Tropikal Theileriosis’in Tanısı ve Tedavisi 1. Klinik Tanı

Hastalığın endemik olarak görüldüğü bölgelerde tanı genellikle klinik ve makroskobik bulgular ile yaz aylarında hayvan üzerinde görülen kene varlığına dayanarak yapılmaktadır. Laboratuar şartlarında en sık kullanılan yöntem ise giemsa ile boyalı ince yayma kan frotileri ile lenf ya da karaciğer biyopsilerinde mikroskopta parazit varlığının gösterilmesi esasına dayanır (Pipano 1994, Sergent 1945). Ancak bu yöntemle akut vakalar ile kronik vakaları ve taşıyıcı hayvanların ayırımını yapmak kolay değildir. Bu yöntemin avantajları arasında örnek alınımın kolay olması, taşıma ve saklamasının rahat olması, teşhis için tek bir mikroskobun yeterli olması sayılabilir. Bununla birlikte, hazırlanan frotiler iyi kalitede olmalı ve lenf yumrusundan hazırlanan biopsilerde makroşizontların normal azurofilik granüller gibi artefaktlar ile karıştırılmaması gereklidir (Lawrence ve ark 1994). Hastalığın erken döneminde hazırlanan kan frotilerinde piroplasmlar ile enfekte eritrositler çok az veya hiç rgörülmeyebilir, bu durum taşıyıcı konumdaki hayvanlarla rahatlıkla karışır. T. annulata enfeksiyonlarında, perifer kandan hazırlanan frotilerde şizontlara çok nadir olarak rastlanır. Piroplasmlarla enfekte eritrosit sayısı hastalığın ilerleyen dönemlerinde artar ve %90 seviyelerine ulaşabilir, ancak bu durum hastalığın asıl tablosuna karşılık gelmemektedir. Hastalıktan kurtulan hayvanlarda piroplasmlar uzun süre kanda kalır, ancak bu kalıcı piroplasmların direkt mikroskobik bakı ile tanısı her zaman mümkün olamamaktadır (Pipano ve ark 1974).

Theileria türlerinin eritrositler içindeki piroplasm formları morfolojik olarak yuvarlak, çomak, oval, haç, anaplasmoid ve virgül şekillerinde bulunabilir (Mimoğlu ve ark 1969, Uilenberg 1981). T. annulata enfeksiyonunun coğrafik dağılımı göz önünde tutulduğunda, T.buffeli (Purnell 1978) ve özellikle Sudan’ın güney kesimlerinde T. parva (Lomuro 1992) gibi diğer Theileria türlerinin de eş zamanlı olarak görüldüğü bölgelerde bu türler ile kesişebilmektedir. Bu bölgelerde parazitin farklı formlarının yüzdesine bakılarak ayırım yapılabilmektedir. Örnek olarak, T. parva’nın piroplazm formları genelde küçük ve çomak şeklinde iken T. annulata piroplazmları baskın olarak orta boylu, yuvarlak ve oval formlarda görülür. T. buffeli de ise çomak şekilli, genelde uzun ve eritrosit içindeki yapılar ile çizgi ilişki halindeki piroplasm formları baskındır. Ancak, hastalık esnasında piroplasmların bu formları değişkenlik göstermekte ve etkenlerin ayırıcı tanısına olanak vermemektedir (Norval ve ark 1992, Uilenberg 1981).

1.7.2. Antikor veya Antijen Kullanılarak Yapılan Serolojik Tanı

Hastalığa yakalanan hayvanlarda T. annulata’ya karşı oluşan antikorların belirlenmesinde kullanılan en yaygın serolojik teknik indirekt floresans antikor (IFAT) testidir. IFA testinde piroplasmlar ya da hücre kültürlerindeki şizontlar kullanarak hazırlanan preparatlar antijen olarak kullanılır. IFA, T. annulata’nın prevalans çalışmaları ve aşılanmış hayvanlardaki antikor yanıtının belirlenmesinde yoğun olarak kullanılan bir testtir (Pipano ve ark 1974). Yapılan bir çalışmada, IFA testinin mikroskobik olarak kan frotilerinde piropalsmların tespitine oranla daha iyi bir yöntem olduğu gösterilmiştir (Darghouth ve ark 1996b). Bununla birlikte, IFA testinin bir takım eksi yönleri vardır. Subjektif olması ve T.parva, T. annulata, T. mutans ve T. taurotragi türleri arasında belli derecelerde çapraz reaksiyon görülmesi testin özgüllüğünü olumsuz etkilemektedir (Burridge ve ark 1974). Aynı zamanda, Babesia bigemina, B. bovis, Anaplasma marginale ve A. centrale gibi diğer piroplasmalar ile çapraz reaksiyon verebilmektedir (Burridge ve ark 1974, Kiltz ve ark 1986, Kocan ve ark 2000, Molad ve ark 2006). IFA testinden ayrı olarak, komplement fikzasyon ve hemaglütinasyon inhibisyon testleri de Theileria’ya karşı oluşan antikorların belirlenmesinde kullanılmış, ancak özgüllüklerinin düşük olmasından ötürü pek tercih edilmemişlerdir (Norval ve ark 1992).

