Em á x 0 2 4 6
FEN FEN + GLIB
pD
Os valores de Emáx e pD2 nos protocolos realizados na ausência do endotélio funcional estão listados na tabela 3.
Tabela 3 - Valores de pD2 e Emáx para pirona-198 sob diferentes condições experimentais em anéis de artéria mesentérica na ausência do endotélio funcional
Condições experimentais n Emax (%) pD2
FEN 1 µM (Endotélio removido) 8 99,3 ± 1,1% 4,1 ± 0,06 FEN 10 µM (Endotélio removido) 7 96,4 ± 1,9% 5,0 ± 0,1
U46619 (10 µM) 7 89,5 ± 4,2% 2,9 ± 0,1*** BayK 8644 6 93,9 ± 3,1 3,9 ± 0,08 TEA (3 mM) + FEN 10 µM (Endotélio removido) 7 92,3 ± 3,9% 3,9 ± 0,06*** TEA 3 mM + FEN 1 µM (Endotélio removido) 6 100 ± 0,7% 4,1 ± 0,05 TEA (1 mM) 6 91,9 ± 2,9% 4,2 ± 0,1*** 4 – AP (1 mM) 6 97,3 ± 3,6% 4,9 ± 0,2 BaCl2 (30 µM) 6 89,9 ± 4,6% 4,7 ± 0,1 Glibenclamida (10 µM) 6 90,5 ± 3,3% 4,8 ± 0,1
7 DISCUSSÃO
O presente trabalho foi desenvolvido com o objetivo de avaliar os efeitos da 6 – [(E) – estiril] – 2 - pirona (pirona-198) proveniente da Aniba panurensis sobre o sistema cardiovascular de ratos, tentando elucidar os possíveis mecanismos de ação envolvidos em suas respostas.
No desenvolvimento deste estudo foram empregados dois modelos de abordagens metodológicas. Na primeira abordagem foram utilizadas técnicas experimentais de estudo in vivo para avaliar o efeito da pirona-198 sobre a PAM e FC em ratos normotensos não anestesiados. Na segunda, foram utilizados ensaios in vitro para avaliação funcional da pirona-198 em anéis de artéria mesentérica superior isolada de ratos.
Devido aos poucos trabalhos relatados na literatura que elucidam efeitos biológicos da Aniba panurensis, tal como os efeitos produzidos pela 6 – [(E) – estiril] – 2 – pirona no sistema cardiovascular, um objetivo de suma importância foi cumprido neste trabalho, o de aumentar a quantidade de informações relevantes a respeito desta espécie e de seus constituintes, contribuindo consideravelmente para a pesquisa na área de plantas medicinais. Uma vez que as primeiras evidências farmacológicas do efeito vasorrelaxante da pirona-198 foram mostradas por esse mesmo grupo de pesquisa.
Na avaliação dos parâmetros hemodinâmicos de PAM e FC, a pirona-198 promoveu hipotensão e bradicardia. Nos expeirmentos in vitro o efeito vasorrelaxante causado pela pirona-198 parece estar relacionado com a diminuição da resistência vascular periférica em artéria mesentérica de rato. A diminuição na RVP envolve a participação de fatores relaxantes derivados do endotélio, possível envolvimento no influxo de Ca2+ por meio da inibição dos canais para cálcio sensíveis a voltagem tipo-L (Cav-L) e diminuição da mobilização de cálcio através dos estoques intracelulares, com possível envolvimento dos canais para potássio sensiveis ao cálcio.
Com o objetivo de avaliar o efeito da pirona-198 sobre PAM e FC, utilizou-se a metodologia de aferição dos parâmetros hemodinâmicos em animais não anestesiados e com livre movimentação. Pelo fato de ser conhecido que a anestesia
modifica os níveis de PA e FC, além do funcionamento dos principais sistemas envolvidos na regulação da PA.
Em experimentos realizados in vivo, a administração aguda da pirona-198 induziu uma hipotensão seguida de bradicardia intensa de maneira independente de dose. Todas as doses foram capazes de promover alterações na PAM e FC, de forma que se observou que a pirona reduziu de maneira significante os níveis de PA arterial seguida de uma redução máxima de FC, que ficou próxima de 50%(Gráfico 1).
