Örneklem ile ilgili Tanımlayıcı İstatistikler

Desde a antiguidade já se conhecia o processo de regeneração hepática através da Mitologia Grega. Como punição a Prometeu, um titã que roubou o segredo do fogo dos deuses para levá-lo aos homens. Zeus, o deus dos deuses, ordenou que Prometeu fosse acorrentado ao Monte Cáucaso, e que todos os dias um abutre viesse comer partes do seu fígado, que seria regenerado durante a noite, para que o seu suplício fosse eterno. A regeneração hepática, no entanto, não é apenas um mito, mas sim um fato.

A capacidade regenerativa do fígado é imensa e reflete uma complexa resposta para promover a replicação celular e o crescimento suficiente para restaurar a massa funcional do fígado (Fausto et al., 2006). Quando ocorre uma lesão do parênquima hepático, induzido por qualquer estímulo, é desencadeado o processo de reparação. Este processo começou a ser elucidado com o advento da biologia molecular e com o avanço das técnicas que investigam os processos de divisão celular. Conhecer todo o mecanismo de regeneração facilita o prognóstico e a patogênese das mais freqüentes doenças do órgão como hepatite, cirrose e hepatomas (Taub, 2004).

A geração de novas células de um fígado injuriado depende da pré-existência de células que possam recompor o tecido perdido. Diferente do conceito clássico de regeneração, que é a neo-formação de tecidos e órgãos perdidos, após a perda de massa hepática o fígado entra em replicação conduzindo a uma hiperplasia compensatória que envolve as células maduras da parte intacta do órgão. Isto promove o repovoamento celular e tecidual, ou seja, os lobos removidos não crescem novamente, o que ocorre é o crescimento do lobo restante (Fausto et al., 2006).

No fígado adulto, os hepatócitos são células quiescentes que rapidamente re- entram no ciclo celular após uma injúria no tecido. Após remoção cirúrgica de dois- terços do fígado de ratos, os hepatócitos saem da fase G0 (estágio mitoticamente inativo) e passam pelas fases G1, S (de síntese de DNA), mitose e citocinese. O reestabelecimeto de células perdidas e a restauração da massa hepática excisada ocorrem dentro de uma a duas semanas após a cirurgia (Fausto et al., 2006).

Vários são os eventos que ocorrem durante a regeneração hepática. Os fatores mais importantes presentes na regeneração hepática são: fatores de crescimento, citocinas e alguns genes. Fatores de crescimento como HGF, fator de crescimento transformante α (TGFα) e fator anti-proliferativo TGFβ estão envolvidos nos processos

regenerativos do fígado. O HGF é um importante fator de crescimento que dirige a progressão do ciclo celular durante a regeneração. Ele é produzido pelas células estelares e agem de forma parácrina nos hepatócitos. HGF liga-se ao seu receptor c-met na membrana do hepatócito e ativa uma cascata de sinalização, via ERK1/2. ERK1/2 por sua vez, ativa genes responsáveis pela regeneração do fígado (Huh et al., 2004). Além disso, HGF aumenta Ca2+ intracelular, preferencialmente no núcleo da célula hepática (Echevarria et al., 2003). Sabemos que o aumento intracelular de Ca2+ é importante para a proliferação celular. Porém, o papel relativo do Ca2+ nuclear ou citosólico na proliferação de hepatócito ainda não foi esclarecido.

Estudos moleculares de expressão gênica, aliados às técnicas de microarrays indicam genes que são rapidamente ativados em hepatócitos submetidos à hepatectomia. Estes genes estão envolvidos principalmente em respostas proliferativas. Outros genes ativados durante a regeneração do fígado estão envolvidos nas cadeias ativadas por citocinas. Ainda não está claro como isto ocorre, mas acredita-se que a interleucina 6 (IL-6) é a responsável por ativar o fator transcricional STAT 3 dentro do hepatócito depois que o fator de necrose de tumor (TNF) é liberado pelas células de Kupffer. Isto induz a liberação da citocina pelo hepatócito. Uma vez ativado o STAT 3 forma homodímeros que translocam para o núcleo e induz a transcrição de vários genes alvos (Fausto et al., 2006). Mas os efeitos exercidos pela IL-6 durante a regeneração hepática podem estar sendo modulados por outras moléculas como o stem cell factor (SCF) e a oncostatina M (OSM) (Fausto et al., 2006) demonstrando a complexidade do mecanismo.

1.10. Justificativa

Já foi demonstrado o papel dos sinais de Ca2+ nucleares sobre a proliferação de células SKHep1 (Rodrigues et al., 2007). No entanto, permanece incerto se a expressão dos genes responsáveis pelo processo de proliferação celular pode apresentar alterações em decorrência da modulação dos sinais de Ca2+ nucleares. Sabemos também que após uma injúria, as citocinas, os fatores de crescimento e as vias metabólicas ativadas formam uma grande rede de interação que promovem a regeneração do fígado.

