T.C.
GAZİOSMANPAŞA ÜNİVERSİTESİ Bilimsel Araştırma Projeleri Komisyonu
Sonuç Raporu
Proje No: 2012/127 Projenin Başlığı:
BEHÇET HASTALARINDA
BAZI ANTİOKSİDAN ENZİM POLİMORFİZMLERİNİN
DEĞERLENDİRİLMESİ
Proje Yöneticisi
Doç. Dr. İskender PARMAKSIZ Birimi
Fen- Edebiyat Fakültesi/ Moleküler Biyoloji ve Genetik Araştırmacılar ve Birimleri
Prof. Dr. Şemsettin ŞAHİN - Tıp Fakültesi Tıbbi Biyokimya AD. Yrd. Doç. Dr. Hüseyin ORTAK - Tıp Fakültesi Göz Hastalıkları AD.
Öğr. Gör. Dr. İsmail BENLİ - Tıp Fakültesi Tıbbi Biyokimya AD.
T.C.
GAZİOSMANPAŞA ÜNİVERSİTESİ Bilimsel Araştırma Projeleri Komisyonu
Sonuç Raporu
Proje No: 2012/127 Projenin Başlığı:
BEHÇET HASTALARINDA
BAZI ANTİOKSİDAN ENZİM POLİMORFİZMLERİNİN
DEĞERLENDİRİLMESİ
Proje Yöneticisi
Doç. Dr. İskender PARMAKSIZ Birimi
Fen- Edebiyat Fakültesi/ Moleküler Biyoloji ve Genetik Araştırmacılar ve Birimleri
Prof. Dr. Şemsettin ŞAHİN - Tıp Fakültesi Tıbbi Biyokimya AD. Yrd. Doç. Dr. Hüseyin ORTAK - Tıp Fakültesi Göz Hastalıkları AD.
Öğr. Gör. Dr. İsmail BENLİ - Tıp Fakültesi Tıbbi Biyokimya AD.
i ÖZET* Doktora Tezi
BEHÇET HASTALARINDA BAZI ANTİOKSİDAN ENZİM POLİMORFİZMLERİNİN DEĞERLENDİRİLMESİ
İsmail BENLİ
Gaziosmanpaşa Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü
Biyoloji Anabilim Dalı
Danışmanlar: Doç. Dr. İskender PARMAKSIZ Prof. Dr. Şemsettin ŞAHİN
Behçet hastalığı ağız içinde aftlar, genital bölgede yaralar, deri lezyonları ve göz tutulumu gözlenen enflamatuar seyirli kronik bir hastalıktır. Behçet hastalığının nedeni henüz net olarak açıklanamamıştır. Ancak araştırmalarda genetik, çevresel faktörler, enfeksiyonel ajanların neden olduğu immün yanıtlar ve koagulasyon sistemindeki bozukluklar gibi etkenlerin hastalığa neden olduğu ifade edilmektedir. Oksidatif stres Behçet hastalığı ile ilişkisi kurulan nedenlerden birisidir. Bu araştırmada; antioksidan enzimlerden olan SOD2, GPX1 ve PON1 enzimlerini kodlayan genler üzerinde gözlenen ve enzim aktivitelerinde değişikliğe neden olan SOD2 Ala-9Val, GPX1 Pro198Leu, PON1 L55M ve PON1 Q192R polimorfizmlerinin Behçet hastalığının patogenezindeki rolünün incelenmesi amaçlanmıştır. Çalışmanın hasta grubunu 110 Behçet hastası, kontrol grubunu ise 100 sağlıklı birey oluşturmaktadır. Çalışmaya katılan bireylerin tam kan örneklerinden DNA izolasyonu yapılmıştır. Genotipleme Real-Time PCR yöntemi ile hibridizasyon problar kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Çalışma sonunda erime eğrisi analizi yapılarak SOD2 Ala-9Val, GPX1 Pro198Leu, PON1 L55M ve PON1 Q192R polimorfizmleri tespit edilmiştir. Elde edilen verilerle genotip frekansı, allel frekansı ve genotip frekansına göre göreceli risk oranları hesaplanarak hasta ve kontrol grupları istatistiksel olarak karşılaştırılmıştır. SOD2 Ala-9Val, PON1 L55M ve PON1 Q192R polimorfizmlerinde hasta ve kontrol grupları arasında genotip frekansı, allel frekansı ve genotip frekansına göre göreceli risk oranlarında istatistiksel olarak anlam bulunmamıştır. Hasta grubunda GPX1 Pro198Leu polimorfizminde gözlenen Leu allel frekansı kontrol grubuna göre anlamlı şekilde artmıştır (P=0,037, OR=1,52, 95% CI (1,02-2,27)). Aynı zamanda Leu allelini heterozigot veya homozigot olarak taşıyan bireylerde (Pro/Leu+Leu/Leu) Behçet hastalığı için artmış risk tespit edilmiştir (P=0,048, OR=1,75, 95% CI (1,0005–3,06)). Sonuç olarak; Behçet hastalarında ilk defa incelenen GPX1 Pro198Leu polimorfizminin Behçet hastalığı için genetik bir risk faktörü olabileceği gösterilmiştir.
