Theileria annulata’nın Yaşam Çemberi

Theileria annulata, keneler tarafından nakledilen, zorunlu hücre içi parazittir. T.annulata hem vektör kenelerde hem de omurgalı konakta birbirinden morfolojik olarak farklılık gösteren gelişme dönemleri geçirir. Parazitin yaşam çemberi, omurgalı konakta şizogoni ve merogoni ile ara konak olan vektör kenelerde gametogoni ve sporogoni olmak üzere dört temel dönemden oluşur (Şekil 1.2).

1.2.1. Omurgalı Ara Konaktaki (Sığır) Dönem

Vektör kene, enfeksiyonu sığırlar üzerinde beslenirken nakleder. Bazen, konjenital yolla rastlantısal olarak buzağılara bulaşma olabilmektedir. Bu durum özellikle buzağı doğumlarından sonraki ilk bir hafta içinde görülen hastalık tablosunda göz önünde bulundurulmalıdır (Levine 1985). Hastalığın sığırlara bulaşmasında sporozoit adı verilen, 0,75–1,5 (≈1) µm boyunda, oval yapılı, tek çekirdekli, 20–25 nm kalınlıkta ve tripsine duyarlı belirgin bir dış tabakaya sahip parazit formları rol oynamaktadır. Çekirdek sporozoitin yarısını işgal ederken, çekirdeğin karşı kutbunda rhoptilerin (2–3 adet) tutunduğu apikal kompleks bulunmaktadır. Sporozoitlerde bulunan tek mitokondrion ile apikoplast denen yapı birbirleri ile yakın ilişki içindedir ve bu organeller çekirdek zarı ile ilintili halde bulunur. Sporozoit stoplazmasının kalan kısmında serbest ribozomlar (granüllü ve granülsüz) ve birçok elektron dense mikrosferler yer almaktadır (Shaw ve ark 1991). Nimf ya da olgun dönemdeki enfekte kenelerin tükürük bezi asini hücrelerinde bulunan sporozitler, kenenin kan emmesi esnasında omurgalı konağa nakledilirler. Kenenin, omurgalı konak üzerinde beslenme süresi kene türleri ile birçok çevresel faktörün etkisi altındadır. Enfekte kenenin kan emme esnasında tükrük bezlerinde bulunan sporozoitler beslenmenin ilk döneminde değil, bunun aksine ilerleyen dönemlerinde ve az miktarlarda yavaşça (fasılalı olarak) ara konağa nakledilmektedir. Sporozoitlerin, konak hücrelerine giriş yerinin tam olarak neresi olduğu bilinmemekle birlikte, muhtemelen bu girişin enfekte kenenin kan emdiği tarafta ya da buraya en yakın lenf yumrusunda oluşabileceği varsayılmaktadır. Kenenin kan emdiği bölgenin etrafında oluşan lökosit hücrelerinden zengin yangısal reaksiyon sporozoitlerin muhtemelen bu aşamada hücre içine girebileceğini düşündürmekte, ancak sporozoitler kene tarafından nakledildikten sonraki birkaç dakika içersinde çevredeki en yakın lenf yumrusuna da ulaşabildiği (Shaw ve ark 1991) düşünüldüğünde sporozoitlerin konak hücrelere giriş yerinin tam olarak belirlenebilmesi için detaylı çalışmalara ihtiyaç duyulmaktadır. T. annulata ve T.parva türlerinin omurgalı konakta hangi lökosit populasyonunu enfekte ettiğini belirlemek

için yapılan in vitro deneysel çalışmada; purifiye edilmiş sığır hücreleri (monosit, T-hücreleri) ve bunların MHC (büyük doku uyuşum kompleksi) sınıf II pozitif ve negatif olan alt populasyonları her bir parazit türüne ait sporozoitler ile ayrı ayrı muamele edilmiş ve T.annulata’nın tercihen monosit / makrofaj kökenli MHC sınıf II pozitif hücreleri enfekte ettiği gözlenirken, T-hücrelerinde az oranda enfeksiyon oluşmuş, MHC sınıf II negatif hücrelerde ise enfeksiyon oranının neredeyse yok denecek kadar az olduğu belirtilmiştir. T.parva’nın ise, T. annulata’nın tam aksine tercihen T-hücrelerini enfekte ettiği, ancak monosit / makrofaj kökenli hücreleri enfekte edemediği görülmüştür (Glass ve ark 1989). Benzer bir çalışmada, T. annulata’nın T. parva’ya nazaran B-hücrelerini daha fazla enfekte ettiği gösterilmiştir (Spooner ve ark 1989).

