realizados com a levedura CCA155 (D. bruxellensis) e PE-02 (S. cerevisiae) em cultura mista e para efeitos de comparação realizou-se também a fermentação com a cultura pura de PE-02, cujos resultados encontram-se nas Figuras 16 e 17 e Tabela 17.
Nesta situação, sem tratamento do fermento, verificou-se um teor alcoólico no vinho superior na fermentação com a cultura pura da PE-02, embora a diferença não tenha sido muito grande em relação à cultura mista com a linhagem CCA155. Não houve diferença significativa quanto ao ART residual e pH final do meio de fermentação entre as duas fermentações, assim como para a eficiência fermentativa, a despeito de uma diferença de cerca de 5 pontos percentuais a mais para a cultura pura da PE-02. Basso et al. (2008) argumentaram que embora a diferença na eficiência fermentativa entre a PE-02 (92,0%) e a levedura de panificação (88,1%) fosse baixa, esta diferença (3,1%) significava cerca de 2,1 milhões de litros de etanol por safra em uma destilaria de médio porte. Assim, há de se considerar a queda significativa no rendimento industrial quando a levedura D. bruxellensis está presente.
Figura 16 - Efeito do tipo de cultura (pura da PE-02 e mista da linhagem CCA155 + PE-02) sobre o teor alcoólico, ART residual, pH e eficiência fermentativa em fermentações desenvolvidas em meio de caldo de cana, 16º Brix, pH 4,3, durante dez ciclos fermentativos de 12 horas, sem tratamento ácido do fermento, a 30ºC. Letras diferentes sobre as barras indicam diferença significativa de 5% pelo teste de Tukey
Houve um crescimento expressivo da levedura contaminante na cultura mista com a PE-02, variando de 2 a 3 ciclos log ao longo dos ciclos fermentativos (Figura 17). Comparando-se com o experimento da fermentação com tratamento ácido, este resultado demonstrou que houve controle do crescimento da levedura D. bruxellensis pelo baixo pH do tratamento.
Figura 17 - Número de leveduras durante as fermentações desenvolvidas em meio de caldo de cana inoculado com as linhagens CCA155 e PE-02 em culturas pura da PE-02 e mista, 16º Brix, pH 4,3, durante dez ciclos fermentativos de 12 horas, sem tratamento ácido do fermento a 30ºC. As contagens foram realizadas em meio WLN e WLD para a cultura mista; para a cultura pura a contagem do número de células foi realizada em câmara de Neubauer
Tabela 17 - Teor alcoólico, ART residual e pH final apresentado pelas linhagens CCA 155 (D.
bruxellensis) e PE-02 (S. cerevisiae) em cultura pura e mista em fermentações desenvolvidas em meio de caldo de cana, 16º Brix, pH 4,3, durante dez ciclos fermentativos de 12 horas, sem tratamento ácido do fermento, a 30ºC
Mista (CCA155 + PE-02) Pura (PE-02)
CICLOS (g/100mL) Álcool ART Residual (g/100mL) final pH (g/100mL) Álcool ART Residual (g/100mL) final pH
C0 0 15,16 4,5 0 15,84 4,5 C1 0,9 11,94 4,0 2,4 10,09 3,8 C2 2,3 9,14 3,6 2,6 9,07 3,6 C3 3,3 5,78 3,4 3,3 6,71 3,6 C4 3,6 4,71 3,4 3,4 7,57 3,7 C5 3,4 7,45 3,7 4,5 5,79 3,7 C6 4,6 6,85 3,7 3,4 6,80 3,7 C7 3,3 11,09 3,7 3,8 6,56 3,6 C8 3,1 7,87 3,7 3,8 5,04 3,6 C9 3,1 5,14 3,6 4,3 3,98 3,7 C10 3,8 3,58 3,7 3,4 6,39 3,9
Os experimentos foram realizados com uma concentração baixa de células de D. bruxellensis inoculada no início da fermentação (103 células/mL), justamente para mostrar como a contaminação poderia evoluir para níveis que afetassem a fermentação. Meneghin (2007) havia testado contaminações na ordem de 10 a 103 células/mL de D. bruxellensis, com perda na eficiência fermentativa. Dias et al. (2003) mostraram que a linhagem ISA1791 de D. bruxellensis em cultura mista com S. cerevisiae em meio sintético, evoluiu de 104 UFC/mL para 5 X 109 UFC/mL. Em cultivos laboratoriais utilizando suco de uvas brancas e vermelhas, a inoculação de baixa concentração (10 UFC/mL) de D. bruxellensis juntamente com 107 UFC/mL de S. cerevisiae, mostrou crescimento da primeira a níveis de 5 X 108 UFC/mL.
A taxa de produção de etanol de D. bruxellensis em fermentações industriais é de apenas 20% em comparação a de S. cerevisiae, sendo assim a biomassa de D. bruxellensis no fermentador deve ser pelo menos cinco vezes superior a de S. cerevisiae para obtenção de produtividades semelhantes (BLOMQVIST et al., 2010).