2013, 107 sayfa
Anahtar Kelimeler: Behçet Hastalığı, Polimorfizm, GPX1, SOD2, PON1
* Bu çalışma 2012/127 proje numarasıyla Gaziosmanpaşa Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından desteklenmiştir.
ii
ABSTRACT* Ph.D. Thesis
EVALUATION of SOME ANTIOXIDANT ENZYME POLYMORPHISMS In BEHÇET'S PATIENTS
İsmail BENLİ Gaziosmanpaşa University
Graduate School of Natural and Applied Sciences Deparment of Biology
Supervisors: Assoc. Prof. Dr. İskender PARMAKSIZ Prof. Dr. Şemsettin ŞAHİN
Behçet's disease is a chronic inflammatory disease. It is characterized by oral aphthous ulcers, genital ulcers, skin lesions and ocular involvement. The causes of the Behçet’s disease is not understood yet. The factors like, genetic and environmental factors, immune responses caused by infectious agents and coagulation system disorders can cause the disease has been expressed. The oxidative stress is the one of the reasons that has a relation with Behçet’s disease. SOD2, GPX1 and PON1 are antioxidant enzymes. SOD2 Ala-9Val, GPX1 Pro198Leu, PON1 L55M and PON1 Q192R polymorphisms are located on the genes that coding these enzymes and cause decrease in enzyme activity. In this study, we aimed to investigate the role of these polymorphisms in Behçet’s disease. 110 Behçet patients and 100 healthy control subject were included in this study. DNA was isolated from whole blood samples of individuals who participated in the study. Genotyping was performed Real-Time PCR using hybridization probes. SOD2 Ala-9Val, GPX1 Pro198Leu, PON1 L55M and PON1 Q192R polymorphisms were detected with melting curve analyzing. Genotype frequency, allele frequency and relative ratio of genotype frequency were obtained. Patients and control groups were compared statistically using these findings. No significant difference was found in allel frequency, genotype frequency and relative ratio of genotype frequency of SOD2 Ala-9Val, PON1 L55M and PON1 Q192R polymorphisms between patient and control subjects. A significant difference in the allele frequency of the GPX1 gene was found between patient and control subjects; the frequency of the Leu allele in the patients was significantly higher than in the control subjects (P=0,037, OR=1,52, 95% CI (1,02-2,27)). Increased risk for Behçet's disease was determined in individuals carrying Leu allele heterozygous or homozygous (Pro/Leu+Leu/Leu) (P=0,048, OR=1,75, 95% CI (1,0005–3,06)). As a result; GPX1 Pro198Leu polymorphism that is studied for the first time in Behçet's disease, might be a genetic risk factor for Behçet's disease.
