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Em plantas de cajueiro, proteínas categorizadas como relacionadas ao estresse correspondem ao segundo maior grupo com expressão alterada para ambos os cenários investigados. Quando se trata de resinose, a manutenção da homeostase celular é uma característica potencialmente importante, uma vez que o processo infeccioso iniciado por L. theobromae é induzido por estresses, principalmente de ordem fisiológica (CARDOSO et al., 2009a). As pressões ambientais são fatores predisponentes ao desenvolvimento de resinose, aliado ao caráter oportunista do patógeno (ALVES et al., 2013). Na região semiárida, o estresse hídrico é um fenômeno recorrente, afetando osprocessos bioquímicos e fisiológicos do cajueiro (BEZERRA et al., 2007) e tornando estas plantas mais propensas a infecção.

O estresse térmico, também prevalente em condições semiáridas, tem sido associado a mudanças no padrão de transcritos que resultam no aumento da síntese de um grupo de proteínas conhecidas como heat schock (Hsp) (AL-WHAIBI, 2011). O acúmulo destas proteínas, no ambiente celular, ocorre quando os mecanismos moleculares de termolerância são acionados para prevenir ou reparar os danos ocasionados em proteínas e membranas, lábeis ao calor (SCHOFFL et al., 1998; LARKINDALE e VIERLING, 2008). As Hsps, mais abundantemente expressas, correspondem às famílias altamente conservadas de chaperones moleculares Hsp100, Hsp90, Hsp70, Hsp60 e as pequenas Hsps, com massa molecular entre 17 e 30 kDa (EFEOGLU, 2009). No presente estudo, 5 Hsps tiveram sua expressão alterada em cajueiros cultivados em condições de campo (spots R15, R19 e S13) e no clone BRS 226 (spots 9 e 21). Entre elas, uma chaperona Hsp20 foi igualmente subexpressa em plantas inoculados do clone BRS 226 (spot 21), assim como, no grupo de plantas resistentes (spot S13), em condições de campo, indicando alteração da expressão associada à infecção com L. theobromae, uma vez que estas plantas compartilham este estresse biótico comum. Algumas dessas chaperonas, por sua vez, reconhecem proteínas deformadas atuando no controle da qualidade e evitando a formação de agregados potencialmente tóxicos durante o estresse (TIMPERIO et al., 2008; SAIDI et al., 2009). A subexpressão da Hsp20 pode estar relacionada à tentativa do patógeno em interferir nos mecanismos moleculares associados à prevenção de danos celulares decorrentes da condição de estresse, tornando as plantas de cajueiro mais suscetíveis ao desenvolvimento da infecção.

Poucos relatos tem associado o papel das sHsps (do inglês, small Heat Schock Proteins) na interação planta-patógeno. Maimbo et al. (2007) demonstraram que a expressão

de uma sHsp de 17 kDa foi aumentada em folhas de tabaco na interação compatível e incompatível com Ralstonia solanacearum e Pseudomonas cichorii, respectivamente. O crescimento da bactéria R. solanacearumfoi acelerado nas plantas de Nicotiana benthamiana com expressão silenciada da sHsp (Nbshsp17), sugerindo importante papel na resistência à doença.Essa observação foi consistente com a redução na expressão de genes relacionados à defesa, incluindo PR1 (do Inglês, Pathogenesis-related 1), PR4 (do Inglês, Pathogenesis- related 4), e EREBP (do Inglês, Et-Responsive element-binding protein) nas plantas Nbshsp17-silenciadas (MAIMBO et al., 2007).

Garofalo et al. (2009) especularam que sHsps induzidas em plantas de laranja e pimenta desafiadas, respectivamente, com Xanthomonas axonopodis e Xanthomonas campestris, podem participar na resposta imune basal, uma vez que são expressas em fases iniciais da infecção. Plantas expostas a um agente patogênico mostram rápida expressão de proteínas envolvidas na resposta imune, o que pode sobrecarregar, no ambiente celular, as chaperonas Hsp70 e Hsp60, também identificadas previamente nos patossistemas mencionados (GARAVAGLIA et al., 2009). Dessa forma, foi sugerido que sHsps podem ajudar a planta a se ajustar aos organismos invasores, contribuindo com a manutenção das proteínas sintetizadas numa conformação aberta, até que elas possam ser corretamente dobradas pelas chaperonas Hsp70 e Hsp60 (GAROFALO et al., 2009).

