário. As variáveis que apresentaram distribuição normal e as que foram ajustadas à normalidade, após transformação, foram consideradas paramétricas, enquanto aquelas que não apresentaram distribuição normal foram consideradas não paramétricas.

As variáveis paramétricas foram submetidas à análise de variância por meio do procedimento GLM (do inglês, General Linear Model) do SAS. Médias das intensidades dos spots dos grupos resistente e suscetível, em condição de campo, foram comparadas usando o teste t de Student. Para plantas do clone BRS 226, a análise de variância realizada pelo GLM utilizou como fontes de variação a interação entre o tratamento avaliado (controle e

inoculado) e o tempo de análise (12, 24, 48, 72 e 96 HAI), e as médias das intensidades dos spots foram comparadas por meio do Método dos Quadrados Mínimos, entre os diferentes tratamentos dentro de cada tempo avaliado.

As variáveis não paramétricas, tanto para perfis bidimensionais da condição de campo como para perfis do clone BRS 226, foram avaliadas por meio do teste de Mann-Whitney utilizando o procedimento NPAR1WAY. Os resultados foram apresentados na forma de médias e desvios padrão. Diferenças foram consideradas significativas quando p < 0,05.

3.3.9 Processamento dos spots, espectrometria de massas e identificação de proteínas diferencialmente expressas

Os spots correspondentes às proteínas diferencialmente expressas foram excisados do gel e digeridos com tripsina (Promega, Madison, WI, USA). Para tanto, os spots de interesse excisados foram descorados com 400 l de 0,025 M de NH4HCO3 (m/v) e acetonitrila (ACN) 50% (v/v) até a remoção completa do corante, CBB coloidal. Posteriormente, as partículas do gel foram desidratadas com 200 l de ACN 100% (v/v) por 5 min, até tornarem-se opacas e, então, secas a vácuo em Speed Vac (Savant) por 15 min. Os pedaços de gel secos foram incubados com tripsina grau sequenciamento (20 ng/μL em NH4HCO3 50 mM) a 37 °C em banho-maria, por 17 h. Os peptídeos tripsinizados foram extraídos de cada spot-gel com 30 l da solução de NH4HCO3 0,025 M, ACN 50% (v/v) e ácido trifluoracético 5% (v/v), com auxílio de vórtex a 90 rpm, por 30 min (2 vezes). O sobrenadante contendo os peptídeos trípticos extraídos foi, então, concentrado em Speed Vac (Savant).

Os peptídeos secos foram dissolvidos em solução de ácido fórmico 0,1% (v/v) e, posteriormente, submetidos à análise por espectrometria de massas. Análises de MS/MS foram realizadas em um espectrômetro de massas caracterizado por uma fonte de ionização por eletrospray (ESI), dois analisadores de massas - um quadrupolo (Q) associado a um tubo no qual se mede o tempo de vôo dos íons (TOF) e um detector de íons. Um sistema de cromatografia líquida de ultra performace - UPLC (Waters, Milford, US) foi acoplado on-line ao ESI-Q-TOF. Os peptídeos foram separados em uma coluna capilar nano -C18 (75 μm x 10 cm) com uma razão de fluxo de 0.35 µL/min. Os espectros de massa foram adquiridos pelo instrumento Synapt G1 HDMS Acquity UPLC (Waters Co., Milford, MA, EUA), utilizando Aquisição de Dados Dependente (DDA), onde os três principais picos foram selecionados e sujeitos a MS/MS.

Os peptídeos foram eluidos por meio de um gradiente de água-ACN, segundo o qual as fases móveis A e B foram constituídas de 0,1% de ácido fórmico em água e 0,1% de ácido fórmico em acetonitrila, respectivamente. As condições do gradiente foram: 1 min, com 5% de B, aumentando linearmente para 40% de B em 30 min, e posteriormente, para 80% de B em 10 min, onde permaneceu até 35 minutos e nos 5 minutos seguintes houve uma redução para 3% de B. Os espectros de íons resultantes foram coletadas e processadas utilizando o programa Protein Lynx Global Server 2, sendo posteriormente convertidos para arquivos de micromassa (PKL) usados para a pesquisa de sequências contra o banco de dados do NCBI (National Center for Biotechnology Information) por meio do programa MASCOT v.2.2 (Matrix Science – www.matrixscience.com).

Para a correta indentificação das proteínas, as buscas de similaridade com proteínas depositadas no NCBI foram realizadas com limitação taxonômica para “Viridiplantae taxa”, além disso, os peptídeos foram considerados identificados, quando o valor do score excedeu valor limiar de extensa similaridade ou identidade calculado pelo Mascot (p<0,05). Cada proteína identificada foi, então, categorizada de acordo com o processo biológico com o qual está envolvida e compartimentalização celular usando dados do UniProt (http://www.ebi.uniprot.org). Quando as informações não estavam disponíveis, as proteínas foram anotadas manualmente com base em pesquisas bibliográficas.