2013, 107 pages
Keywords: Behçet’s Disease, Polymorphism, GPX1, SOD2, PON1
This study was supported by the Gaziosmanpasa University Scientific Research Projects Commission. (Project No: 2012/127).
iii ÖNSÖZ
Bu çalışmada; SOD2, GPX1 ve PON1 enzimlerini kodlayan genler üzerinde gözlenen ve enzim aktivitelerinde değişikliğe neden olan SOD2 Ala-9Val, GPX1 Pro198Leu, PON1 L55M ve PON1 Q192R polimorfizmlerinin Behçet hastalığının patogenezinde rol oynayıp oynamadığının araştırılması amaçlanmıştır. Çalışmaya katkılarından dolayı Gaziosmanpaşa Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Komisyonu’na, Klinik Araştırmalar Etik Kurulu’na, çalışmada emeği geçen herkese teşekkür ederim.
iv İÇİNDEKİLER Sayfa ÖZET i ABSTRACT ii ÖNSÖZ iii SİMGE ve KISALTMALAR DİZİNİ vi ŞEKİLLER DİZİNİ viii TABLOLAR DİZİNİ x 1. GİRİŞ 1 2. GENEL BİLGİLER 3 2.1. Behçet Hastalığı 3 2.1.1. Tanım 3 2.1.2. Epidemiyoloji 3 2.1.3. Etyopatogenez 4 2.1.4. Klinik Bulgular 7 2.1.5. Tanı Kriterleri 12
2.2. Serbest Radikaller ve Reaktif Oksijen Türleri 13
2.2.1. Serbest Radikal Oluşumu 15
2.2.2. Reaktif Oksijen Türleri 20
2.2.3. Serbest radikallerin biyomoleküller üzerine etkileri 27
2.3. Antioksidan Savunma 30
2.3.1. Enzimatik Olmayan Antioksidanlar 31
2.3.2. Antioksidan Enzimler 34
2.3.2.1. Katalaz (EC 1.11.1.6) 34
2.3.2.2. Glutatyon Redüktaz (EC 1.6.4.2) 34
2.3.2.3. Glutatyon-S-Transferaz (EC 2.5.1.18) 34
2.3.2.4. Süperoksit Dismutaz (EC 1.15.1.1) 35
2.3.2.5. Glutatyon peroksidaz (GPX)(EC 1.11.1.9) 42
2.3.2.6. Paraoksonaz (PON) (EC 3.1.8.1) 47
v
Sayfa
3. MATERYAL ve YÖNTEM 59
3.1. Çalışma Grubunun Seçimi 59
3.2. Örneklerin Toplanması ve Saklanması 59
3.3. DNA İzolasyonu 59
3.4. Polimorfizmlerin Tespit Edilmesi 60
3.4.1. SOD2 Ala-9Val Gen Polimorfizminin Tespit Edilmesi 62 3.4.2. GPX1 Pro198Leu Gen Polimorfizminin Tespit Edilmesi 65 3.4.3. PON1 L55M Gen Polimorfizminin Tespit Edilmesi 68 3.4.4. PON1 Q192R Gen Polimorfizminin Tespit Edilmesi 71
3.5. İstatistiksel Analiz 74
4. BULGULAR 75
4.1. Demografik Özellikler 75
4.2. Genotip Frekansları 75
4.3. Genotip Frekanslarına Göre Göreceli Risk Oranları 77
4.4. Allel Frekansları 80
5. TARTIŞMA ve SONUÇ 82
KAYNAKLAR 91
vi
SİMGE ve KISALTMALAR DİZİNİ
HLA : İnsan lökosit antijen
MHC : Majör histokompatibilite kompleksi TNF-α : Tümör nekrozis faktör-α
SOD : Süperoksit dismutaz GPX : Glutatyon peroksidaz CAT : Katalaz
PON : Paraoksonaz HSP : Isı şok protein
IgA : İmmünglobülin A IgG : İmmünglobülin G ROT : Reaktif oksijen türleri MDA : Malondialdehit
NO : Nitrik oksit
GİS : Gastrointestinal sistem RAS : Rekürren aftöz stomatit DNA : Deoksiribonükleik asit
MnSOD : Manganez süperoksit düsmutaz NAD : Nikotinamid adenin dinükleotit NADPH : Nikotinamid adenin dinükleotit fosfat