O padrão do efeito da pirona-198 de promover bradicardia e hipotensão foi semelhante ao efeito de constituintes de outra espécie do gênero Aniba, a A. canelilla, descrito na literatura por LAHLOU e colaboradores (2005), que verificaram que o óleo essencial de A. canelilla promoveu em ratos normotensos não anestesiados uma diminuição da pressão arterial média e da frequência cardíaca desses animais. Esse efeito foi parcialmente reduzido quando utilizado um inibidor da sintase do óxido nítrico, L-NAME e um bloqueador de receptor muscarinico. Essa hipotensão produzida envolvia um relaxamento vascular, com dependência do endotélio funcional envolvendo a via NO/L-arginina, tal como a inibição da corrente de cálcio através dos canais de cálcio voltagem-dependentes (LAHLOU et al., 2005). Quando foi realizada a verificação isolada de um dos principais componentes do óleo essencial de A. canelilla, o 1-nitro-2-feniletano, em animais normotensos e espontaneamente hipertensos, este foi capaz de induzir uma resposta cardiovascular caracterizada por uma bradicardia vago-vagal e reflexor depressor, e a segunda resposta hipotensora ocorre em parte por um efeito direto sobre o músculo liso vascular (INTERAMINENSE et al., 2011; SIQUEIRA et al., 2010). Outro constituinte do óleo essencial de A. canelilla, o metileugenol, em estudos com ratos normotensos não anestesiados, foi capaz de promover uma queda na pressão sanguínea, provavelmente através de um vasorrelaxamento vascular, acreditando- se envolver a via oxido nítrico/L-arginina (LAHLOU et al., 2004).
Drogas, com efeito, bradicárdico, como os beta bloqueadores e bloqueadores dos canais de cálcio, tem sido recomendadas para uso na terapia no combate da elevação da pressão arterial (CAI et al., 2011), pois mudanças na FC têm sido comumente observadas em vários tipos de drogas antihipertensivas, nas quais a
taquicardia tem se mostrado ser um fator de risco para eventos pós-isquêmicos e doenças cardiovasculares (CAI et al., 2011).
A manutenção da pressão arterial é a principal função biológica das células vasculares, essencial para o transporte de várias substâncias para os tecidos periféricos. Um dos principais fatores na regulação da pressão arterial é o tónus do músculo liso vascular. Embora muitos fatores contribuam para a manutenção do tônus vascular, todos eles, em última análise afetam a concentração intracelular de cálcio ([Ca2+]i) na célula do músculo liso vascular.
Dessa forma para uma melhor compreensão dos efeitos desta substância observados nos estudos in vivo, passou-se a investigar a atividade da pirona-198 sobre anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato. Justificando-se pelo fato de que um importante papel na manutenção da PA é desempenhado por alterações do tônus da musculatura lisa vascular, e que os canais iônicos atuam como importantes reguladores da condição contrátil do músculo liso dos vasos (THORNELOE; NELSON, 2005). Somado aos dados em que, como referido anteriormente, o efeito deste gênero Aniba sobre os padrões hemodinâmicos envolve a ação sobre a musculatura vascular.
Sabendo-se, através de estudos anteriores, que o efeito da pirona-198 poderia envolver mecanismos relacionados com as vias de sinalização ativadas por agonistas alfa adrenérgicos, questionou-se se o efeito vasorrelaxante da pirona poderia ser modificado na presença de diferentes concentrações de um agonista alfa adrenérgico, como a fenilefrina. Esse questionamento baseia-se nos dados da literatura que relatam que diferentes concentrações de FEN promovem efeitos dependentes dessas concentrações (MAUBAN et al., 2001). Em artérias mesentéricas de rato a FEN tem sido reportada por aumentar de forma dose- dependente a frequência de oscilações do cálcio intracelular (MAUBAN et al., 2001), tal como em veia cava inferior de coelho, correlacionando as contrações isométricas com concentrações dependentes de FEN (RUEHLMANN et al, 2000), de forma que essas oscilações não são influenciadas pela presença ou ausência do endotélio funcional (KOENIGSBERGER et al., 2010).
