Hücre Kültürü Aşıları

Hücre kültürü aşıları, tüm dünyada endemik bölgelerde kullanılan ve makraşizontların hayvana inokule edildikten sonra konak mononükleer hücrelerine girerek yerleşme özelliğinden faydalanılarak geliştirilmiş bir yöntemdir. Kan transfüzyonu ile aşılamada kullanılan yönteme benzer şekilde şizontlar ile enfekte hücre kültürler in vitro ortamda pasajlanarak virülensi attenüye edilmektedir (Darghouth ve ark 1996a, Pipano ve Shkap 2000).

Şizont hücre kültürü aşılarının üretimi ve kullanımı bir çok araştırmacı tarafından tanımlanmıştır (Pipano 1997, Norval ve ark 1992, Boulter ve Hall 1999). Tsur ve Pipano (1966) T. annulata’yı in vitro olarak başarılı şekilde kültüre etmişler ve tropikal theileriosis’e karşı hücre kültürü aşılarının kullanımına olanak sağlamışlardır. T. annulata ile enfekte hücrelerin uzun süre kültüre edilmesi parazit virülensinde azalmaya yol açmaktadır (Tsur ve Pipano 1966). Tam attenüasyon ise kültüre edilen şizontların hayvanlarda parazitemi veya klinik ve parazitolojik belirtilerinin görülmemesi ile şekillenmektedir (Pipano 1977). Buna rağmen, makroşizontlara karşı IFAT ile ölçülen antikor yanıt virülent şizontlarla oluşan enfeksiyonlardaki seviyeler ile benzerlik göstermektedir (Pipano 1997). Parazitin ilk virülensi ile attenüasyonu için gerekli olan sürenin belirlenmesini sağlayan her hangi bir belirteç bulunmamaktadır. Bununla beraber farklı izolatlar arasında tam bir attenüasyon için gerekli olan zaman değişiklik göstermektedir (Hooshmand-Rad 1973, Pipano 1997). Attenüasyon ile populasyonda bulunan genotip sayısında seleksiyona bağlı oluşan azalma arasında bir ilişki olduğu, homolog şuşlarla oluşturulan re enfeksiyonlara karşı optimal koruma sağlarken (Darghouth ve ark 1996a, Gill ve ark 1980), heterolog şuşlara karşıda iyi bir direnç geliştirdiği bildirilmiştir (Darghouth ve ark 1996a, Hashemi-Fesharki 1991). Duyarlı konumdaki yerli ve egzotik hayvanlarda etkili koruma sağlamaktadır. Virülent T. annulata suşlarına özgü antikor kulanılarak yapılan çalışmada in vitro koşullarda antikor duyarlılığında farklılaşmalar görülmüş, antikor tarafından belirlenen antijenin parazit dönemine özgü olduğu ve aynı zamanda bu antijenin virülent suşlarda hücre yüzeyinde sentezlendiği ve attenüasyonla birlikte azaldığı belirlenmiştir (Sutherland ve ark 1996, Preston ve ark 1998). Aynı zamanda, attenüasyonun belli seviyelerde enfekte hücrelerin T hücre uyarım yetenekleri ve ürettikleri sitokin düzeyleri ile ilişkili olduğu, bu iki faktörü yüksek düzeyde üretilen hücrelere nazaran daha düşük seviyelerde üreten klonal hücrelerin hastalığın şiddetini de daha az indüklediği görülmüştür (Brown 1997, Brown ve ark 1998).

Re enfeksiyonun olmadığı durumlarda, aşılamaları takiben bağışıklık bir (Pipano 1977) ila üç buçuk yıl (Zablotskii 1991) arasında kalıcılığını sürdürebildiği bildirilmiş olsa da bazı hayvanlarda aşılama sonrasındaki dönemlerde klinik theileriosis görülebilmekte (Pipano ve Shkap 2006) ve yine kullanılan doza bağlı olarak kimi aşılamalar sonrasında yedi ay gibi bir dönem sonunda koruma olmamaktadır (Ouhelli ve ark 1994). Bu da doğal yolla oluşan re enfeksiyonların yetersiz olduğu bölgelerde hayvanların tekrar aşılanmaya ihtiyaç duyacağını göstermektedir. Bununla beraber, aynı hücre kültürü aşısının kullanılmasına bağlı olarak ilk inokule edilen donor lökosit hücrelerine karşı hayvanda gelişen allojenik yanıtta oluşan dolaşımdaki antikorlar parazitin alıcı hayvana transferini bloke edebilmektedir. Yine de, farklı konak MHC feotipine sahip ikinci bir aşılamanın yapılması bağışıklığı güçlendirmektedir (Pipano ve Shkap 2006). Aşılama öncesinde, alıcı hayvanın ve donor hücrelerin sığır lökosit antijen (BoLA) yapısının belirlenmesinin gerekli olmadığı ve T.annulata parazitlerinin hücre kültürü aşılarından konağa aktarılmasının doku uyuşumundan bağımsız olduğu gösterilmiştir (Innes ve ark 1989). Bu durum, T. parva’da gözlenen ve parazitin konağa aktarılmasında donor ile alıcıya ait MHC sınıf I genotiplerinin benzer olması gerekliliği durumu ile tam bir zıtlık oluşturmaktadır (Dolan ve ark 1984).

