Esta técnica, denominada RaSH (rapid subtration hybridization) permite a análise de expressão diferencial através de subtração por hibridização capaz de isolar genes que são expressos em uma determinada condição pré estabelecida. A metodologia do RaSH está representada na forma de esquema na figura 5A. A figura 5B indica as condições experimentais (PV-NLS ou PV-NLS-Cd) e a alteração na expressão gênica (regulados para cima ou para baixo) que a metodologia RaSH possibilitou para este trabalho. Para obtermos uma condição de redução de Ca2+ no interior da célula utilizamos uma construção adenoviral, fornecida pelo laboratório do Dr. Nathanson. Para realizarmos a subtração utilizamos amostras de RNAs extraídos de células SKHep1 infectadas com Ad-PV-NLS-DsRed contra amostras de RNA extraídas de células infectadas com Ad-PV-NLS-Cd-DsRed.
A primeira construção adenoviral possui uma proteína capaz de tamponar o Ca2+ em compartimentos celulares específicos. O cassete de expressão montado nesta construção possui a seqüência gênica que codifica a parvalbumina (PV) que é uma proteína com alta afinidade pelo Ca2+. A PV é uma proteína Ca2+-binding de baixa massa molecular (12 KDa) presente no músculo esquelético dos vertebrados (Pechere et al., 1971). Quantificação da ligação de Ca2+ pela PV tem mostrado que sua constate de afinidade aparente é de Kca= 2,8x107 M-1 na presença de 1 mM de Mg2+, ou Kca= 2,7x109 M-1 na ausência de magnésio (Moeschler et al., 1979). Há também uma seqüência que codifica a proteína vermelha DsRed seguida por três repetições da seqüência NLS (seqüência de localização nuclear) que direciona todo o cassete para o núcleo da célula (Figura 6A). Com a expressão da proteína DsRed apenas no núcleo da célula (Figura 6B) podemos afirmar que a parvalbumina promove a redução de Ca2+ nuclear sem afetar os níveis de Ca2+ citosólico porque a proteína é expressa exclusivamente no núcleo da célula (Figura 6B). No caso da seqüência NLS-Cd, a expressão também ocorre no núcleo da célula porém, não há alteração do sinal de Ca2+.
A)
B)
Figura 5. Metodologia RaSH. A) Representação esquemática da metodologia RaSH
A figura 6C mostra que o adenovírus Ad-PV-NLS-DsRed promove o tamponamento de Ca2+ apenas no núcleo. Neste perfil podemos observar que os sinais nucleares estão quase próximos à linha basal (Figura 6C). Utilizamos como controle o Ad-PV-NLS-Cd-DsRed, esse adenovirus possui dois sítios da parvalbumina mutados e promove apenas ligeira redução dos níveis do Ca2+ nuclear, mas esta redução não é significativa. Assim, esperamos selecionar genes que têm expressão modulada por alterações nos níveis nucleares de Ca2+.
3.4.1. Extração de RNA total
O RNA total foi extraído utilizando o reagente Trizol e o método desenvolvido por Chomczynski e Sacchi (1987). Após homogeneização das amostras de tecido ou células com o trizol, o complexo formado foi incubado por 5 minutos a 30°C e centrifugados por 15 minutos a 4°C e 13000 RPM. A fase superior foi coletada e o RNA foi precipitado com álcool isopropílico por 16 horas a -20°C. Nova centrifugação a 8.000g por 10 minutos e lavagem com etanol 70% foram realizadas e o RNA foi ressuspenso em água tratada com DEPC (dietilpirocarbonato). O RNA foi quantificado por espectrofotometria a 260 nm e armazenado a -80C até seu uso. A concentração do RNA foi estimada pela fórmula: [RNA] µg/µl = (A260 f x40/1000), onde f é o fator de diluição e 40 é o fator de conversão.
3.4.2. Síntese da primeira e segunda fitas de cDNA
A primeira fita de cDNA foi sintetizada usando o SuperScriptTM-III First-Strand Syntesis System for RT-PCR, de acordo com as recomendações do fabricante. Dois microgramas de cada amostra de RNA total foram incubados com 0,5 g de oligo(dT)12- 18 a 70C por 10 minutos e, em seguida, as amostras foram incubadas no gelo. Logo após, foi adicionado às amostras, tampão PCR 1X (Tris-HCl 20 mM pH 8,4 e KCl 50 mM), MgCl2 5 mM, os quatro dNTPs 0,5 mM cada e DTT (ditiotreitol) 5 mM, e foram incubadas a 42C por 5 minutos. Em seguida, foram adicionadas 200 unidades da enzima SuperScript III RNaseH- Reverse Transcriptase (Invitrogen) e as amostras foram incubadas por mais 50 minutos a 42C.
Após a síntese da primeira fita de cDNA, o RNA do híbrido DNA/RNA foi degradado por incubação com duas unidades de RNase H (Invitrogen) a 37C, por 20 minutos. Para cada reação de síntese da primeira fita foi feito um controle negativo que continha todos os reagentes exceto a enzima transcriptase reversa.
Para a síntese da segunda fita, foram adicionados ao volume total obtido na reação de primeira fita, 0,3 mM de dNTPs, uma unidade de DNA ligase (10U/μl) (Invitrogen), 40 unidades de DNA polimerase I de E. Coli (10U/μl) uma unidade de Rnase H (2U/μl) em um volume final de 100 μl. Esta reação foi incubada por 2 horas a 16C e depois foi acrescentado 5 unidades de T4 DNA ligase (Invitrogen). A reação foi extraída com fenol/clorofórmio, precipitada em etanol e ressuspendida em água DEPC.