Assim, foram utilizadas as concentrações submáxima (1 µM) e máxima (10 µM) de FEN para verificar o efeito da pirona-198 mediante as concentrações diferentes do agonista. Observou-se que na concentração de 10 µM a pirona-198 produziu um efeito vasorrelaxante dependente de concentração que, após a
remoção do endotélio funcional, teve uma atenuação da potência desse efeito (Gráfico 2A). Na concentração submáxima de FEN, a pirona-198 também promoveu um efeito vasorrelaxante dependente de concentração em anéis com endotélio funcional e após a remoção deste, o efeito máximo foi mantido com diminuição da potência da pirona-198 (Gráfico 2B).
De acordo com esses resultados, sugere-se que o efeito vasorrelaxante da pirona-198 é mediado parcialmente por mecanismos dependentes do endotélio e que esse efeito não se altera quando as concentrações de FEN foram modificadas; além disso, o efeito da pirona-198 também envolve mecanismos independentes da presença do endotélio vascular e essa capacidade de promover relaxamento no músculo liso vascular foi diferente diante das concentrações de FEN. Diante desses resultados, sugere-se que em maiores concentrações do agonista as vias de sinalização envolvidas na sua resposta podem estar mais ativadas e que possivelmente a ação da pirona-198 atue mais sobre elas, podendo ser dessa forma melhor visualizada.
Desta forma, a partir destas observações, todos os experimentos subsequentes realizados na presença do endotélio funcional foi utilizado 1 µM de FEN, enquanto na ausência do endotélio funcional para algumas condições experimentais foram utilizadas as concentrações submáxima e máxima com o intuito de comparar os efeitos mediante as concentrações diferentes do agonista alfa adrenérgico.
Ao observar que parte então do efeito relaxante produzido pela pirona-198 envolvia o endotélio funcional, objetivou-se identificar qual (is) fator (es) derivados do endotélio vascular poderia estar sendo responsável pela ação vasodilatadora da pirona-198. Para tanto foram realizados experimentos utilizando diversas ferramentas farmacológicas.
O endotélio, a superfície luminal dos vasos sanguíneos, é um importante regulador do tônus vascular via liberação de várias substâncias endógenas. A remoção e disfunção do endotélio vascular aumentam a vasoconstricção induzida por vários estímulos e por agonistas vasoativos (JIN et al.; 2008b). As células endoteliais liberam fatores derivados do endotélio como os fatores relaxantes (FRDE) e fatores contracturantes (FCDE). Dentre os FCDE contracturantes inclui endotelina, prostaglandina F2α e tromboxano A2 e nos relaxantes está o NO, prostaglandina I2 e fatores hiperpolarizantes derivados do endotélio (EDHF) (LEDOUX et al.; 2005).
Considerando-se os principais agentes vasoativos, a síntese do NO envolve inicialmente a hidroxilação de um dos nitrogênios guanidinos da L-arginina para gerar NHA. Esta reação utiliza NADPH e oxigênio (O2) e envolve o complexo heme da NOS. Na segunda etapa, ocorre a conversão da NHA em NO e citrulina. O NO produzido pelas células endoteliais acarreta relaxamento do músculo liso vascular (GIRARDI et al.; 2006).
A síntese enzimática de citrulina pode ser inibida por análogos da L-arginina tais como Ng-monometil- L - arginina (L-NMMA), Ng – nitro – L - arginina (L-NNA) e L- NAME. Uma vez que a substituição do substrato habitual (L – arginina) pelos análogos irá inibir a produção de NO e seus efeitos subsequentes, estes inibidores têm grande importância na pesquisa dos prováveis efeitos do NO nos tecidos (FLORA FILHO; ZILBERSTEIN, 2000).
Sabendo-se que a utilização do L- NAME promoveria uma inibição da produção de NO, como visualizado na figura 7, objetivou-se verificar se na ausência do NO a resposta vasorrelaxante da pirona-198 seria diferente da apresentada na ausência deste inibidor.
Nesta condição experimental, a pirona-198 apresentou um efeito vasorrelaxante dependente de concentração, porém houve um deslocamento da curva para a direita com atenuação da potência, como observado no gráfico 3. Sugerindo assim que a capacidade de promover relaxamento da pirona-198 na presença do endotélio funcional envolve possivelmente a ativação da NOS.