RA : Romatoit artrit GSH : Glutatyon
NOS : Nitrik oksit sentaz IL : İnterlökin
ONOOH : Peroksinitrit
ALS : Amiyotrofik lateral skleroz SNP : Tek nükleotit polimorfizmi
ECSOD : Ekstrasellüler süperoksid dismutaz GSSG : Okside glutatyon
HDL : Düşük yoğunluklu lipoprotein LDL : Yüksek yoğunluklu lipoprotein
vii
EDTA : Etilen diamin tetra asetikasit PCR : Polimeraz zincir reaksiyonu
FRET : Fluorescence Resonance Energy Transfer pmol : Pikomol ng : Nanogram mL : Mililitre µL : Mikrolitre mM : Milimol °C : Santigrat sn : Saniye
SPSS : Statistical Package for the Social Sciences SLE : Sistemik lupus eritematozus
L : Lösin M : Metiyonin Q : Glutamin R : Arjinin Ala : Alanin Val : Valin Pro : Prolin Leu : Lösin
viii
ŞEKİLLER DİZİNİ
Şekil Sayfa
Şekil 2.1 Reaktif oksijen Türleri 14
Şekil 2.2 Mitokondrial elektron transport zincirinde elektron kaçağı sonucu
süperoksit radikal oluşumu 16
Şekil 2.3 Mikrozomal elektron transport zinciri ile serbest radikal oluşumu 17
Şekil 2.4 Fagositik solunumsal patlama 18
Şekil 2.5 Araşidonik asit metabolizması 19
Şekil 2.6 Serbest radikal hasarı 22
Şekil 2.7 NOS’un aktive edilmesi NO sentezlenmesi 24
Şekil 2.8 Lipit perokisdasyonu 28
Şekil 2.9 Serbest radikallerin DNA üzerine etkileri 29
Şekil 2.10 Oksidatif stres 30
Şekil 2.11 Glutatyonun yapısı 31
Şekil 2.12 Süperoksit Dismutaz gen ailesi 36
Şekil 2.13 SOD1 protein yapısı 37
Şekil 2.14 SOD2 enzim yapısı 38
Şekil 2.15 SOD2 enziminde alanin ve valin aminosidinin enzimin yapısını
değiştirmesi 39
Şekil 2.16 SOD2 sentezi, işlenmesi, mitokondriye taşınması, yerleşiminin
teorik gösterimi. 40
Şekil 2.17 SOD3 enzim yapısı 42
Şekil 2.18 GPX izozimlerinin yapısı 44
Şekil 2.19 PON 1, PON 2 ve PON 3 genlerinin insan 7. kromozomu q21. ve
q22. bantları üzerindeki yerlerinin gösterimi 47
Şekil 2.20 PON1 enzim yapısı 48
Şekil 2.21 Hücre membranında bulunan PON1’in HDL’ye geçişi 49 Şekil 2.22 PON enzim ailesini kodlayan gen bölgesi ve sık gözlenen
mutasyonlar 50
Şekil 2.23 PON1 enzimi promotor bölgesi ve polimorfizmleri 51 Şekil 2.24 PON enzimlerinin dokulara göre fonksiyonları 53
ix
Şekil Sayfa
Şekil 2.25 Oksidatif stresin Behçet hastalığı oluşumuna muhtemel etkilerinin
şematik gösterimi 55
Şekil 3.1 SOD2 Ala-9Val için amplifikasyon eğrisi 64
Şekil 3.2 SOD2 Ala-9Val için erime eğrisi 64
Şekil 3.3 SOD2 Ala-9Val için erime pikleri 64
Şekil 3.4 GPX1 Pro198Leu için amplifikasyon eğrisi 67
Şekil 3.5 GPX1 Pro198Leu için erime eğrisi 67
Şekil 3.6 GPX1 Pro198Leu için erime pikleri 67
Şekil 3.7 PON1 L55M için amplifikasyon eğrisi 70
Şekil 3.8 PON1 L55M için erime eğrisi 70
Şekil 3.9 PON1 L55M için erime pikleri 70