No item anterior, especulou-se sobre o efeito do tratamento ácido no controle da levedura contaminante, assim como o efeito benéfico desse tratamento sobre a levedura do processo, ambos podendo contribuir para minimizar o efeito da contaminação por D. bruxellensis. Comparando-se as fermentações realizadas com e sem tratamento ácido, verifica-se que na primeira condição foram obtidos melhores resultados quanto à produção de etanol (aumento de 40-50%), menor teor de ART residual (0,97 a 2,53 g/100mL contra 3,58 a 6,39 g/100mL, respectivamente) e conseqüentemente maior eficiência fermentativa (82% contra 71-76%). Seja pelo controle do crescimento de D. bruxellensis como pelo benefício à levedura do processo, o tratamento ácido em pH 1,5, como utilizado nos experimentos, minimizou o efeito da contaminante.
Quando testada em cultura pura em meio de caldo de cana, a linhagem CCA155 de D. bruxellensis teve uma produção de etanol de 0,63% em 8 ciclos fermentativos de 12 horas sem tratamento do fermento, ou seja muito abaixo dos 5,74% produzidos pela S. cerevisiae nas mesmas condições, demonstrando que essa levedura não seria industrialmente viável para a produção de etanol, nas condições em que esta fermentação é realizada no Brasil. Foi também verificado um alto valor de Brix residual.
Um resultado importante seria seu vigoroso crescimento e alta taxa de viabilidade (97,1%), comprovando mais uma vez a grande adaptação dessas leveduras em ambiente de fermentação (AVANSINI, 2009).
Mesmo a linhagem CCA155 apresentando baixa produção de etanol, foi a cepa com melhor resposta quanto ao teor alcoólico em meio sintético, independentemente da agitação (aeração). Esta linhagem foi isolada da fermentação (vinho), o que poderia explicar sua maior adaptação (crescimento) em condições estressantes com alto teor de álcool.
Deve ser considerado que a linhagem CCA155 apresentou um padrão de resistência ao estresse por baixo pH, mas as demais foram mais sensíveis ao etanol, de forma que na indústria seria interessante utilizar um tratamento combinado de etanol + baixo pH na cuba do fermento, sempre quando se detectar contaminação por D. bruxellensis, porém há necessidade de otimização da concentração de etanol e nível de pH para maximizar a eficiência do controle e minimizar os danos à levedura do processo.
O conhecimento das respostas das leveduras às situações de estresse que ocorrem nas destilarias brasileiras é ainda pouco estudado para as leveduras do processo (AMORIM et al., 2011), sendo um campo ainda mais inexplorado para as leveduras contaminantes.
3 CONCLUSÕES/CONSIDERAÇÕES FINAIS
- As três linhagens de D. bruxellensis estudadas apresentam crescimento invasivo em meio YEPD, sendo esse possivelmente um mecanismo de sobrevivência em condições estressantes;
- O pH e o etanol influenciaram o crescimento das três linhagens estudadas de D. bruxellensis, porém pode ser observada uma variação na resposta das linhagens às situações de estresse (baixo pH e alta concentração de etanol), pois uma linhagem foi mais sensível ao baixo pH (CCA155) enquanto as outras duas (CCA059 e CCA077) foram controladas mais eficientemente pelo etanol. Em condições não estressantes, a linhagem de S. cerevisiae (PE-02) apresentou melhor desenvolvimento, porém em situações de estresse de pH, concentrações de açúcar e etanol as linhagens de D. bruxellensis desenvolveram-se melhor;
- O controle eficiente do crescimento das linhagens de D. bruxellensis poderia ser obtido com um tratamento combinado de baixo pH (1,5) e etanol (9%), porem houve prejuízo significativo também à levedura S. cerevisiae, embora em menor extensão;
- Em sistema de batelada sem reciclo celular em meio sintético, verificou-se que a agitação influenciou significativamente a produção de etanol e de ácidos pelas linhagens de D. bruxellensis, especialmente para a linhagem CCA077, onde observou- se um aumento de 300% no teor alcoólico com agitação dos frascos. A produção de etanol foi significativamente maior quando se utilizou glicose como fonte de carbono ao invés de sacarose, para as linhagens de D. bruxellensis;
- Em sistema de batelada com reciclo celular em meio de caldo de cana, foram obtidos melhores resultados quanto à produção de etanol, menos teor de ART residual e maior eficiência fermentativa quando se utilizou o tratamento ácido do fermento (pH 1,5), assim como melhor controle do crescimento da linhagem CCA155 de D. bruxellensis, quando em cultura mista com S. cerevisiae (PE-02);
- O tratamento ácido realizado em pH 1,5, com agitação de 160 rpm, por 90 minutos, a 30° C, teve efeito provavelmente sobre o crescimento da levedura contaminante mas também beneficiou a levedura do processo, resultando assim na minimização do efeito da contaminante sobre a fermentação conduzida em meio de caldo de sob 10 ciclos fermentativos de 12 horas.
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