O L-NAME atua por competição com o aminoácido L-arginina na via de produção do NO, o que leva a inibição da síntese deste último com conseqüente vasoconstricção (PEREIRA; VIANNA; MANDARIM-de-LACERDA, 1998). De forma que a adição exógena de L-arginina (1 mM) em uma concentração superior ao do L- NAME, atuará competindo pelo sitio de ligação da eNOS.
Observa-se que em experimentos realizados na presença simultânea de L-NAME mais L-arginina, a inibição da NOS pelo L-NAME foi revertida (Gráfico 3). É relatado que a reversão do efeito inibitório do L-NAME na presença desse substrato é um forte indício da participação desta enzima em uma resposta relaxante. Desta forma, sugere-se que há a participação da NOS na resposta vasorrelaxante induzida pela pirona-198. Semelhantemente como encontrado por Lahlou e colaboradores (2004, 2005) na A. canelilla, a pirona-198 apresentou envolvimento com a via oxido nítrico/L-arginina.
A difusão rápida e a facilidade com que o NO penetra em outras células devem- se ao seu pequeno tamanho e a sua característica lipofílica, que são cruciais para o entendimento das suas atividades biológicas (DUSSE; VIEIRA; CARVALHO, 2003). Os análogos da L-arginina, como o L- NAME, que inibem a NOS bloqueando a geração de NO, não interfere diretamente no NO radicalar (YOSHIDA et al.; 1993). A reação do PTIO com NO radicalar forma inicialmente dióxido de nitrogênio (NO2) e 2-fenill-4,4,5,5-tetrametilimidazolina-1-oxil (PTI) (GOLDESTEIN; RUSSO; SAMUNI, 2003).
Para reforçar o envolvimento do NO no efeito vasorrelavante da pirona-198, utilizou-se um seqüestrador do NO radicalar, o PTIO (300 µM) (CHAUHAN et al., 2002; ELLIS; LI; RAND, 2000), como ilustrado na figura 8.
Figura 8 - Mecanismo de ação do PTIO
Na presença do PTIO, a pirona-198 promoveu um efeito vasorrelaxante dependente de concentração, entretanto apresentando uma diferença significativa quando comparado o relaxamento e a potência da pirona-198 com a condição controle. Sugerindo que a resposta vasorrelaxante da pirona-198, provavelmente, envolve a formação do NO, corroborando com os resultados anteriores descritos em que indicam a participação deste mensageiro secundário no efeito da pirona-198 (Gráfico 4).
Após a difusão deste gás, no interior da célula muscular, o NO interage com o ferro do grupo heme da CGs, acarretando uma alteração da conformação desta enzima, tornado-a ativa (DUSSE; VIEIRA; CARVALHO, 2003). Esta enzima catalisa a conversão GTP em GMPc, que atua ativando diversas proteínas cinases. A inativação do GMPc ocorre através de sua hidrólise, catalisada por enzimas da família das fosfodiesterases (BARRETO; CORREIA; MUSCARÁ, 2005).
A potente ação vasodilatadora da via GMPc /PKG tem sido descrita por diminuir o cálcio citosólico por meio de múltiplos mecanismos redutores de cálcio e desensibilização ao cálcio pela estimulação da atividade da fosfatase da cadeia leve de miosina. A PKG promove fosforilação da RhoA no resíduo Ser 188 que causa subsequente translocação da RhoA ligada à membrana para o citosol. A inibição da
sensibilização ao cálcio do aparato contrátil induzida pela RhoA por meio da via GMPc/PKG é identificado como uma via de sinalização que contribui para a ação vasodilatadora do NO (SAUZEAU et al.; 2000).
A ativação desta cinase também resulta em ativação da bomba de Ca2+ no retículo sarcoplasmático (SERCA), aceleração da recaptação de Ca2+ para os estoques intracelulares, ativação dos canais de K+, fechamento dos Cav, culminando em um vasorrelaxamento (FURCHGOTT, 1983). Além desta via dependente de GMPc, estudos têm demonstrado que ocorre ativação direta de BKCa pela PKG (CARVALHO et al.; 2001; IRVINE; FAVALORO; KEMP-HARPER, 2003).
