Süperoksit Dismutaz (SOD) (EC 1.15.1.1)

Süperoksit dismutaz enzimi özellikle süperoksit radikallerine karşı önemli bir savunma sağlayan antioksidan enzimdir. Antioksidan sistemdeki görevi süperoksit radikalini hidrojen peroksite dönüştürmektir (Eşitlik 17).

O₂• + O₂• + 2H+ → O2 + H2O2 (17)

Aynı zamanda fagosite edilmiş bakterilerin intrasellüler yıkımında da rol almaktadır. SOD’un memelilerde tanımlanan üç izoformu vardır ve bunların genomik yapısı, cDNA ve proteinleri bilinmektedir (Şekil 2.12). Bu üç izoformdan bir tanesi olan SOD1 (Cu- ZnSOD) aktivitesi için bakır ve çinko iyonları gerekmektedir. Hücre içinde sitoplazmada, nükleer içerikte ve memeli hücrelerinin lizozomlarında bulunmaktadır. Dimerik yapıdadır ve siyanidle inhibe olmaktadır. SOD1 genel olarak hücrede en çok bulunan SOD izomeri çeşididir. SOD1 enziminin molekül ağırlığı 32 000 Da’ dur. SOD enzim ailesinde en son keşfedilen SOD izomeri ise SOD3 (Extracellular SOD, EC- SOD) enzimidir. Molekül ağırlığı 135 000 Da ağırlığında ve homotetramer yapıdadır. Heparine karşı yüksek bir afinitesi vardır. SOD3 enzimi ilk olarak insan plazmasında ve serebrospinal sıvıda keşfedilmiştir. SOD enzim izoformu ise hücrede mitokondride yerleşik olan kofaktör olarak mangan iyonunu kullanan SOD2 (MnSOD) enzimidir. Homotetramer yapıda olup 23 000 Da molekül ağırlığındadır (Tablo 2.4) (Zelko ve ark., 2002; Zejnilovic ve ark., 2009).

Tablo 2.4. SOD izozimlerinin özellikleri (Köse, 2011)

SOD Yapısı Metaller Moleküler Ağırlık (kDa) Kromozom

CuZnSOD Homodimer Cu ve Zn 32 21q22

MnSOD Homotetramer Mn 86-88 6q25

Şekil 2.12. Süperoksit Dismutaz gen ailesi (Zelko ve ark., 2002)

SOD1 (Cu-ZnSOD)

SOD1’in gen dizisi belirlenmiş ve türler arasında benzerlik gösterdiği saptanmıştır. SOD1 geni beş ekzon ve dört introndan meydana gelmiştir. SOD1 geni insanlarda kromozom 21 (21q22) de lokalizedir. İnsan, rat ve fare türlerinin proksimal promotor gen bölgelerinde TATA ve CAAT kutuları ve aynı zamanda GC bakımından zengin bölgelerin benzer olduğu gösterilmiştir. SOD1 geninin promotor bölgeleriyle ilgili çalışmalar sonucu NF1, Sp1, AP1, AP2, GRE, HSF ve NF-κB gibi transkripsiyon faktörlerinin bağlanabileceği çeşitli bölgeler bulunmuştur. İnsan SOD1 geninin bazal ve indüklenebilir ekspresyonunda SP1 ve Egr-1 transkripsiyon faktörlerinin rol oynadığı doğrulanmıştır (Zelko ve ark., 2002).

SOD1 enziminin 21.kromozom üzerinde lokalize olması ve trizomi 21’li kişilerin eritrositlerinde SOD aktivitesi ve ekspresyonunun artmış bulunması, bu hastalığın patogenezinde ROT’nin etkili olabileceğini akla getirmektedir. Aynı şekilde Down sendromlu hastalarda SOD1 enzim seviyesinin çok yüksek olduğu gösterilmiştir. Ancak hastalıkla SOD1 enzimin ilişkisi ortaya konamamıştır. Diğer taraftan, SOD1 ile Lou Gehring hastalığı olarak da bilinen amyotrophic lateral sclerosis (ALS) güçlü bir ile ilişki olduğu gösterilmiştir. SOD1 geninde gözlenen 90 farklı mutasyon ile ALS hastalığı arasında sıkı bir ilişki gösterilmiştir. Bu ölümcül hastalık beyin sapı ve