Sporozoitler sığır vücuduna inokule olduktan sonraki 5–60 dakika içerisinde reseptör aracılı endositoz yoluyla lökositlere girerler. Her bir konak hücresine en fazla 15 sporozoit girebilmektedir. Sporozoitlerin hücreye girişi; konak hücreye bağlanma, parazitin hücre membranı ile sarılması ve hücre içine alınma adı verilen, farklı ancak birbirinin devamı niteliğinde olan bir seri olaylar silsilesi şeklinde gelişir.

Theileria sporozoitlerinde apikompleksa anacındaki diğer türlerden farklı olarak mikronemler ve özelleşmiş sitoskeletal yapılar bulunmaz. Bu nedenle Theileria sporozoitleri hareketsizdir. İlk bağlanma pasif yolla, sıcaklığa bağımlı olmadan 0 – 4 °C arasındaki sıcaklıklarda dahi gerçekleşebilir. Sporozoitlerin konak hücreye bağlanmasında parazitin yönünün (oriyantasyonunun) herhangi bir önemi yoktur, yani parazit konak hücreye giriş için apikal ucu ile hücre membranını karşı karşıya getirmek için tekrar oriyante olmaya ihtiyaç duymaz. Bununla birlikte, bağlanmadan sonraki aşamalar aktif yolla ve sıcaklığa bağımlı olarak gerçekleşir (Jura 1984, Shaw ve ark 1991, 1997). Hücreye giriş, parazit ve hücre membranlarının karşı karşıya geldiği kısımdan başlayarak çevresel olarak parazitin hücre membranı ile sarılması ve hücre içine alınma ile sonuçlanır. Sporozoit ile konak hücre arasındaki ilk bağlanma oldukça kuvvetlidir ve sporozoitler bir defa bağlandıklarında hücre içine giriş 37°C’de yaklaşık üç dakikada içerisinde ve bundan sonraki hücre sitoplazması içinde serbest kalma ise 15 dakika içinde gerçekleşir. Etrafını saran hücre membranından kurtulup sitoplazma içinde serbest kalamayan parazitler yaşamlarını devam ettiremezler. Sporozoitlerin konak hücreye girişi canlı ve metabolik olarak aktif olmalarına ve ortamın pH’sına bağlıdır (Shaw ve ark 1991, 1997). Theileria türleri konak hücre sitoplazması içinde çoğalır ve farklılaşırlar, ancak apikompleksa anacında bulunan Plasmodium ve Toxoplasma gibi türlerden farklı olarak etraflarında herhangi bir parazitofor vakuol bulunmaz (Mehlhorn 1984). Hücre içine girişten sonra, parazit rhoptri ve microsiferlerinde bulunan proteinleri

etrafını saran hücre membranından kurtulup sitoplazma içerisinde serbest kalmak için dışarı salgılar. Bununla eş zamanlı olarak konak hücre mikrotubulleri parazit tarafından salgılanan mikrosferlerle birleşerek, parazitin yüzeyini kuşatır. (Fawcett ve ark 1984, Fawcett ve ark 1982b, Shaw ve ark 1991, Shayan ve Ahmed 1997).