Enzim bağımlı immunosorbent testi (ELISA), son yıllarda veteriner hekimlikte hastalıkların tanısı ve epidemiyolojik çalışmalarda giderek yaygın şekilde kullanım alanı bulmuştur (Voller ve ark 1976). ELISA, IFA testine nazaran daha duyarlı ve özgül oluşu, çok sayıda örneğin incelenebilmesi ve ucuz olması ile daha avantajlıdır (Kemeny ve Chantler, 1988). Tropikal theileriosis’e yakalanan hayvanlarda etkene karşı oluşan antikorların belirlenmesi amacıyla birçok çalışma yapılmıştır. Bu çalışmalarda parazitin piroplasm ve makroşizont döneminlerine ait işlenmemiş (ham) antijenler ayrı olarak ya da bir arada kullanılmıştır (Beniwal ve ark 1997, Prasanth ve ark 1995, Reddy ve ark 1994, Sundar ve ark 1993, Kachani ve ark 1992b, Gray ve ark 1980). Ancak bu antijenler kullanılarak yapılan testler duyarlılık ve özgüllük yönünden tam manası ile incelenmemiştir. Kachani ve ark. (1992) tarafından, ham piroplasm antijenleri kullanarak yapılan ELISA’nın, bağışık hayvanlardan alınan serum örnekleri ile hem şizontlardan hazırlanan antijenlere göre daha etkili olduğu hem de daha az özgül olamayan bağlanma gösterdiği bildirilmiştir. Bununla birlikte, ham antijenler kullanılarak yapılan ELISA ile elde edilen sonuçlar IFA testi ile elde edilenlere nazaran daha düşük duyarlılık ve özgüllüğe sahiptir (Kachani ve ark 1992a, 1994, 1996).

Son yıllarda, parazitin omurgalı konaktaki farklı yaşam dönemlerine (sporozoit, şizont, meroziot/piroplasm) özgü antijenler belirlenmiş ve bunlar ELISA’da kullanılmıştır. Bu antijenler arasında, sporozoit yüzey antijeni; SPAG-1 (Hall ve ark 1992, Williamson 1989), merozoit rhoptri antijeni; Tamr-1 (Shiels ve ark 1994), 32 kilo dalton (kDa) meroziot ve piroplasm yüzey antijeni; Tams-1 (Shiels ve ark 1995), T. annulata yüzey antjeni; TaSP (Schnittger ve ark 2002), şizont yüzey antijeni; TaD (Schneider ve ark 2004), şizont proteini; TaSE (Schneider ve ark 2007), mitokondriyal HSP70; TamtHSP70 (Schnittger ve ark 2000) yer almaktadır. SPAG–1 rekombinant proteini kullanılarak yapılan indirekt ELISA (enzim işaretli immunaracılı test) testi sonucunda bu proteinin doğal şartlarda enfeksiyona yakalanan hayvanların belirlenmesinde re enfekte olmamış yada tekrarlı kene enfestasyonuna maruz kalmamış hayvanlarda bu antijene karşı oluşan antikor miktarının tanı için yeterli düzeyde olmadığı görülmüştür (Matita 1994, Williamson ve ark 1994). Tamr–1 (merozoit rhoptri antijeni) kullanılarak yapılan ELISA testi ile bu proteinin tanı için uygun olduğu belirtilmiştir (Matita 1994). Yapılan bir diğer çalışmada bu antijenin sporozoitler ile enfekte hayvanların belirleyebilmiş, ancak attenüye hücre kültür ile aşılanan hayvanlarda bu proteine karşı gelişen antikor yanıtın yeterli düzeyde olmadığı ve preimmun hayvanlardaki antikor düzeyine yakın yada çok az yüksek olarak seyrettiği belirtilmiştir (Ilhan ve ark 1998). Tams-1 rekombinant antijeni kullanılarak yapılan çalışmalarda enfekte hayvanlarda üç aydan önceki dönemlerde IFA testi daha güvenilir sonuç verdiği görülmüştür. TaD immunojenik bir protein olmasına karşın patojen olmayan ovine Theileria türleri ile çapraz reaksiyon vermektedir. TaSE immunojenik bir proteindir, ancak bu proteine karşı gelişen antikor titresi ve bunun tanı amacıyla kullanılmasına ilişkin sınırlı sayıda çalışma yapılmıştır (Schneider ve ark 2004, 2007). Mitokondriyal HSP70; TamtHSP70 antijenine karşı gelişen bağışık yanıtın belirlenmesi amacıyla yapılan çalışmada bu proteine karşı oluşan antikor yanıtın çok düşük olduğu gözlemlenmiştir (Seitzer ve ak 2007).