kortikospinal bölgelerde motor nöronların bozulmasına neden olur. SOD1 genindeki mutasyonlar, antioksidan enzim aktivitesini bozabilir ve böylece toksik süperoksit radikal anyonlarının birikmesine yol açabileceği düşünülmektedir (Rosen ve ark., 1993; Taş, 2010). SOD1 protein yapısı Şekil 2.13’de göstgerilmiştir.

Şekil 2.13. SOD1 protein yapısı (Battistini ve ark., 2010)

SOD2 (MnSOD)

SOD2 enzimi mitokondri matriksinde yer alan bir antioksidan enzimdir. Hücre içerisinde metabolizma ve reaktif oksijen türleri oluşumu bakımından hassas bir organel olan mitokondride bulunduğundan dolayı SOD2 enzimi önemlidir. SOD2 geninin yapısı insan, rat ve farelerde tam olarak belirlenmiştir. SOD2 geni de SOD1 geninde olduğu gibi beş ekzon ve dört intron bölgesinden oluşmaktadır. Ancak SOD1 genindeki gibi SOD2 geninin promotor bölgelerinde TATA ve CAAT kutuları bulunmamaktadır. Buna karşın GC bakımından zengin bölgeler mevcuttur. İnsan ve fare genleri NF-κB transkripsiyon faktörüne uygun bölgeler içerir. Aynı zamanda SOD2 geninin promotor bölgesi Sp-1 ve AP-2 konsensüs dizilerinin çoklu kopyasını içermektedir. SOD2 geni 6. kromozom (6q25) üzerinde bulunmaktadır. SOD2 enzimi homotetramerik yapıdadır ve her altbirim 222 aminositten oluşmaktadır (Şekil 2.14). Önce sitoplazmada sinyal sekansı içeren prekürsör bir molekül olarak sentezlenmekte, daha sonra mitokondri içine girerek bu sinyal sekansını kaybetmektedir (Wispe ve ark., 1989).

Şekil 2.14. SOD2 enzim yapısı (Johnson ve Giulivi, 2005)

İnsan SOD2 geninin aminoasit dizisi ile beraber nükleotit dizisi de tam olarak aydınlatılmış olup toplam olarak 1026 baz çiftinden oluşmaktadır. SOD2 enzimi sitoplazmada sinyal dizisi içeren öncül protein olarak sentezlenmekte, ardından mitokondri içine girerek sinyal dizisini kaybetmekte ve aktif halini almaktadır. SOD2 geninde sinyal dizisini kodlayan 47. pozisyonda timin nükleotiti yerine sitozin nükleotitinin (T↔C) geçmesiyle oluşan bir tek nükleotit polimorfizmi (SNP) tespit edilmiştir. SOD2 genindeki bu tek nokta polimorfizmi SOD2 enziminde sinyal dizisine sahip öncü proteininin 16. pozisyonuna denk gelmektedir. Bu tek nokta mutasyonu sonucunda alanin aminoasidi yerine valin aminoasidi gelerek SOD2 enziminin mitokondriyal hedef dizisinde değişikliğe neden olmaktadır. Bu durum ise enzimin mitokondriye yönlendirilmesinde ve dolayısıyla fonksiyonunda, lokalizasyonunda değişikliklere neden olmaktadır. Bundan dolayı bu tek nokta mutasyonuna SOD2 Ala16Val ismi verilmektedir. Bu mutasyonun diğer bir adı ise SOD2 Ala-9Val şeklindedir. Çünkü öncü SOD2 proteininin hedef sinyal dizisi çıkarıldıktan sonra yani olgun (aktif) protein halini aldıktan sonra 16. pozisyon -9. pozisyona denk gelmektedir. Bu tek nokta mutasyonunun referans dizi (RefSeq) kodu ise rs4880 olarak belirlenmiştir (Shimoda-Matsubayashi ve ark., 1996; Soerensen ve ark., 2009).