Sporozoitlerin konak hücre içine girişi hem konak hücrede hem de sporozoitlerde önemli değişimleri başlatır. Konak hücre sitoplasmasına yerleşen parazit hem çok çekirdekli şizontları oluşturmak için farklılaşmaya başlar hem de konak hücrede tranformasyona (değişime) yol açarak enfekte hücrelerin klonal genişlemesine yol açar. Theileria ve apikompleksa anacındaki diğer parazitler, DNA replikasyonu ve mitoz bölünmeyi hücre bölünmesinden ayrı şekilde yapabilirler. Hücre içine girmiş olan parazit hücre bölünmesi yapmadan birçok kez DNA replikasyonu ve çekirdek bölünmesi yaşar. Bu bölünmelerin sonucunda konak hücre sitoplazması içinde çok çekirdekli sinsitiyal (içleri sitoplazma ile dolu olan hücre benzeri yapılar) cisimler oluşur. Aynı zamanda, yaşam siklusunun farklı dönemlerinde parazit konak hücre döngüsünde değişikliklere neden olur. Sporozoitler konak hücre içinde farklılaşarak trofozoitleri bunlarda yukarıda anlatıldığı şekilde gelişerek çok çekirdekli makroşizontları oluştururlar. Makroşizontlar hücre sitoplazması içerisinde serbest olarak yerleşmişlerdir ve dış yüzeyleri plasma membranı ile kaplı durumdadır (Shaw ve Tilney 1992). Makroşizontların çekirdekleri sitoplazma içerisinde dağınık halde bulunur ve her biri porlu nükleer zar ile çevrilidir. In vitro ortamda, makroşizontlar ortalama 12 çekirdeklidir ve her bir çekirdek yaklaşık 1,5 µm çapındadır. (Mehlhorn 1984). Parazit bu çok çekirdekli döneminde konak hücrelerinin bölünüp çoğalmasına sebep olur. Parazitte bu aşamada bölünerek çoğalmakta ve konak hücrenin mitotik çıkıntılarına bağlanıp eş zamanlı olarak konak hücre ile bölünüp oluşan yeni hücrelere dağılmaktadır. Çoğalma ilk olarak enfekte lenf yumrularında olur, ancak sonraki dönemlerde enfekte hücreler kontrolsüz olarak kanser hücrelerine benzer şekilde çoğalıp metastazik özellik göstererek kan ile diğer doku ve organlara yayılır. Parazit ile enfekte hücreler, enfeksiyonun başlamasından sonraki beşinci günde kenenin sporozoiti inokule ettiği taraftaki yüzeysel lenf yumrularından alınan biopsi örneklerinden hazırlanan preparatlarda tespit edilebilmektedir. Yaşam çemberini tamamlayabilmek için oluşmuş olan makroşizontların bir bölümü farklılaşarak çok sayıda tek çekirdekli merozoitleri oluştururlar (Shaw 2003). Bu dönemde şizontlar büyüyüp genişler ve bunu çok ayıda tek çekirdekli meroziotlerin oluşması takip eder, oluşan bu merozoitler konak hücre sitoplazmasında serbest halde bulunurlar.

benzerler. Her bir merozoit apikal kutbunda rhoptrileri ihtiva ederken, sporozoitlerde görülen mikrosferler ve diğer bazı organeller (mikronem veya yoğun granüller gibi) bulunmaz. Sporozoitlere benzer şekilde, merozoitlerin yönünün konak eritrositlerine girişte önemi yoktur. Eritrosit içine giriş merozoit ve hücre membranının karşı karşıya geldiği kısımdan başlayarak çevresel olarak parazitin hücre membranı ile sarılması ve hücre içine alınma ile sonuçlanır. Hücre içine alınan meroziotin etrafı tamamıyla hücre membranı ile sarılı durumdadır. Daha sonra rhoptrilerde bulunan proteinler salgılanarak parazit etrafını saran hücre membranında kurtularak sitoplazma içerisinde serbest hale geçer. Ancak konak hücreye giren sporozoitlerden farklı olarak konak hücre mikrotubulleri ile her hangi bir birleşme olmaz. Merozoitler eritrositlere girdikten sonra piroplasm olarak adlandırılan formları oluştururlar. Parazitin bu formları makroşizontların ilk görülmesinden sonraki bir ila üç gün içinde kanda belirlenebilirler (ya da enfeksiyondan sonraki 8–10 gün içinde) ve enfekte hayvanlar parazitin bu formunu yıllar boyunca taşıyabilirler (Pipano 2006). Piroplasmlar tek bir hücre membranı ile çevrili, küre, oval ya da virgül şeklindeki yapılardır (Mehlhorn 1984). Merozoitlerin hücre içine girişinde rol oynayan faktörlerin neler olduğu tam olarak bilinmemektedir. Yapılan in vitro çalışmalarda, metalloproteaze inhibitörlerinin T. sergenti merozoitlerinin eritrositlere girişinin bloke ettiği gösterilmiş ve bu da eritrosite girişte enzimatik yolların kullanılıyor olabileceğini düşündürmektedir. Buna ek olarak, yüzeyinde bulunan sülfat glikokonjugatlarının varlığına bağlı olarak merozoitlerin hücreye bağlanması ve girişi heparin kullanılarak bloke edilmiştir (Hagiwara ve ark 1996, Hagiwara ve ark 1997). Eritrositler içindeki yaşam çemberi türler arasında farklılık gösterir. Piroplasmların hücre kültüründe merogoni benzeri (karyokinezi takip eden bir sitokinez yoluyla) yolla bölündükleri gösterilmiştir. Çoğalan bu piroplasmlar, merozoitlerin lökositleri terk etmesine benzer yolla eritrositleri terk ederek yeni eritrositleri enfekte edebilecekleri kanısı vardır (Conrad ve ark 1985). Ancak, T. annulata ve T. parva’da eritrosit içindeki bu çoğalma sınırlı düzeydedir. Bu türlerde genelde enfekte lökositlerce üretilen merozoitler devamlı olarak yeni eritrositleri invaze ederler (Ilhan 1999). Keneler, enfekte hayvan üzerinde beslenmeleri esnasında piroplasmlarla enfekte olmuş eritrositleri alarak parazitin ara konaktaki yaşam çemberinin devamını sağlarlar.