Sabendo-se que existe envolvimento da via NO/eNOS com o efeito vasorrelaxante da pirona-198 e que o NO produz uma resposta vasorelaxante no músculo liso vascular através de um mecanismo dependente de GMPc, experimentos foram realizados na presença de ODQ (10 µM), um inibidor seletivo da PKG (JIANG; WU; WANG, 2007), como visualizado na figura 9, com o intuito de verificar a participação desta enzima nos efeitos apresentados pela pirona-198 na presença do endotélio funcional.
Nestas condições, o vasorrelaxamento induzido pela pirona-198 foi atenuado de maneira significante, sugerindo o envolvimento desta enzima na resposta vasorrelaxante da pirona-198 em anéis de artéria mesentérica de ratos (Gráfico 5). Baseando-se na literatura em que a ativação da CGs culmina na ativação da PKG e que esta ativada atuará em diversos mecanismos de promoção do relaxamento da musculatura lisa vascular, sugere-se então a participação da via eNOS/CGs/PKG no vasorrelaxamento induzido pela pirona-198.
Vasodilatadores dependentes do endotélio, como a ACh, atuam em parte, por meio, da elevação de cálcio intracelular acompanhado da liberação de fatores relaxantes derivados do endotélio por ativação de receptores muscarínicos M3 (LEDOUX et al.; 2006). O envolvimento dos receptores muscarínicos neste estudo foi avaliado por meio de experimentos realizados na presença de um antagonista não seletivo dos receptores muscarínicos, a atropina (1 µM) (BASTOS et al.; 2009), mecanismo esse visualizado na figura 10.
Nestas condições experimentais, a resposta vasorrelaxante da pirona-198, foi semelhante a curva concentração-resposta promovida pela pirona-198 na ausência do bloqueador (Gráfico 6), percebendo-se assim que os receptores muscarínicos provavelmente, não participam da resposta vasorrelaxante da pirona -198.
Além do NO, outras substâncias sintetizadas no endotélio, como as prostaciclinas têm sido implicadas nos relaxamentos dependentes do endotélio. A prostaciclina (PGI2), substância derivada do endotélio com características vasodilatadoras, é produto do metabolismo do ácido araquidônico por ação da ciclooxigenase. O ácido araquidônico é um constituinte do fosfolipídeos de membrana e, por isso, a síntese dos eicosanóides inicia-se com a liberação desse ácido graxo, por meio da hidrólise catalisada por fosfolipases específicas (PLA2 e C). A estimulação dos receptores de prostaciclina nas células musculares lisas provoca ativação da AC, induzindo aumento AMPc e estimulação da proteína PKA na musculatura lisa vascular. A PKA exerce efeito similar à PKG, causando a saída de Ca2+ do citosol e inibindo a maquinaria contrátil (BATLOUNI, 2001), como visualizado na figura 11.
De forma semelhante aos experimentos realizados com atropina, a resposta relaxante induzida por pirona-198 não foi atenuada de maneira significante nos experimentos realizados na presença de indometacina, um inibidor não seletivo da COX (SASAKI et al.; 2010). Nestas condições, sugere-se que não há o envolvimento dos metabólitos da via do ácido araquidônico nesta resposta (Gráfico 7).
Desta forma, os resultados obtidos na presença do endotélio funcional permitem concluir que o efeito da pirona-198 na presença da camada luminal dos vasos, envolve a ativação da enzima eNOS com subsequente ativação da via CGs/PKG com envolvimento dos seus respectivos alvos biológicos na produção do relaxamento muscular.
Como parte do efeito da pirona-198 se dá sobre o músculo liso, de forma independente do endotélio, investigou-se em quais pontos a substância em estudo poderia estar atuando para promover vasorrelaxamento.
O tônus muscular liso é regulado pela concentração de cálcio intracelular ([Ca2+]
i), sendo o aumento desta o evento chave no processo de ativação do aparato contrátil das células musculares lisas (KATOUE et al.; 2006), por meio da utilização do ciclo de pontes cruzadas entre a actina e a miosina (WEBB, 2003).