Alanin içeren sinyal dizisi taşıyan öncül protein alfa heliks yapısında olduğundan mitokondri içerisine kolayca girebilmektedir. Ancak sinyal dizisinde valin aminoasidi taşıyan öncül protein beta tabakalı yapıda olduğundan dolayı mitokondri iç zarı

tarafından engellenme durumu söz konusudur (Şekil 2.15). Bu durum ise mitokondri içerisinde aktif enzim miktarında azalmaya neden olmaktadır (Şekil 2.16). Yapılan çalışmalarda dizisinde valin aminoasidi bulunması halinde enzim düzeyinde %40 azalma meydana geldiği bildirilmiştir (Sutton ve ark., 2003). Cahoi ve ark. (2007)’nın ifadesine göre Ala/Ala genotipli bireylerdeki SOD2 aktivitesi Ala/Val ve Val/Val genotipli bireylere göre daha yüksektir.

Yapılan çalışmaların büyük bir kısmında Ala allelinin, bazı çalışmalarda ise Val allelinin hastalık oluşumunda önemli bir risk faktörü olduğu ileri sürülmektedir. Over kanseri, premenapozal kadınlarda meme kanseri, parkinson hastaları, prostat kanseri, kolon kanseri ve tip I diyabet hastalarında “Ala” allelinin bir risk faktörü olduğu bildirilmektedir. “Val” allelinin ise akciğer kanseri, kalıtsal hemokromatozis gibi hastalıklarda bir risk faktörü olduğu belirtilmektedir. MnSOD Ala-9Val polimorfizminin hastalığın patolojisine etkisinin hastalığın türüne göre değiştiği gözlenmektedir. Örnek olarak hormonların etkili olduğu dokularda gelişen kanser tiplerinde (prostat, over, meme) daha çok Ala allelinin etkili olduğu söylenmektedir.

Yapılan bazı çalışmalarda ise sinyal dizisinde valin içeren öncül MnSOD proteininin mitokondri matriksine tamamen geçemediği için enzim aktivitesinin azaldığı ve yetersiz enzim aktivitesinin hücresel hasara yol açtığı ileri sürülmektedir. Diğer yandan bazı çalışmalarda ise ilginç bir görüş olarak; alanin içeren MnSOD öncül proteininin kolayca mitokondri matriksine girmesinden dolayı, aktivitesinin arttığı fakat bir yandan da özellikle GPX enzim aktivitesinin yeterli olmadığı durumlarda artan hidrojen peroksit oluşumuna bağlı olarak farklı yollar sonucunda hücre hasarına neden olarak kanser riskini artırdığı belirtilmektedir (Küçükergin, 2010).

Şekil 2.15. SOD2 enziminde alanin ve valin aminosidinin enzimin yapısını değiştirmesi (Shimoda-Matsubayashi ve ark., 1996).

Şekil 2.16. SOD2 sentezi, işlenmesi, mitokondriye taşınması, yerleşiminin teorik gösterimi. 1. SOD2’nin ribozomal translasyonu, 2. SOD2’nin posttranslasyonal modifikasyonları, 3. SOD2’nin mitokondriyal hedef sekansı ile sitoplazmadan mitokondriye transferi, 4. Enzim mitokondriye girdikten sonra hedef sekansın ayrılması, 5. Süperoksit radikalinin hidrojen peroksite temizlenmesi, a-SOD2 Ala aminoasit, b- SOD2 enzimi Val aminoasit, c- hedef sekansın ayrılması, d-Olgun enzim reaksiyona hazır hale gelmiştir (Yüce ve ark., 2007)