Uma Hsp70 foi superexpressa em plantas de cajueiro do clone BRS 226, 48 e 72 HAI. Moléculas efetoras HopI1 de Pseudomonas syringae apresentam um domínio J que interage com Hsps 70. Uma possível hipótese para interação específica deste efetor com Hsp70 foi levantada, segundo a qual, proteínas Hsp70 afetam o enovelamento/montagem de um complexo de defesa localizado no cloroplasto, possivelmente representado por componentes da biossíntese do ácido salicílico ou relacionados ao seu transporte. Dessa forma, a estratégia de P. syringae estaria centrada no fato de que a presença de HopI1 pode interferir com a defesa porque pode sobrecarregar Hsp70, facilitando a degradação ou desmontagem do complexo de promoção da defesa (JELENSKA et al., 2007). Contudo, o papel das Hsps70 na resistência basal foi evidenciado pelo aumento da suscetibilidade a bactéria não patogênica P. syringae pv. maculicola em plantas mutantes ou down-reguladas para expressão de Hsp70 (JELENSKA et al., 2010).

Em outros modelos, proteínas Hsp70, também, identificadas na interação do clone BRS 226 com L. theobromae, são, na verdade, alvos comuns visados pelos patógenos de

plantas e animais, que suprimem ou exploram sua atividade como estratégias de infecção (MULTHOFF, 2006; NOËL et al., 2007; CHEN et al., 2008; AXSEN et al., 2009). Os mecanismos empregados por Hsps70 em resposta à interação de plantas com diferentes patógenos, incluindo proteínas alvos e os processos celulares envolvidos, ainda não são compreendidos, porém seus resultados influenciam, fortemente, no sucesso ou não da infecção (JELENSKA et al., 2010).

Em plantas de tomate, óxido nítrico (NO) e peróxido de hidrogênio (H2O2) participam na regulação da produção e acúmulo de Hsps70 sob condições de estresses abióticos e bióticos, mas, o tipo de resposta depende, fortemente, da capacidade da planta em acionar diferentes mecanismos de defesa (PITERKOVÁ et al., 2013).

Coerente com a contribuição das espécies reativas de oxigênio (ROS) na transdução de sinal para expressão de Hsps em plantas (VOLKOV et al., 2006; KÖNIGSHOFER et al., 2008; BANTI et al., 2010), no presente estudo, proteínas diretamente relacionadas ao estresse oxidativo foram reprogramadas nas condições de campo (spots S2, S4, S16, R9) e no clone BRS 226 (spots 07, 10, 27 e 28), contudo estas respostas parecem ser diferencialmente reguladas.

Sabe-se que após o desafio da planta por patógenos, várias enzimas são acionadas como NADPH oxidase, peroxidases, superóxido dismutase (SOD), oxalato oxidases, lipoxigenases e amino oxidases, todas envolvidas na geração de ROS (SHETTY et al., 2008). Eventos precoces de sinalização, incluindo o fluxo de íons através da membrana plasmática, aumento dos níveis de Ca2 + no citoplasma, ativação de MAPKs (do Inglês, mitogen-activated protein kinase) e consequente produção de ROS podem ser ativados dentro de poucos minutos após a exposição ao estímulo (BENSCHOP et al., 2007; MILLER et al., 2009; FINKA et al., 2012; BAXTER et al., 2013). Essa sobrecarga de ROS na planta proporciona uma condição de estresse oxidativo, conhecido como explosão oxidativa, podendo levar a danos celulares e em componentes como ácidos nucléicos, proteínas e lipídeos (GILL e TUTEJA, 2010; KOVALCHUK, 2010). Portanto, o acúmulo de ROS deve ser contrabalanceado por sistemas antioxidantes, dentre os quais, a ação de enzimas como catalase, ascorbate peroxidase e peroxiredoxinas (NAVROT et al., 2011).

Algumas moléculas geradas durante a explosão oxidativa são consideradas moléculas de sinalização, sendo percebidas por diferentes receptores, proteínas ou enzimas da planta (MITTLER et al., 2011). A geração destas espécies tem papel significativo para a resistência

a patógenos biotróficos e hemibiotróficos, no entanto, tem sido sugerido que as ROS funcionam como fator de virulência para fungos necrotróficos (WEN, 2013), uma vez que seu acúmulo induz à morte celular, favorecendo o crescimento do patógeno e desenvolvimento da doença (GOVRIN e LEVINE, 2000).