Bu tekniklerin yanında, omurgalı konakta T. annulata’nın varlığını belirlemede kullanılan iki farklı yöntem daha vardır. İlki, omurgalı konakta enfekte lökositler içindeki makroşizontların belirlenmesinde kullanılan in vitro perifer kan mononükleer hücrelerinin izolasyonudur, bu yöntemle Theileria makroşizontları ile enfekte hücrelere doku kültüründe in vitro ortamda çoğalma şansı vererek üremelerini sağlayıp enfeksiyonun belirlenmesidir (Kariuki ve ark 1995, Stagg ve ark 1974, Sharma ve Brown 1981). İkincisi ise taşıyıcı hayvanların belirlenmesinde kullanılan ksenodiagnoz (xenodiagnoz)’dur, bu yöntemde enfeksiyonu taşıdığı düşünülen hayvanların üzerinde beslenen keneler doyup düştükten sonra gömlek değiştirerek muhtemel enfeksiyona ait sporozoitleri tükrük bezlerinde bulundururlar

ve bu keneler duyarlı hayvanda beslenerek enfeksiyonun yeni hayvana nakledilip edilmediğine bakılarak uygulanan bir yöntemdir (Dolan 1986, Sergent 1945). Tarif edilen bu son iki yöntem uzun ve zahmetli olduğu için rutin uygulamalarda sıkça başvurulan bir yöntem değildir.

1.7.3. Moleküler Tanı

Son yıllarda, moleküler biyoloji alanındaki gelişmeler enfeksiyona yol açan etkenlerin moleküler düzeyde belirlenmesine olanak sağlamıştır. Rekombinant DNA teknolojisi sayesinde, parazite özgü DNA bölgeleri plazmid vektörlere klonlanarak enfekte hayvanlarda Theileria DNA’sının varlığı duyarlı ve özgül olarak belirlenebilmektedir (Allsopp ve ark 1993, Conrad ve ark 1987). Özgül DNA probları, hastalığın prepatent, patent ve iyileşme dönemi ile taşıyıcı konumdaki hayvanlarda hastalığa yol açan etkene özgü DNA bölgelerini belirlemektedir (Figueroa ve Buening 1995). Daha önceleri, parazite ait piroplasm ve şizont dönemlerinin morfolojik farklarına göre ayırımları yapılamayan türlerde bu yöntemler sayesinde , parazit türü ile o türe ait farklı suşların ayırımı mümkün kılınmıştır (Norval ve ark 1992). Afrika’nın doğusu ve merkezinde görülen T. parva enfeksiyonlarının belirlenmesi için birçok çalışma yapılmıştır. Restriksiyon enzimleri ile kesilen T. parva’nın klonlanmış lenfoblastoid hücre kültürü ve farklı bölgelerden izole edilen suşlarında DNA probları kullanılarak yapılan bir çalışmada, T. parva’nın antijenik olarak farklı alt klonlarında ve farklı bölgelerden izole edilen suşlarında belirgin bir farklılık görülmüştür (Bishop ve ark 1994, Conrad ve ark 1987). T. annulata’nın populasyon genetiği çalışmasında restriksiyon enzimi ile kesilen bölgelerinin boy farklılıklarının (RFLP; restriction fragment length polymorphism) belirlenmesinde de DNA problarından faydalanılmıştır (Ben Miled ve ark 1994). Son yıllarda yapılan populasyon genetiği çalışmalarında ise RFLP yönteminden daha ziyade genom üzerinde bulunan peşpeşe sıralı tekrarlı nükleotid bölgeler (tandem bölgeler) polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) ile çoğaltılarak örnekler arasındaki farklı populasyonlar daha etkili analiz yöntemleri ile belirlenbilmektedir (Weir ve ark 2007).