Şekil 1.2. Theileria annulata’nın Yaşam Döngüsü; enfekte kenenin kan emmesi esnasında

omurgalı ara konak olan sığıra inokule edilen sporozoitler myeloid hücrelere girerek burada çok çekirdekli makroşizontlara farklılaşırlar. Enfekte hücrelerdeki klonal çoğalma esnasında bir kısım makroşizontlar farklılaşarak merozoitleri oluştururlar. Oluşan bu merozoitlerde konak hücre zarını parçalıyarak serbest hale geçer ve dolaşımdaki eritrositlere girerek piroplasmları oluştururlar. Eritrositler içerisindeki bu piroplasmlar kan emme esnasında omurgasız ara konak olan kenelere nakledilirler. Alınan piroplasmlar kene bağırsağında gametositleri oluşturur ve bu gametositlerde kaynaşarak zigotları meydana getirirler. Daha sonra zigotlar farklılaşarak hareketli kinetlere dönüşür (zigot ve kinetler parazitin yaşam çemberindeki tek diploid dönemlerdir). Hareketli kinet hemolenf yoluyla kenenin tükrük bezlerine göç ederek burada aseksüel çoğalma yoluyla sporoblast ve sporozoitleri oluştururlar.

1.2.2. Omurgasız Ara Konaktaki (Vektör) Dönem

Theileria annulata’nın yaşam çemberindeki gametogoni ve sporogoni dönemleri

omurgasız ara konak olan vektör kenelerde geçer. T. annulata’nın ixodid bir kene olan Hyalomma detritum tarafından nakledildiği ilk kez Cezayir de yapılan bir çalışmada gösterilmiştir (Sergent 1928). Daha sonraları, T.annulata’nın Hyalomma soyuna bağlı 15 kene türü tarafından doğal ya da deneysel olarak nakledilebildiği belirlenmiştir (Robinson 1982). Hastalığı nakleden keneler arasında en önemli olanları üç konuklu Hyalomma anatolicum anatolicum ve iki konuklu Hyalomma detritum keneleridir (Uilenberg 1981). T. annulata, keneler tarafından transtadial olarak nakledilir, yani keneler larva ya da nimf dönemlerinde enfekte hayvanlardan kan emerken aldıkları etkenleri, ancak kene gömlek değiştirip bir sonraki gelişme dönemine (nimf ya da olgun) geçtiğinde omurgalı konaklara nakledilebilirler. Hyalomma excavatum keneleri deneysel şartlarda T. annulata’yı nakletmelerine karşın doğal ortamda bu kenenin larva ve nimflerinin rodentlerden kan emmeleri sebebiyle olgunları hastalığı nakledememektedir (Barnett 1977). Keneler omurgalı konaktan kan emme esnasında enfekte eritrositleri alır, ancak parazitin keneler tarafından nakledilmesinde rol oynayan bir takım etmenler vardır; i) kene kan emmeye başladığı ilk dönemlerde aldığı enfekte eritrositlerin büyük bölümü lize olup parçalanmakta, ancak kenenin doymaya başladığı ileriki dönemlerde alınan parazitler yaşamını devam ettirebilmektedir. Buna bağlı olarak larva ve nimf dönemlerinde keneler olgun dönemlerine nazaran hayvan üzerinde daha az süre kalarak daha az kan emmektedirler. Bu sebeple larva ve nimf döneminde, olguna nazaran hem daha az enfekte eritrosit alınmakta hem de yaşamını devam ettirebilen etken sayısı daha az olmaktadır. ii) Ayrıca, barsak epitelyumunun yapısı ile barsak lümeninin durumu da kene türleri arasında farklılıklar göstermekte ve bu durum parazitin gelişmesine etki edebilmektedir. Kenelerin kan emerken aldıkları piroplasmlardan gametositlerin oluşumu barsak lümeninde eritrositlerin lize edilerek parazitin serbest hale geçmesi ile başlar. Bununla birlikte, serbest hale geçen parazitlerin ne kadarının gametlere farklılaştığı ve gametogenezisi kontrol eden faktörlerin neler olduğu bilinmemektedir (Şekil 1.2).

