superior isolada de rato
Com o objetivo de investigar a participação da via NOS/CGs na resposta relaxante promovida pela pirona-198, foi utilizado ODQ (10 M), um potente inibidor que previne a ativação da CGs pelo NO (JIANG; WU; WANG, 2007).
Após o período de estabilização e verificação da integridade do endotélio funcional (ver 4.3), o ODQ foi adicionado e após um período de 30 minutos, uma nova contração com FEN (1 μM) foi induzida, com período de estabilização de 45 minutos.
Posteriormente era feita a adição de concentrações crescentes de pirona-198 (0,1 nM – 1 mM), para obtenção de uma curva concentração-resposta (Esquema 4).
Esquema 4 – Representação esquemática do protocolo para investigar o efeito vasorrelaxante de concentrações crescentes de pirona-198 (0.1 nM – 1 mM), em anéis com endotélio funcional
e pré contraídos com FEN (1 μM), na presença de ODQ (10 μM).
pirona-198 0,1 nM – 1 mM ODQ 10 µM 30’ FEN (1 µM) TE N S Ã O ( g) TEMPO (min)
5.3.2.3 Verificação da participação dos receptores muscarínicos na resposta vasorrelaxante induzida pela pirona-198 em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato
Com o intuito de avaliar se haveria uma participação dos receptores muscarínicos no efeito vasorrelaxante da pirona -198, utilizou-se atropina, um antagonista não seletivo dos receptores muscarínicos na concentração de 1 nM (BASTOS et al., 2009).
Após a verificação da integridade do endotélio, como descrito no item 4.3, as preparações eram incubadas com atropina. Passado os 30 minutos, era então induzida uma contração com FEN (1 μM) e passados 45 minutos, concentrações crescentes da pirona-198 (0,1 nM – 1 mM) foram adicionadas para obtenção de uma curva concentração-resposta (Esquema 5).
Esquema 5 – Representação esquemática do protocolo para investigar o efeito vasorrelaxante de concentrações crescentes de pirona-198 (0.1 nM – 1 mM), em anéis com endotélio funcional
e pré contraídos com FEN (1 μM), na presença de atropina (1 nM).
pirona-198 0,1 nM – 1 mM Atropina (1 nM) FEN (1 µM) 30’ TE N S Ã O ( g) TEMPO (min)
5.3.2.4 Verificação da participação de metabólitos da via do ácido araquidônico, na resposta vasorrelaxante induzida por pirona-198 em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato
A verificação de uma possível participação dos metabólitos do ácido araquidônico na resposta vasorrelaxante induzida pela pirona-198 foi realizada a partir da utilização de indometacina (10 M), um inibidor não seletivo da ciclooxigenase (COX) (SASAKI et al., 2010).
Após a verificação da integridade do endotélio, como descrito no item 4.3, as preparações eram incubadas com indometacina e após 30 minutos, era induzida uma contração com FEN na concentração de 1 μM. Passados 45 minutos, foram adicionadas concentrações crescentes da pirona-198 (0,1 nM – 1 mM), de maneira cumulativa, para obtenção de uma curva concentração-resposta (Esquema 6)
.
Esquema 6 – Representação esquemática do protocolo para investigar o efeito vasorrelaxante de concentrações crescentes de pirona-198 (0.1 nM – 1 mM), em anéis com endotélio funcional
e pré contraídos com FEN (1 μM), na presença de indometacina (10 μM). L= lavagem
pirona-198 0,1 nM – 1 mM indometacina (10 µM) FEN (1 µM) 30’ TE N S Ã O ( g) TEMPO (min)
5.3.3 Protocolos experimentais realizados em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato na ausência do endotélio funcional
5.3.3.1 Avaliação da atividade da pirona-198 sobre a indução da contração de FEN em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato
A fim de avaliar se o efeito da pirona-198 envolveria a ação sobre os receptores α-adrenérgicos, de forma que verificada a ausência do endotélio, contrações isométricas foram obtidas pela adição cumulativa de FEN nas concentrações de 1 nM a 10 µM (WANG et al., 2008). Na primeira fase do protocolo uma curva inicial foi gerada pela adição cumulativa de FEN. Em um segundo momento, todo o processo foi repetido, porém a geração desta curva cumulativa concentração-resposta de FEN foi obtida na presença de concentrações isoladas de pirona (10 µM, 100 µM ou 1 mM), que foram incubadas por um período de 30 minutos. (Esquema 7).
A curva de FEN na presença de pirona-198 foi comparada com a curva concentração-resposta controle, e sua resposta máxima foi caracterizada como 100%.