A expressão alterada de enzimas envolvidas no processo de remoção dessas espécies, observada neste estudo, indica que houve estresse oxidativo em plantas de cajueiro quando desafiadas com L. theobromae. De fato, no clone BRS 226, uma proteína tipo 2-cys peroxirredoxina (spot 10) foi superexpressa em 12 e 24 HAI, evidenciando possível explosão oxidativa em tempos iniciais após infecção com L. theobromae. Proteínas deste tipo pertencem à família das peroxirredoxinas, que usam o conservado resíduo de cisteína para reduzir o peróxido de hidrogênio, com consequente formação de pontes de dissulfeto (KIM et al., 2009). Um novo estado reduzido, destas pontes, garante o mecanismo catalítico das 2-cis peroxirredoxinas e é alcançado com o auxílio de sistemas de redução baseados na atuação de tiorredoxinas e glutarredoxinas (ROUHIER et al., 2008; MEYER et al., 2009). Em condições de campo, proteínas envolvidas com estes sistemas foram mais expressas em plantas suscetíveis e correspondem aos spots S4 e S16.

Coerente com a expressão da 2-cys peroxirredoxina, outra proteína envolvida com a homeostase redox foi superexpressa em plantas inoculadas do clone BRS 266, correspondendo a uma proteína dissulfeto isomerase (spot 07). Esta enzima teve sua expressão reprogramada no período de 24 HAI, em paralelo com a superexpressão da 2-cys peroxirredoxina. Contudo, esta alteração na expressão foi também evidenciada no intervalo de tempo em que sintomas característicos de infecção com L. theobromae foram observados, isto é, com 72 e 96 HAI. A proteína dissulfeto isomerase (PDI) catalisa a formação, redução e isomerização de pontes dissulfeto em proteínas secretórias nascentes no lúmem do retículo endoplasmático, exibindo atividade de chaperona (CHRISTIS et al., 2008; HATAHET e RUDDOCK, 2009).

A superexpressão da PDI em plantas desafiadas com fitopatógenos tem sido observada em estudos proteômicos diferenciais (AFROZ et al., 2009; FANG et al., 2012; PALOMARES-RIUS et al., 2011) e sua participação na interação-planta patógeno pode estar relacionado ao correto enovelamento de proteínas relacionadas à defesa (GRUBER et al., 2007). De acordo com esse papel, o significado biológico da expressão das dissulfeto isomerases (NbERp57 e NbP5) na resitência do tabaco ao TMV (do Inglês, Tobacco mosaic

vírus) foi estudado por meio do silenciamento destas proteínas, seguido de infecção, o que resultou em baixo fenótipo de resistência, indicando a necessidade destas isomerases na completa ativação da resposta imune (CAPLAN et al., 2009).

Um especial interesse tem sido dado à expressão de tiorredoxinas na resposta de plantas a fungos necrotróficos. No nosso estudo, em condições de campo, uma proteína tipo tiorredoxina (spot S4) foi superexpressa no grupo suscetível de cajueiros, em relação ao grupo resistente. Estas proteínas, juntamente com glutarredoxinas, têm sido sugeridas como alvos diretos ou indiretos de virulência para patógenos necrotróficos em Arabidopsis thaliana (LAI e MENGISTE, 2013). De acordo com esta premissa, TRX-h5 e TRX-h3 são requeridas para a transição do estado oligomérico de NPR1 (do Inglês, Non expressor of pathogenesis-related genes 1) para o monomérico (TADA et al., 2008), necessário na interação física com os fatores transcricionais TGA, que induzem a expressão dos genes de defesa (LINDERMAYR et al., 2010). A ativação de NPR1, por sua vez, aumentou a suscetibilidade de A. thaliana a B. cinerea (EL OIRDI et al., 2011).

A aparente contradição desse cenário é explicada pela suscetibilidade acionada por toxina, segunda a qual, muitos patógenos necrotróficos secretam toxinas que servem como fatores de virulência sensíveis à percepção do hospedeiro e que por sua vez, aumentam a suscetibilidade (MENGISTE, 2012). De fato, as respostas observadas nesta interação apresentam um significado inversamente correlacionado a ETI (OLIVER e SOLOMON, 2010). Nesse contexto, a resistência contra patógenos necrotróficos é sugerida pela existência de genes dominantes que codificam proteínas que desintoxicam toxinas secretadas pelo invasor, que garantem à insensibilidade a presença delas ou que aumentam a tolerância à morte celular induzida (LAI e MENGISTE, 2013).

Baseados nesse modelo, a superexpressão de uma proteína tipo tiorredoxina em plantas de cajueiro suscetíveis à resinose, em condições de campo, pode atuar regulando o estado redox de proteínas alvos em decorrência da perturbação por fatores de virulência de L.theobromae, influenciando na suscetibilidade. Uma evidência direta dessa condição de suscetibilidade para patógenos necrotróficos é exemplificada pela toxina vitorina de Cochliobolus victoriae que interage com a tiorredoxina TRX-h5 da planta, permitindo o reconhecimento desta toxina pela proteína R LOV1, o que condiciona à sensibilidade a essa toxina, com consequente suscetibilidade ao agente patogênico (LORANG et al., 2012).