Kene kan emip doyduktan sonraki bir ila dört gün içinde, barsak lümeninde ince, iğ-benzeri mikrogamontlar oluşur (Schein 1975, Schein ve ark 1975). Mikrogamontlarda bulunan flagella benzeri çıkıntılarda sayıları dörde varabilen çekirdekçikler oluşur, bunlar daha sonra ayrılarak fili form yapılı mikrogametleri oluştururlar. Aynı zamanda, küre biçimindeki makrogametlerde bu aşamada oluşmuş durumdadır. Daha sonra makro ve mikrogametlerin kaynaşarak zigotları oluşturduğu varsayılmaktadır (Levine 1985, Schein ve

sonraki beşinci günden itibaren barsak epitelyumunda görülürler. Zigot oluşumundan sonra parazit çoğalarak önce tetrapoit ve bunu takibende kinetlere farklılaşma esnasında polipoit formları oluşmaktadır. Daha sonra zigotlar değişime uğrayarak çomak şekilli kinetleri oluştururlar. Zigotun görülmesinden sonraki 12–15 gün içerisinde parazitin hareketli formu olan kinetler kenenin hemolenfine geçerek tükürük bezlerine doğru göç ederler (Schein ve Friedhoff 1978). Parazitin yaşam çemberinde tek diploid dönem zigot ve kinet dönemleridir. Kinet tükrük bezi acini hücresi (tip II ya da tip III) içinde değişime uğrayarak sporoblastlara dönüşür ve çekirdek bölünmesi başlar. Bu aşamada tip II ve tip III acini hücrelerinde parazitin oluşturduğu çok çekirdekli sinsitial yapıya bağlı olarak genişleme meydana gelir. Kene omurgalı konaktan kan eminceye kadar sporogoni dönemi başlamaz, yani enfekte acini hücreleri içinde parazitler sporoblast safhasında beklerler. Kenenin omurgalı konaktan kan emmeye başlaması ile sporoblastlar aktive olarak sporogoni dönemine geçer. Yapılan çalışmalarda, Hyalomma anatolicum olgunlarının tükrük bezlerindeki sporozoitlerin, kenenin hayvan üzerinde beslenmeye başlamasından sonraki 24 ila 48 saat (maksimum 72 saat) sonra oluştuğu belirtilmiştir (Singh ve ark 1979). Bir diğer çalışmada da, 37°C sıcaklık ve %95 nisbi nemde tutulan enfekte, olgun Hyalomma excavatum kenelerinin kan emmelerine gerek kalmadan tükrük bezlerinde sporozoit gelişimi olduğu gösterilmiştir (Samish 1977). Bu da hastalığın naklinde rol oynayan bazı kenelerin omurgalı konaktan kan emmeye başlamadan önce tükürük bezlerinde sporozoitlerin gelişmiş olabileceğini akla getirmektedir. Kenede sporogoni dönemi başladıktan sonra oluşan sporozoitler kenenin acini hücrelerinde dejenerasyona yol açıp kenenin tükürüğünde serbest halde geçerler. Her bir enfekte acini hücresinde tahmini olarak 40 bin sporozoit oluşabilmektedir (Young ve ark 1992). Kene kan emme esnasında oluşan sporozoitleri bir anda değilde fasılalı olarak konak vücuduna vermektedir. T. annulata’nın yaşam çemberindeki görülen farklı dönemlerin moleküler olarak nasıl kontrol altında tutulduğu tam olarak anlaşılabilmiş değildir. Bununla birlikte, sporogoni ve lökositlerdeki merogoni dönemleri ile eritrositler içinde piroplazmlara farklılaşma morfolojik olarak benzer bir mekanizmayla oluşmakta ve bununda T. annulata’nın genomundaki belli bir gen grubu tarafında kontrol edilebileceği ileri sürülmekte ve bir takım modeller geliştirilmektedir (Shaw ve Tilney 1992, Shiels 1999).