Esquema 7– Representação esquemática do protocolo para investigar o efeito vasorrelaxante induzido por concentrações isoladas de pirona-198 (10 µM, 100 µM e 1 mM), em anéis sem endotélio funcional frente a concentrações crescentes de FEN (1 nM – 10 µM). L= lavagem
Pirona
30’ FEN (1 nM – 10 µM)
L
FEN
5.3.3.2 Avaliação da atividade da pirona-198 frente ao U46619
A fim de avaliar a resposta vasorrelaxante da pirona-198 diante de contrações induzidas por outro agente contracturante, utilizou-se U46619 que ativa receptores prostanóides tromboxânicos (GPCRs) acoplados a proteína Gq estimulando a via PLC/IP3/DAG (SNETKOV et al.; 2006).
Após a verificação da remoção do endotélio funcional e um período de estabilização de 30 minutos, foi induzida uma contração com 10 µM de U46619 (SHAW et al., 2004) e no componente tônico da contração, após 45 minutos, eram adicionadas concentrações crescentes de pirona-198 (0,1 nM – 1 mM), para obtenção de uma curva concentração-resposta. A resposta foi expressa como porcentagem de relaxamento em relação à contração produzida por U46619 (Esquema 8).
Esquema 8 – Representação esquemática do protocolo para investigar o efeito vasorrelaxante de concentrações crescentes de pirona-198 (0.1 nM – 1 mM), em anéis sem endotélio funcional
contraídos com U46619 (10 µM).L = lavagem
TE N S Ã O ( g) TEMPO (min) L pirona-198 0,1 nM – 1 mM U46619 (10 µM)
5.3.3.3 Investigação do efeito vasorrelaxante da pirona-198 em anéis pré-contraídos com S(-) Bay K8644 ou na presença de um bloqueador de Cav tipo L
Para avaliar o efeito da pirona-198 sobre o influxo de Ca2+ através dos canais para Ca2+ sensíveis a diidropiridinas (CaV tipo L), em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato, sem o endotélio funcional, foi utilizado o S(-)- Bay K 8644, um ativador dos canais para Ca2+ sensíveis a diidropiridinas (ADACHI- AKAHANES et al., 1999). Devido uma despolarização parcial ser necessária para obtenção da resposta ao S(-)-Bay K8644, a resposta contrátil a esse agonista foi obtida em meio contendo 20 mM de KCl (SCHRAMM et al., 1983; DAVIE; KUBO; STANDEN, 1998).
Após a verificação da ausência do endotélio, as preparações foram feitas trocas da solução de Tyrode por 15 minutos e substituida por solução de Tyrode KCl 20 mM (Quadro 3). Após 30 minutos, uma contração por S(-) - Bay K8644 (200 nM) foi produzida, e no componente tônico a pirona-198 (0,1 nM – 1 mM) foi adicionada cumulativamente (Esquema 9A).
Em um segundo grupo de experimentos, foi utilizada nifedipino na concentração de 1 µM, um bloqueador dos canais de Cav tipo L (SOFOLA; ADEGUNLOYE; KNILL, 2003; MISFELDT et al., 2010). Após a fase de estabilização, os anéis foram incubados com nifedipino durante um período de 30 minutos. No componente tônico da curva de contração induzida por fenilefrina (10 µM) foram adicionadas cumulativamente concentrações crescentes de pirona-198 (0,1 nM – 1mM) (Esquema 9B).
A)
B)
Esquema 9 – Representação esquemática do protocolo para investigar o efeito vasorrelaxante de concentrações crescentes de Pirona-198 (0,1 nM – 1 mM), em anéis sem endotélio funcional
contraídos com S(-) Bay K 8644 (A) e incubados com nifedipino (B). L = lavagem
pirona-198 0,1 nM – 1 mM Nifedipino (1 µM) 30’ FEN (1 e 10 µM) S(-) Bay K 8644 200 nM KCl 20 mM L pirona-198 0,1 nM – 1 mM TE N S Ã O ( g) TEMPO (min)
5.3.3.4 Avaliação do efeito vasorrelaxante da pirona-198 sobre as contrações transientes induzidas por concentrações de FEN (1 e 10 µM)
O efeito da pirona-198 sobre as contrações transientes promovidas pelo cálcio liberado dos estoques intracelulares sensível a IP3 via IP3R (PATEL; JOSEPH; THOMAS, 1999).
As preparações foram expostas à solução despolarizante de KCl 60 mM (tabela 4) até a formação de um platô e em seguida a solução despolarizante era substituída pela solução de Tyrode livre de Ca2+ (Quadro 2). Decorridos 3 minutos, era adicionada ao meio FEN nas concentrações de 1 ou 10 μM e uma resposta contrátil era então obtida. Este procedimento foi repetido duas vezes com a finalidade de obter a média da contração induzida pela FEN.
Em um terceiro momento, após a troca do meio despolarizante por Tyrode sem cálcio, concentrações isoladas de pirona-198 foram adicionadas juntamente durante 3 minutos e posteriormente uma nova contração induzida pela fenilefrina foi obtida (Esquema 10).
Essa terceira contração induzida na presença da pirona foi comparada com a média das contrações induzidas por FEN na ausência das concentrações isoladas de pirona-198.
Esquema 10 - Representação esquemática do protocolo experimental para estudo da