A) B)
C)
Figura 6. Tamponamento de Ca2+ nuclear pela proteína Parvalbumina (PV). A) Representação esquemática da construção do cassete. B) A cor vermelha no núcleo da célula indica que a construção Ad-PV-NLS-DsRed está corretamente sendo expressa no núcleo. C) Traços representativos dos sinais de Ca2+ em células SKHep1 após estimulação com 100nM de vasopressina. Células foram examinadas 48 horas após infecção com a construção adenoviral contendo apenas o controle DsRed ou o DsRed fusionado ao NLS. O Ca2+ foi monitorando com Fluo-4/AM e microscopia confocal. Barra de escala = 10µm (Rodrigues et al., 2007).
3.4.3. Preparação da biblioteca de cDNA baseada em PCR
A subtração, descrita por Jiang e colaboradores (2000), foi realizada entre os cDNAs TESTER e DRIVER obtidos de RNA de células SKHep1 infectadas com adenovírus contendo parvalbumina, proteína quelante de Ca2+. Usamos também a construção adenoviral Ad-PV-NLS-Cd-DsRed, mesma construção que contém um dos dois sítios de ligação ao Ca2+ da parvalbumina mutado (glutamato por valina na posição 12 de cada loop de ligação ao Ca2+), como tratamento controle. Após a síntese do cDNA, todo o volume de cDNA obtido foi digerido com a enzima de restrição MboI (Invitrogen) a 37°C por 1 hora, seguido por extração com fenol/clorofórmio e precipitação em etanol. O cDNA digerido foi ligado a adaptadores XDPN12 e XDPN14 (Tabela 1) na concentração final de 20 µM em 30 µl de tampão de ligação, aquecido a 55°C por 1 minuto e incubado a 14°C por 1 hora. T4 DNA ligase (15 unidades) foram adicionados à reação e deixados a 14°C por 16 horas. A mistura foi diluída para 100 µl com tampão Tris 10mM, EDTA 1mM pH 7. Desta reação, 40 µl foram utilizados para amplificação por PCR.
As reações de amplificação foram realizadas em um volume final de 50 L contendo 1,0 µM de cada dNTP, 1 unidade de Taq DNA Polimerase, 10 µM do primer XDPN18 (Tabela 1),tampão PCR 1X (Tris-HCl 20 mM pH 8,4 e KCl 50 mM) e MgCl2 2,5 mM. As seqüências dos oligonucleotídeos utilizados estão descritas na Tabela 1. Os parâmetros da reação de PCR foram: 1 ciclo de 5 mim a 72°C, seguidos por 25 ciclos de 1 min a 94°C, 1 min a 55°C e 1 min a 72°C, e 1 ciclo de 3 min a 72°C. O produto de PCR foi purificado por extração com fenol/clorofórmio e precipitado em etanol. Uma porção do produto de PCR TESTER foi digerida com a enzima de restrição Xho I. Dois grupos de bibliotecas de cDNA foram preparados: um com sítios de restrição para Xho I e outro sem o sítio.
3.4.4. Hibridização subtrativa e geração de biblioteca subtraída
Três microgramas do cDNA TESTER foi misturado a 10 µg de cDNA DRIVER em 10 µl de solução de hibridização [NaCl 0,5 M, Tris 50 mM ph 7,5, SDS 0,2% e formamida 40% (vol/vol)], fervido por 5 minutos e incubados a 42°C por 48 horas. A mistura de hibridização foi extraída com fenol/clorofórmio, precipitada em etanol e dissolvida em 20 µl de tampão Tris 10 mM/EDTA 1mM pH 7. Parte desta mistura foi
ligada a 1µg do vetor pZeRo.1 previamente digerido com a enzima Xho I, a 14°C por 16 horas e transformado em bactéria E. coli DH10B.
Tabela 1. Primers específicos utilizados no seqüenciamento e nas reações de RT-PCR.
Adaptadores Sequência (5’ 3’) XDPN12 GATCTCTCGAGT XDPN14 CTGATCACTCGAGA XDPN18 CTGATCACTCGAGAGATC Primers Sequência (5’ 3’) Actina Foward Actina Reverse CCCCTCAACCCAAAGGTCAACAG GGAATCTCTCTGCCCCAATTGTG RTN4 Foward RTN4 Reverse GATGTGGGTATTTACCTATGTTGGTGCC GATGAACACATGGCAGTCAAGACAGG LGMN Foward LGMN Reverse CGGACCCACTGCTTCAACCTGG CCCCATGAGCTTCCTGCTCC TBRG Foward TBRG Rverse CTGCTGGACAGTGACGGCGAG GGCCCAAGGTCCTGCACAGAGGT
3.4.5. Screening das colônias
Colônias de bactérias foram selecionadas randomicamente e submetidas à amplificação por PCR de colônia utilizando primers universais M13 (forward e
reverse). Clones selecionados foram submetidos ao sequenciamento.
3.4.6. Seqüenciamento e análise dos resultados
O DNA plasmidial dos clones selecionados foi extraído e seqüenciado utilizando o primer M13 forward. As reações de sequenciamento foram conduzidas com o kit Dyenamic ET Dye Terminator (GE Healthcare) conforme recomendações do fabricante, e analisadas pelo sequenciador MegaBace. As seqüências obtidas mostraram alta qualidade de nucleotídeos e a busca por similaridades foi feita com outras seqüências depositadas no GenBank através do programa BLASTn (Altschul et al., 1997) do
“National Center for Biotechnology Information”– NCBI - (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).