Hızlı ve türe özgü tanı sistemi geliştirilmesi için yapılan çalışmada, ribozomal RNA’nın küçük alt ünitesinin (ssurRNA) her bir parazit türüne özgü bölgelerine ait oligonükletid problar tasarlanmış (Allsopp ve ark 1993) ve bu problar kullanılarak altı farklı parazit türü hem direkt olarak hem de PZR ile çoğaltılmış parazit ssu rRNA genine hibridizasyonu ile tespit edilmiştir. Bu gen bölgesine özgü oligonükleotid problar PZR için çeşitli araştırmacılar tarafından kullanılmıştır (de Kok ve ark 1993, Ilhan ve ark 1998). Polimeraz zincir reaksiyonunun sunduğu avantajlardan biride hem omurgalı hem de

omurgasız konaklardan alınan DNA örneklerinde parazite ait çok küçük miktarlardaki DNA’yı kolayca ve özgül olarak çoğaltabilmesidir. Son yıllarda, T. annulata’nın teşhisinde bir çok farklı PZR metodu kullanılarak hem vektör kenelerde (d'Oliveira ve ark 1997b, de Kok ve ark 1993) hem de omurgalı konakta (d'Oliveira ve ark 1995, Ilhan ve ark 1998, Shayan ve ark 1998, Gubbels ve ark 1999, Leemans ve ark 1999b, Martin-Sanchez ve ark 1999) parazitin teşhisi yapılmıştır. PZR tekniğinde kullanılan primerler 18S ssu rRNA genini (de Kok ve ark 1993, Georges ve ark 2001, Gubbels ve ark 1999, Ilhan ve ark 1998), T.annulata major yüzey proteini (Tams-1) genini (d'Oliveira ve ark 1995, Kirvar ve ark 2000, Martin-Sanchez ve ark 1999), ısı şok protein 70 (HSP70; heat shock protein 70) genini (Shayan ve ark 1998), beta tubulin (ß-tubulin) genini (Caccio ve ark 2000) ve mitokondriyal sitokrom genini (Criado ve ark 2006) çoğaltarak parazitin teşhisine olanak sağlamıştır. Yukarda belirtilen genlerin PZR tekniği ile çoğaltılarak etkenin teşhisine olanak sağlamasının en önemli avantajlarından biri daha önceleri kullanılan mikroskobik yöntemlere nazaran daha duyarlı ve özgül olmasıdır. Yapılan çalışmalarda, N516/N517 primerler çifti kullanarak PZR ile çoğaltılan Tams1 geninin duyarlılığının 2 – 3 parazit / µl kan (d'Oliveira ve ark 1995), Tams1-T3/Tams1-T5 ve Tams1F/Tspms1R primerleri kullanarak nested PZR ile çoğaltılan Tams1 geninin duyarlılığının 1 parazit / µl kan (Kirvar ve ark 2000), 989-1347 primerler çiftleri kullanarak PCR ile çoğaltılan ssu rRNA geninin duyarlılığının 1 parazit / 4 µl kan (Ilhan ve ark 1998) olduğu bulunmuştur. Son yıllarda geliştirilen RLB (reverse line blot) hibridizasyon tekniği birçok Theileria ve Babesia türünün eş zamanlı teşhisine olanak sağlamıştır (Gubbels ve ark 1999). Bu yöntemde Theileria ve Babesia türlerinin 18S ssu rRNA geninde ortak olarak bulunan bölgelere özgül olarak bağlanan primerler kullanarak bu türler arasında farklılık gösteren V4 bölgesi PZR yöntemi ile çoğaltılıp, daha sonraki basamakta çoğaltılan örnekler her parazit türüne ait 18S ssu rRNA genindeki özgü V4 değişken bölgesine bağlanan oligonükleotid probların bağlandığı membran üzerine konularak tür ayırımı yapılmaktadır. Yapılan çalışmada, RLB-F/RLB-R primerleri kullanarak çoğaltılan ve RLB hibridizasyonu ile belirlenen 18S ssu rRNA geninin duyarlılığının T. annulata için 3 parazit / µl kan (Gubbels ve ark 1999) olduğu belirlenmiştir. Bu yöntem ile sığırlarda görülen yedi Theileria (T. annulata, T. parva, T. mutans, T. taurotragi, T. velifera, T.buffeli / orientalis grup ve T. orientalis) ve üç Babesia (B. bovis, B. divergens ve B. bigemina) türünün teşhisi yapılabilmektedir.

1.7.4. Tedavi

Tropikal theileriosis ve ECF’ye yakalanan hayvanların tedavisinde kullanılan en etkili ilaç buparvaquone’dur (McHardy ve ark 1985, Singh ve ark 1993). Yapılan deneysel enfekte sığırlarda, 5 mg/kg veya 2.5 mg/kg dozlarda intramuskuler tek dozluk enjeksiyonun hastalığa yol açan şizont ve piroplasmları elimine ettiği gösterilmiştir (Singh ve ark 1993). Bununla birlikte, hastalığın geç dönemlerinde ve 2.5 mg/kg dozlarda kullanımını takiben hayvanlarda ikinci bir doz daha uygulanmasına ihtiyaç duyulmaktadır (McHardy ve ark 1985, Mishra ve ark 1993).

1.8. Tropikal Theileriosis de Korunma ve Kontrol Yöntemleri