Muito já se sabe a respeito do processo regenerativo, mas novos conhecimentos sobre os mecanismos celulares e moleculares envolvidos na regeneração hepática

conceitualmente e diretamente relevantes para o desenvolvimento de novas terapias para as doenças hepáticas são necessários. Bem como estudar o papel dos sinais de Ca2+ nuclear sobre a expressão de genes importante para a proliferação celular e para a regeneração do fígado. Estes estudos podem fornecer dados que levem à elucidação de mecanismos que regulam o desenvolvimento e a proliferação de células hepáticas.

Diante das mais variadas funções que o Ca2+ intracelular exerce dentro da célula,

decidimos verificar a influência direta que este íon exerce sobre a proliferação de

células hepáticas e sobre o controle da expressão de genes importantes para que os

mecanismos de regeneração hepática ocorram.

Assim, esse estudo teve como objetivos principais:

A) Verificar a influência do Ca2+ nuclear, sobre a expressão de genes envolvidos na

proliferação celular.

B) Investigar o papel que o Ca2+ intracelular liberado a partir da ativação dos

3.1. Materiais e reagentes

Utilizamos o kit Effectene transfection Kit da Quiagen para experimentos de transfecção e o kit pSilencer™ adeno 1.0-CMV System da Ambion’s (Austin, TX) para construção de adenovírus. Para síntese de cDNA foi utilizado o kit SuperScriptTM-III First-Strand Syntesis System for RT-PCR da Invitrogen (Carlsbad, CA) e o Wizard

Plus SV Minipreps DNA Purification System da Promega (Madison, Wisconsin) foi

utilizado para extração de DNA plasmidial.

Para reações de sequenciamento foi utilizado o kit Dyenamic ET Dye Terminator GE Healthcare (Buckinghamshire, UK). A membrana Spectrapor (12 a 14000 KDa de corte molecular; 1 a 2 cm de largura) da BioAgency (Houston, TX) foi utilizada para a diálise das partículas virais e a membrana de PVDF (Hercules, CA) foi utilizada em transferências de western blot. Para extração de proteínas foi utilizado o coquetel de inibidor de protease da Sigma Roche Applied Science (Saint Louis, MO). O kit ECL plus da GE Healthcare (Buckinghamshire, UK) foi utilizado para revelação do western blot em filme de raio-X da Bio MaxTMML, KODAK (Buckinghamshire, UK). A vasopressina Sigma (Sant Louis, MO) foi utilizada para mobilizar Ca2+ intracelular via InsP3Rs. As enzimas de restrição utilizadas foram da Invitrogen (Carisbad, CA). O reagente Trizol Invitrogen (Carisbad, CA) foi utilizado para extração de RNA.

Reagente TRizol e lipofectamine 2000 foram obtidos da Invitrogen (Eugene, OR). Anticorpo policlonal contra LGMN foi obtido da ABCAM (Cambridge, MA). Anticorpo policlonal contra InsP3RI foi obtido da Affinity BioReagents (Golden, CO). Anticorpos secundários Alexa-488 e Alexa-568, e a sonda Fluo-4/AM foram obtidos da Molecular Probes Inc (Eugene, Oregon) e os anticorpos secundários conjugados à peroxidase foram obtidos da Amershan Biosciences. Estes anticorpos foram utilizados para ensaios de imunofluorescência e western blot.

Os plasmídeos pShuttle-1.0-CMV e pAdeno LacZ Backbone foram obtidos do Kit pSilencer™ adeno 1.0-CMV System da Ambion`s (Austin, TX) e os plasmídeos PV-NLS e PV-NLS-Cd e os adenovirus recombinantes pAd-PV-NLS-DsRed e pAd- PV-NLS-Cd-DsRed foram fornecidos pelo laboratório do Dr. Michael H. Nathanson da Universidade de Yale, (New Haven, NY). O plasmídeo pZeRo.1 foi obtido da Invitrogen (Carlsbad, CA). Plasmídeos pGL4.10[Luc] e pRL-CMV, que promove expressão constitutiva da Renilla luciferase, foram obtidos da Promega (Madison, WI).

3.2. Linhagens celulares

As células HEK293 (células renais embrionárias humanas), SKHep1 (linhagem epitelial de células hepáticas) e CHO (células de ovário de Hamster) foram obtidas do banco de células da American Type Culture Colletion (Manassas, VA) e cultivadas em meio DMEM (Dulbecco`s modified Eagle`s medium) ou RPMI 1640 suplementados com 100 U/ml de penicilina, 100 µg/ml de estreptomicina e 0,25 µg/ml de anfotericina- b, 10% de soro fetal bovino (SFB) e mantidos à temperatura de 37°C e 5% de CO2. Hepatócitos foram isolados de fígado de ratos Holzman machos (50-80 gramas) por perfusão com colagenase como descrito por Boyer e colaboradores (1990). Hepatócitos primários foram cultivados em meio L15 (Leibovitz) da Sigma-Aldrich (Sant Louis, MO) sob condições normais de cultivo celular.