Theileria parva ile enfekte hücre kültürlerinin in vitro attenüasyonuna immunojenitenin kaybolması eşlik etmektedir (Brown 1981), bu farklılıklara bağlı olarak ECF’nin kontrolünde enfeksiyon ve tedavi yöntemi, tropikal theileriosis için hücre kültürü aşıları kullanılmaktadır. Virülent hücre kültürlerinin erken dönem pasajları esnasında gen ekspresyonundaki değişimlere bağlı olarak seleksiyon oluştuğu öne sürülmüştür (Sutherland ve ark 1996) bununla birlikte attenüasyondaki moleküler etkileşmeler tam olarak belirlenememiştir. Enfekte hücrelerde görülen matriks metalloproteinaz aktivitesinin attenüasyona bağlı olarak kaybedilmesinin metastaz, abomasal ulser oluşumu ve kaşeksi gibi klinik belirtilerin görülmemesine etkisinin olabileceği öne sürülmektedir (Adamson ve ark 2000, Adamson ve Hall 1997, 1996). Aynı zamanda konak hücre çekirdeğine taşınan parazite ait proteinlerinde attenüasyonda gen ekspresyon profilini etkileyebileceği ve parazit tarafından kodlanan konak çekirdek proteini TashHN’in attenüye hücrelerde daha fazla sentezlendiği belirlenmiştir (Swan ve ark 2003), bununla birlikte bu proteinin virülens üzerine etkisinin nasıl olduğu tam olarak açık değildir. Türkiye kökenli hücre kültürü üzerinde yapılan bir çalışma da parazitin merozoit formuna farklılaşmasında azalma olduğu ve attenüye ile attenüye edilmemiş hücreler arasında mRNA seviyesinde farklı gen ekspresyon profili belirlemiştir. Bununla birlikte, yüksek oranda piroplasm üretmeyen ancak virülensi yüksek olan saha izolatlarının attenüasyonda yalnız başına bu olgunun yeterli olamayacağını

göstermektedir (Somerville ve ark 1998b). Hücre kültürü aşılarının piroplasm ve taşıyıcı hayvanların oluşumundan koruyamadığı bilinmektedir (Zablotskii 1991). Bu tür piroplasm lar beslenen kenelerce oluşturulan süper enfeksiyonlar ile ya da inokule edilen aşıda bulunan kimi az sayıdaki makroşizontun farklılaşması yoluyla oluşmuşabilmektedir.

Hücre kültürü aşılarının üretiminin nispeten ucuz olmasına rağmen, üretilmelerinin oldukça zahmetli olması, soğuk zincir gerektirmeleri, aşının doğru şekilde uygulanmasında deneyime ihtiyaç duyulması gerekmektedir. Aşıların çözdürülmeyi takiben +4°C’da bir ila iki ay kadar zarar görmeden tutulup kullanılabileceği bildirilmesi (Zhang 1991) soğuk zincir gereksinimini bir aşamaya kadar kolaylaştırmaktadır. Hücre kültürü aşılarında görülen bir diğer dezavantajda aşılama sonrası laktasyondaki veya gebe olan hayvanlarda geçici ateş oluşturabilme riskidir (Hashemi-Fesharki 1988). Aşılamayı takiben sekiz ila 11. günlerde eritrositlerin %1’inden azında piroplasmların görülebilmesi ve ortalama 40°C’a varan ateş ile aşılanan bölgeye en yakın lenf yumrusunda oluşan şizontlar (%1–2) görülen en belirgin klinik bulgular arasındadır (Darghouth 2008, Seitzer ve Ahmed 2008). Bu bulgulara bakarak attenüye hücre kültürü aşılamaları, her ne kadar hastalığın endemik olarak görüldüğü bölgelerde kontrol amaçlı kullanılan başlıca yöntem olsa da, aşılanan hayvanlarda gözlenen geçici ateş yükselmesi ve az da olsa piroplasmlara rastlanması aşılamanın hayvanları taşıyıcı hale getirerek enfeksiyonun devamına olanak sağlayabilmektedir. Bu durum endemik instabil bölgeler açısından önem taşımaktadır. Kandan izole edilerek elde edilen aşılar her ne kadar duyarlı hayvanlarda denenmiş olsa da ileriki dönemlerde bunların tekrar virülens hale dönüşme riskleri tamamem ortadan kalkmamaktadır (Pipano 1997). Ayrıca son yıllarda yapılan çalışmalarda aşılanan hayvanlar da gelişen bağışık yanıtta enfekte hücre yüzeyinde MHC sınıf I molekülleri tarafından sunulan parazit aracılı peptidlerin CTL tarafından tanındığı bunların T. annulata’ya karşı koruyucu hücre aracılı bağışıklığın oluşmasında gerekli peptidler olduğu belirlenmiş ve parazite özgü, MHC–I aracılı CTL yanıtın sadece hastalığa bağışık hayvanlarda belirlenip, hasta yada duyarlı olanlarda görülmediği vurgulanmıştır (Seitzer ve Ahmed 2008). Buna ek olarak, aşılı hayvanlarda gelişen korumanın heterolog şuşlara karşı zayıf olmasında farklı suşlara özgü oluşan CTL yanıtın rolünün olabileceği belirtilmiş (Darghouth 2008) ve son yapılan çalışmada aşılanmış hayvanlar da oluşan CD8 T hücre yanıtın parazit suşlarına özgü olduğu, bununla birlikte bağışık yanıt oluşan populasyon içinde ve klonlanmamış parazit populasyonundadaki hedef antijenlerde, suşlara özgü CD8 T hücrelerinin heterojenite gösterdiği belirlenmiştir (Machugh ND ve ark, 2008). Hücre kültürü aşılarının koruyuculuğun da enfekte hücre yüzeyinde sunulan parazit

theileriosis’e karşı korumada CTL hücreleri tarafından tanınan bu peptidlerin belirlenerek bunlara yönelik sub unit aşılar geliştirilmesinin önemini göstermektedir. Bu sebeple her ne kadar attenüye hücre kültürü aşılarının başarılı olarak kullanılıyor olmalarına karşın etkili sub unit aşıların getiştirilmesi ile bu kısıtlayıcı etkiler ortadan kaldırılabilecektir.