3.3.10 Rede de interação das proteínas diferencialmente expressas

A rede de interação funcional das proteínas identificadas neste estudo foi realizada usando o programa STRING versão 9.05 (Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins), disponível online (http://string-db.org/). A lista de proteínas diferencialmente expressas foi explorada contra o banco de dados de Arabidopsis thaliana depositados no STRING. As relações físicas e funcionais das proteínas responsáveis pela rede de interação proteína-proteína foram estabelecidas com o apoio de associações decorrentes de quatro fontes possíveis: contexto genômico, dados experimentais/bioquímicos, co-expressão e informações previamente estabelecidas. Portanto, estes dados de interação são quantitativamente integrados pelo STRING formando uma rede funcional de proteínas.

3.3.11 Preparação dos extratos enzimáticos de caules de plantas de cajueiro, crescidas em campo, resistentes e suscetíveis à resinose

Os extratos enzimáticos foram obtidos por meio do contato do pó do caule, previamente liofilizado e pulverizado em moinho, com o tampão de extração [acetato de sódio 0,05 M, pH 5,2, contendo 0,15 M de NaCl e 3% (v/v) de PEG] sob leve agitação a 4 °C, por 1 h. A relação massa (tecido): volume (tampão) utilizada foi 1:15 (m/v). Posteriormente, a suspensão foi centrifugada (15.000 x g, 4 ºC, 20 min) e o sobrenadante coletado dialisado contra o tampão de extração sem PEG, em membrana de diálise (Sigma) com poros de exclusão de 14,3 KDa. Os extratos enzimáticos foram novamente centrifugados (10.000 x g, 4 °C por 20 min) e o sobrenadante usado para determinação das atividades enzimáticas.

3.3.12 Determinação das atividades das enzimas superóxido dismutase, ascobarto

peroxidase, peroxidase do guaiacol, fenilalanina amônia liase e β-1,3-glucanase de caules de plantas de cajueiro, crescidas em campo, resistentes e suscetíveis à resinose

A atividade da superóxido dismutase (SOD, EC 1.15.1.1) foi avaliada segundo metodologia descrita por Van Rossum et al. (1997). O princípio do ensaio consiste na ação do radical superóxido (O2•-), formado no meio reacional, em converter o nitro azul de tetrazólio (NBT) para formazana azul. A presença da SOD na amostra inibe essa reação final, portanto, a medida de inibição da fotorredução do NBT é usada como parâmetro para determinação da presença e atividade da enzima. No ensaio, alíquotas de 50 µL de extrato caulinar dialisado foram adicionadas em uma placa de micropoços contendo uma mistura composta por 0,02 mL de tampão fosfato de sódio 0,5 M, pH 7,8, 0,01 mL de Triton X-100 0,50% (v/v), 0,02 mL de L-metionina 0,13 M, 0,01 mL de EDTA 0,002 M, 0,02 mL de NBT 0,001 M, 0,02 mL de riboflavina 0,00075 M e 300 µL água grau Milli-Q. A adição do NBT e da riboflavina foi feita na ausência de luz. A mistura reacional foi exposta à luz (lâmpada fluorescente de 32 W), dando início à reação, por 5 min. A produção de formazana azul foi medida pela leitura de absorbância a 630 nm, em intervalos de 1 min, por uma leitora de ELISA (“Automated Microplate Reader”, modelo ELX800-Bio-Tek Instruments®_{, Inc.). No branco da reação,} todos os reagentes, com exceção do extrato caulinar, foram colocados, permitindo redução máxima do NBT. Uma unidade de atividade (UA) da SOD foi definida como a quantidade da enzima necessária para inibir 50% da fotorredução do NBT à formazana azul, em relação ao

controle positivo, e foi expressa como unidade de atividade por g de massa fresca do caule (UA/g MF).

A atividade da ascobarto peroxidase (APX, EC. 1.11.1.11) presente no extrato caulinar foi realizado segundo Koshiba (1993) e Peixoto et al. (1999), com algumas modificações. 0,1 mL do extrato enzimático foi adicionado a 0,8 mL de tampão fosfato de potássio 0,05 M, pH 6,0, contendo 0,0005 M de ácido ascórbico e previamente incubado a 30 °C. A reação foi iniciada pela adição de 0,1 mL de uma solução de peróxido de hidrogênio 0,002 M. O decréscimo na leitura de absorbância a 290 nm, no intervalo de 10-120 s, foi medido como índice de oxidação do ascorbato. A atividade da APX foi determinada utilizando uma curva padrão construída a partir de concentrações conhecidas de ascorbato (0,1 - 1,0 µmoL ascorbato/mL) e expressa em ηmol de ascorbate oxidado/min por grama de massa fresca (ηmol Asc g-1 _FW).