A contração muscular estimulada por agonistas ocorre por ligação deste com receptores de sete alças transmembranares, acoplados a uma proteína G heterotrimérica, estimulando assim a atividade da PLC. Esta enzima é específica para o lipídio de membrana PIP2, que cataliza a formação de dois potentes segundos mensageiros: IP3 e DAG (HALL et al.; 2006).
Agonista alfa adrenérgico, como a FEN, promove o aumento do tônus vascular pela estimulação do receptor α1-adrenérgico e pela elevação do influxo de cálcio (KARAKI; WEISS, 1988), o aumento na [Ca2+]i e ativação de cascata de fosforilação, podem aumentar a força sensível ao cálcio, como envolver mecanismos independentes deste íon (ZANG; BALKE; WIER, 2001).
Em estudos anteriores foi observado que a pirona-198 apresenta maior potência do seu efeito vasorrelaxante quando o mecanismo contrátil se deu pelo acoplamento fármacomecânico, com a utilização de FEN, do que pelo mecanismo eletromecânico, através da despolarização produzida por altas concentrações externas de potássio (ASSIS, 2007). Sugerindo assim que o efeito vasorrelaxante da estirilpirona envolveria vias de sinalização ativadas na resposta do agonista adrenérgico.
A partir de então, o primeiro questionamento foi saber se a pirona-198 poderia atuar diretamente sobre o receptor α1- adrenérgico. Os resultados obtidos no protocolo em questão mostrou que a pirona-198 inibiu a contração induzida pelo adicionamento cumulativo de FEN (Gráfico 8), sugerindo que a ação da substância em estudo não é aparentemente sobre os receptores adrenérgicos existentes na artéria mesentérica superior e sim sobre mecanismos posteriores à ativação do receptor, podendo ser a respeito da ação sobre a via de sinalização ativada por esse agonista ou da ativação de mecanismos relaxantes na musculatura lisa vascular, de algum modo influenciando na resposta contrátil induzida pela ativação de receptores α1-adrenérgicos. E outro resultado que reforça essa idéia, foi obtido mediante as contrações induzidas pelo U46619. O U46619 ativa receptores prostanóides tromboxânicos, que são GPCRs (HALL et al.; 2006) acoplados a proteína Gq estimulando a via PLC/IP3/DAG (SNETKOV et al.; 2006). Os Cav estão envolvidos nessa resposta, tal como ação sobre os SOCCs, mobilização de cálcio intracelular e bloqueio dos Kv (KAYE et al.; 1997) e BKCa (SCORNIK; TORO, 1992).
A curva concentração resposta induzida pela pirona-198 apresentou diferenças significativas entre as contrações induzidas pela FEN e U46619 (Gráfico 8). A diferença estatística existe na comparação entre os valores de pD2, observando que houve uma diminuição da potência da pirona-198 na contração induzida por U46619 com deslocamento da curva para a direita. Sugerindo-se que essa resposta ocorre pelo fato de existirem vias em comum na promoção da contração da FEN e U46619, e que a diminuição da potência se deu pelo fato de que existem mecanismos incomuns entre o agonista tromboxânico e o agonista adrenérgico.
O fato que assemelha a contração induzida por FEN e pelo U46619 é que a contração promovida envolve a abertura de Cav. Uma condição experimental que permite observar um possível efeito sobre esses canais é o aumento de potássio extracelular (KCl 80 mM), que promove uma despolarização de membrana, levando à abertura dos CaV, o que culmina no aumento do influxo de Ca2+ na célula, gerando a contração. Em estudos anteriores, nessas condições experimentais, observou-se o envolvimento dos CaV no vasorrelaxamento produzido pela pirona-198, envolvimento este também visualizado por meio de experimentos com adição cumulativa de CaCl2 em meio despolarizante nominalmente sem cálcio, antes e após a incubação com concentrações isoladas de pirona-198 (ASSIS, 2007).
A partir disso, passou-se a avaliar se a ação desta pirona seria de forma direta sobre os canais Cav tipo L. Essa observação foi possível pela utilização de uma ferramenta farmacológica, agonista destes canais, o Bay K8644 (200 nM). A