SOD2 geninde gözlenen diğer bir polimorfizm ise 339. pozisyondaki sitozin ve treonin nükleotitlerinin (C↔T) yer değişiminin neden olduğu, 58. aminoasit kalıntısındaki treonin ile izolösinin yer değişimiyle sonuçlanan Ile58Thr polimorfizmidir. Bu varyant enzimin tetramerik yüzeyleri arasındaki stabiliteyi etkilemekte ve enzim aktivitesinin azalmasına neden olmaktadır. Thr58 formu insan meme kanseri hücre soylarında tümör baskılayıcı kapasitesini azaltmaktadır (Borgstahl ve ark., 1996; Zhang ve ark., 1999). SOD2 geninin promotor bölgesinde üç mutasyon tanımlanmıştır. Bunlar -102 pozisyonundaki C↔T değişimi, -93 pozisyonunda adenin insersiyonu ve -38 pozisyonunda C↔G değişimiyle meydana gelen mutasyonlardır. Bunlardan başka olgun SOD2 proteininin 60. pozisyonunda lösinden fenilalanine değişimiyle sonuçlanan L60F mutasyonu da görülmektedir (St Clair, 2004). SOD2 Ala-9Val polimorfizmi

üzerine yapılan bazı araştırmalarda kontrol gruplarında gözlenen genotip frekansları tablo halinde gösterilmiştir (Tablo 2.5).

Tablo 2.5. SOD2 Ala-9Val polimorfizminin coğrafik bölgelere göre dağılımı

Referans Ülke N Genotip Frekansı (%) ________________ Allel Frekansı (%) ____________ Ala/ Ala Ala/ Val Val/

Val Ala Val ASYA

Cai ve ark., 2004 Çin 1197 1,9 24,2 73,9 14 86

Nakao ve ark., 2007 Japonya 107 0,9 25,2 73,8 13 87

Iguchi ve ark., 2008 Japonya 137 30 43 27 51 49

AVRUPA

Mitrunen ve ark., 2001 Finlandiya 482 20,3 47,9 31,7 44 56 Hung ve ark., 2004 Fransa 214 25,2 53,7 21 52 48 Akyol ve ark., 2005 Türkiye 196 23,5 42,3 34,2 44 56 Arsova ve ark., 2008 Makedonya 151 24,5 48,3 27,2 49 51 Kadıoğlu ve ark., 2010 Türkiye 40 22,5 57,5 20 51 49 Karahalil ve ark., 2011 Türkiye 58 52,6 42,1 5,3 74 26

Köse, 2011 Türkiye 265 22,2 46,4 31,3 45 55

Bizim Çalışmamız Türkiye 100 19 54 27 46 54 KUZEY AMERİKA

Ambrosone ve ark., 1999 Amerika 110 21 56 23 49 51 Tamimi ve ark., 2004 Amerika 1205 24,6 50,8 24,7 50 50 Millikan ve ark., 2004 Amerika 1135 25 52 23 51 49 Li ve ark., 2005 Amerika 764 25,5 49,6 24,9 50 50

SOD3 (EC-SOD)

Ekstrasellüler süperoksit dismutaz (ECSOD/SOD3) hem bakır hem çinko içeren sekretuar bir tetramerik glikoproteindir (Şekil 2.17). EC-SOD plazma, lenf ve sinovial sıvıda bulunarak SOD aktivitesine büyük katkıda bulunur (Folz ve ark., 1994). SOD3 geninin insanda, ratlarda, farelerde ve tavşanlarda cDNA klonları izole edilmiş ve dizi analizleri gerçekleştirilmiştir. Buna göre SOD3 geni SOD1 geni ile %40-60 benzerlik göstermektedir. Ancak SOD2 geni ile benzerlik gözlenmemiştir. Bakır ve çinko içeren homotetramerik bir yapıda olup 4. kromozom üzerinde 4p-q21 bölgesinde yer almaktadır. SOD3 geni promotor bölgesinde TATA ve CAAT kutuları da bulunmamaktadır. SOD3 geninde yalnızca bir polimorfizm tanımlanmıştır. Bu polimorfizm 213. pozisyonda glisinin arjininle yer değiştirmesi sonucu oluşan Arg213Gly olarak adlandırılır. Glisin varyantı SOD3 enziminin plazma konsantrasyonunu 8-15 kat artırmaktadır (Zelko ve ark., 2002).

Şekil 2.17. SOD3 enzim yapısı (Antonyuk ve ark., 2009)