Para determinação da atividade da peroxidase do guaiacol (POX, EC 1.11.1.7) foi utilizada a metodologia escrita por Urbanek et al. (1991). Como substratos para a reação foram utilizados guaicol como doador de prótons e o peróxido de hidrogênio como receptor. A mistura reacional consistiu de alíquotas de 0,1 mL do extrato total, 0,9 mL de tampão acetato de sódio 0,05 M, pH 5,2, 0,5 mL de guaiacol 0,02 M e 0,5 mL de peróxido de hidrogênio 0,06 M, perfazendo um volume total de 2,0 mL. A mistura foi incubada em banho- maria a 30 °C e a leitura da absorbância do composto colorido 3,3‟-dimetoxi-4-4‟- bifenolquinona, formado na reação, foi medida a 480 nm (espectrofotômetro Genesys 10S UV-VIS; Thermo Scientific), durante 2 min em intervalos de 20 segundos. A variação de 1,0 unidade de absorbância por min foi assumida como sendo 1,0 unidade (UA) de atividade peroxidásica, sendo expressa em unidades de atividade por g de massa fresca do caule (UA/g MF).

A atividade da fenilalanina amônia liase (PAL, EC 4.3.1.5) foi determinada de acordo com a metodologia descrita por El-Shora (2002) e Mori et al. (2001), com algumas modificações. A atividade foi medida pela quantidade de ácido trans-cinâmico produzido, a partir da desaminação da L-fenilalanina. A mistura reacional consistiu de 0,1 mL do extrato enzimático, 0,2 mL de L-fenilalanina 0,04 M, 0,02 mL de β-mercaptoetanol 0,05 M, 0,58 mL de tampão Tris-HCl 0,1 M, pH 8,8. Essa mistura foi incubada por 1 h, a 30 °C. A reação foi parada pela adição de 0,1 mL de HCl 6 M e a mistura centrifugada a 10.000 x g por 10 min, a 25 °C. O branco do ensaio consistiu na adição da L-fenilalanina após parada da reação com

HCL. Após leituras de absorbância a 290 nm, a atividade da PAL foi determinada utilizando uma curva padrão construída a partir de concentrações conhecidas de ácido trans-cinâmico (0,01 – 0,1 µg ácido trâns-cinâmico/mL). A atividade da PAL foi expressa como a quantidade (pmol) de ácido trans-cinâmico produzido por grama de massa fresca do caule por segundo (pmol/g MF/s).

A atividade da enzima β-1,3-glucanase (GLU, EC 3.2.1.39) foi determinada segundo o método descrito por Boller (1992) e medida em função da velocidade de formação de glucose a partir da degradação da laminarina, polissacarídeo usado como substrato. Uma vez liberados, os monômeros de glucose reduzem sais de cobre, em solução alcalina, que irão produzir um composto de coloração azul, passível de ser quantificado por colorimetria. A solução de laminarina (2,0 mg/L) foi dissolvida em água grau Milli-Q, aquecida a 60 ºC, por 10 minutos e, em seguida, dialisada exaustivamente contra água grau Milli-Q para remoção da glucose livre. No ensaio, 0,1 mL de extrato enzimático foi incubado com 0,9 mL da solução de laminarina, a 50 °C por 30 min. A seguir, 1,0 mL da solução “D” [1,0 mL da solução “B” (15,0 g de sulfato de cobre pentahidratado, 0,02 mL de ácido sulfúrico e água grau Milli-Q q.s.p. 100 mL) mais 25 mL da solução “A” (25,0 g de carbonato de sódio anidro, 25,0 g de tartarato de sódio e potássio, 20,0 g de bicarbonato de sódio, 200,0 g de sulfato de sódio anidro e água grau Milli-Q q.s.p. 1000 mL)], preparada no momento do ensaio, foram adicionadas e a mistura aquecida a 98 °C, em banho-maria, por 20 min. Após resfriamento em água corrente, por 5 min, 1,0 mL da solução “C” [3,0 g de arseniato de sódio e água grau Milli-Q, q.s.p. 25,0 mL] foi acrescido e, logo em seguida, os tubos foram agitados vigorosamente, em vórtex, até a completa remoção dos gases formados na reação. Leituras de absorbância a 520 nm foram feitas e a quantidade de monômeros de glucose liberados determinada utilizando uma curva padrão construída a partir de concentrações conhecidas de glucose, variando de 7,5 a 240 µg/mL, em tampão acetato de sódio 0,05 M, pH 5,2. A atividade β-1,3-glucanásica foi expressa em nanokatal por grama de massa caulinar (ηkat/g MF), sendo 1,0 ηKat equivalente a 1,0 nmol de glucose liberado por segundo, nas condições do ensaio.