Alteração no estado redox em plantas de cajueiro suscetíveis foi evidenciada pela observação de que as enzimas peroxidase (spot S2) e glutationa redutase (spot S16) foram superexpressas. Em contrapartida, nas plantas de cajueiro resistentes somente uma enzima removedora de peróxido, identificada como uma ascobarto peroxidase citosólica (spot R9), foi superexpressa em relação ao grupo suscetível. A tendência na superexpressão desta enzima no grupo de plantas resistentes foi confirmada por análise de western blot (Figura 19). A ascobarto peroxidase atua com alta afinidade na eliminação de H2O2, usando como doador de elétrons o ascobarto, que é restaurado ao seu estado reduzido pela MDHAR (monodeidroascorbato redutase) de forma dependente de NADPH (NAVROT et al., 2011). O genótipo resistente de Theobroma cacao (TSH1188) mostrou aumento na expressão de genes que codificam ascobarto peroxidases citosólicas, em comparação com o genótipo suscetível (Catongo), sugerindo que estas enzimas atuam na defesa dessas plantas quando são infetadas pelo fungo Moniliophthora perniciosa (CEITA et al., 2007; DIAS et al., 2011).

Curiosamente, somente duas proteínas diretamente relacionadas à defesa vegetal foram identificadas nas plantas de cajueiro do clone BRS 226 e em plantas de cajueiro cultivadas em condição de campo. No clone BRS 226, houve subexpressão de uma proteína tipo germina (spot 33) com 96 HAI. Proteínas desse tipo foram originalmente identificadas em trigo, como marcadores específicos do estado de germinação (LANE et al., 1993). Registros do aumento da expressão de genes relacionados a essas proteínas foram mostrados no ataque de plantas a fungos (MANOSALVA et al., 2008), nematóides (KNECHT et al., 2010), insetos (RAMPUTH et al., 2002; Lou e Baldwin, 2006), bactérias e vírus (Park et al., 2003; BARRERA-PACHECO et al., 2008).

O estudo do papel fisiológico das GLPs (do Inglês, Germin-like proteins) na defesa celular tem focado na expressão e mecanismo de defesa dessas proteínas no apoplasto (FELLE et al., 2005), onde sua interação com a parede celular é capaz de responder, em estágios iniciais, ao desafio de patógenos e em regiões próximas ao sítio de infecção (DAVIDSON et al., 2010). GLPs podem atuar no reforço da parede celular e exibir atividade única ou combinada das enzimas oxalato oxidase e superóxido dismutase, que resulta na produção de H2O2 (DUNWELL et al., 2008; BANERJEE e MAITI, 2010). O papel pressuposto dessas atividades pode explicar a possível subexpressão dessa proteína em plantas inoculadas do clone BRS 226, uma vez que o H2O2, juntamente com outras ROS, atua em vias de sinalização para percepção do patógeno acionando, por exemplo, a morte celular

favorável para o desenvolvimento de invasores necrotróficos. A manutenção de baixos níveis de ROS pode ser pensada como um mecanismo importante nas plantas de cajueiro, em períodos de tempo onde o patógeno parece desenvolver sintomas severos de infecção, como observado com 96 HAI.

Outra proteína relacionada à resposta basal foi superexpressa em plantas resistentes de cajueiro, infectadas em condições de campo. As serpinas (spot R14) têm um papel no controle da proteólise por inibição irreversível de proteínas alvos. Dessa forma, elas são pensadas como inibidores, elicitados na defesa, contra proteases presentes no intestino de insetos ou secretadas por microrganismos, o que determina a redução na disponibilidade de aminoácidos necessários para o crescimento desses organismos (ROBERTS e HEJGAARD, 2008). Na interação planta-patógeno proteínas dessa classe foram identificadas sendo superexpressas em raízes de Actinidia chinensis durante a infecção sistêmica com Pseudomonas syringae pv. actinidiae (PETRICCIONE et al., 2013). Outros inibidores de protease responderam com superexpressão em vários patossistemas (CANTÚ et al., 2008b; FAN et al., 2011), sugerindo que a intervenção da proteólise faz parte dos mecanismos de resistência à doença. Por exemplo, nosso grupo de pesquisa observou, recentemente, haver aumento da expressão de um inibidor de proteinase cisteínica em plantas de feijão-de-corda resistente, quando desfiado pelo nematóide das galhas, Meloidogyne incognita (OLIVEIRA et al., 2012).