3.3.13 Western blot de expressão da ascobarto peroxidase de caules de plantas de cajueiro, crescidas em campo, resistentes e suscetíveis à resinose

20 µg do extrato total de proteínas a partir de plantas resistentes e suscetíveis foram aplicados em gel SDS-PAGE (12,5%) e em seguida transferidos para membrana de nitrocelulose (GE Healthcare, USA) usando um sistema de transferência (TE 22 tank transfer unit, GE Healthcare, USA) a 100 V, 200 mA e 40 W, durante 2 horas. Posteriormente, as membranas foram bloqueadas, durante à noite, com tampão PBS (50 mL de fosfato de sódio 0,1 M, pH 7,4, contendo 0,13 M de NaCl) sob agitação suave, a 4 °C e, então, incubadas por 2 horas com o anticorpo primário produzido em coelhos contra ascorbato peroxidase citosólica (anti-APX, Agrisera) e utilizado para a imunodetecção na diluição de 1: 10.000.

As membranas foram novamente lavadas três vezes com PBS e incubadas com um anticorpo secundário específico para imunoglobulinas de coelho (Agrisera), conjugado com fosfatase alcalina, usado na diluição de 1:2.000 por mais 2 h. Seguindo-se as três lavagens com PBS, a imunorreação foi visualizada por exposição das membranas ao tampão Tris-HCl (0,1 M), pH 9,0, contendo BCIP® (fosfato de tetrazólio-5-bromo-4-cloro-3-indolilo, 0,15 mg/mL), NBT (azul de nitro-tetrazólio, 0,30 mg / mL ), NaCl (0,15 M) e MgCl2 (0,001 M). A reação foi parada por lavagem exaustiva das membranas com água grau Milli-Q.

4. RESULTADOS

4.1 Sintomas de lesão interna em caules de clones resistente e suscetível à resinose

Plantas do clone BRS 226, usadas para avaliação da expressão diferencial de proteínas após infecção com L. theobromae, exibiram sintomas de exsudação de resina e escurecimento interno do lenho, conforme demonstrado na figura 6. Tais sintomas são característicos da presença do fitopatógeno e foram observados em 72 e 96 HAI, de modo que plantas controles não apresentaram qualquer tipo de exsudação de resina, indicando ausência de infecção.

Figura 6. Plantas de cajueiro, clone BRS 226, infectadas com L. theobromae. A) Sintoma de exsudação de resina no ponto de inoculação com o fitopatógeno. B) Caules de plantas infectadas e controles com 72 horas após inoculação.

Para avaliar a progressão comparativa destes sintomas entre os clones BRS 226 (resistente) e CCP 76 (suscetível) foi realizada, em 72 e 96 HAI, medida do comprimento da lesão interna da doença no caule, tomando como critério de medição a região escurecida do lenho ao redor do ponto de inoculação, uma vez que a presença de cor amarronzada pode ser observada atingindo o câmbio vascular, quando cortes transversais ou longitudinais são feitos no tronco e ramos lenhosos (FREIRE et al. 2002, 2004; FREIRE e CARDOSO, 2003).

A análise de variância mostrou que houve interação significativa entre os fatores tratamento e tempo, como observado na Tabela 1. Baseado nos dados obtidos foi possível constatar que com 72 HAI, plantas controles e inoculadas dos clones BRS 226 e CCP 76 apresentaram valores médios de lesão interna que não diferem estatisticamente entre si.

Contudo, com 96 HAI, a progressão da lesão nas plantas inoculadas do clone CCP 76 mostrou maior extensão de necrose no caule (Figura 7), o que é compatível com a característica de suscetibilidade, registrada em outros trabalhos (CARDOSO et al., 2010; MUNIZ et al., 2011).

Tabela 1. Comprimento médio da lesão interna (cm) em caules de cajueiro, clones BRS 226 e CCP 76, inoculados com L.theobromae, avaliado no período de 72 e 96 horas após inoculação (HAI).

Clone Tratamento Comprimento da lesão (cm)

72 HAI 96 HAI

CCP 76 (S) Controle _{Inoculado 0,81 Ab} 0,50 Aa 0,76 Ba _{1,47 Aa} BRS 226 (R) Controle _Inoculado 0,43 Aa _{0,71 Aa} 0,53 Ba _{0,72 Ba}

Desv. Padrão Geral 0,23

Médias seguidas da mesma letra maiúscula na coluna e minúscula na linha não diferem entre si pelo teste de Tukey (p≤ 0,05). S, suscetível; R, resistente ao L. theobromae.