Şekil 3.10 PON1 Q192R için amplifikasyon eğrisi 73
Şekil 3.11 PON1 Q192R için erime eğrisi 73
x
TABLOLAR DİZİNİ
Tablo Sayfa
Tablo 2.1 Eksojen ve endojen olarak serbest radikal oluşumuna neden olan
kaynaklar 14
Tablo 2.2 Serbest radikaller ve neden olduğu reaksiyonlar 26 Tablo 2.3 Biyolojik sistemdeki antioksidan koruma sistemi elemanları 32
Tablo 2.4 SOD izozimlerinin özellikleri 35
Tablo 2.5 SOD2 Ala-9Val polimorfizminin coğrafik bölgelere göre dağılımı 41 Tablo 2.6 GPX izozimlerinin bulunduğu dokular ve özellikleri 43
Tablo 2.7 GPX izozimlerinin görevleri 45
Tablo 2.8 GPX1 Pro198Leu polimorfizminin coğrafik bölgelerde dağılımı 46 Tablo 2.9 PON1 L55M ve Q192R polimorfizmlerinin coğrafik bölgelerde
dağılımı 52
Tablo 2.10 Behçet hastalarında antioksidan enzim aktiviteleri üzerine yapılan çalışmalarda Behçet hastalarındaki enzim aktivitelerinin ve MDA
seviyesinin kontrol grubuna göre durumu 58
Tablo 3.1 SOD2 Ala-9Val gen polimorfizminin tespitinde kullanılan primer
ve prob setinin dizileri 62
Tablo 3.2 SOD2 Ala-9Val gen polimorfizminin tespitinde kullanılan PCR
koşulları 62
Tablo 3.3 SOD2 Ala-9Val gen polimorfizminin tespitinde kullanılan PCR
prosedürü 63
Tablo 3.4 GPX1 Pro198Leu gen polimorfizminin tespitinde kullanılan
primer ve prob setinin dizileri 65
Tablo 3.5 GPX1 Pro198Leu gen polimorfizminin tespitinde kullanılan PCR
koşulları 65
Tablo 3.6 GPX1 Pro198Leu gen polimorfizminin tespitinde kullanılan PCR
prosedürü 66
Tablo 3.7 PON1 L55M gen polimorfizminin tespitinde kullanılan primer ve
xi
Tablo Sayfa
Tablo 3.8 PON1 L55M gen polimorfizminin tespitinde kullanılan PCR
koşulları 68
Tablo 3.9 PON1 L55M gen polimorfizminin tespitinde kullanılan PCR
prosedürü 69
Tablo 3.10 PON1 Q192R gen polimorfizminin tespitinde kullanılan primer
ve prob setinin dizileri 71
Tablo 3.11 PON1 Q192R gen polimorfizminin tespitinde kullanılan PCR
koşulları 71
Tablo 3.12 PON1 Q192R gen polimorfizminin tespitinde kullanılan PCR
prosedürü 72
Tablo 4.1 Kontrol ve Behçet hastalarının demografik özellikleri 75 Tablo 4.2 MnSOD Ala-9Val genotip frekansları 76 Tablo 4.3 GPX1 Pro198Leu genotip frekansları 76
Tablo 4.4 PON1 L55M genotip frekansları 76
Tablo 4.5 PON1 Q192R genotip frekansları 77
Tablo 4.6 MnSOD Ala-9Val Genotip frekanslarına göre göreceli risk
oranları 78
Tablo 4.7 GPX1 Pro198Leu Genotip frekanslarına göre göreceli risk
oranları 78
Tablo 4.8 PON1 L55M Genotip frekanslarına göre göreceli risk oranları 79 Tablo 4.9 PON1 Q192R Genotip frekanslarına göre göreceli risk oranları 79 Tablo 4.10 Mn-SOD Ala-9Val allel frekansları 80
Tablo 4.11 GPX1 Pro198Leu allel frekansları 80
Tablo 4.12 PON1 L55M allel frekansları 81
1. GİRİŞ
Behçet hastalığı ilk kez 1937 yılında Ord. Prof. Dr. Hulusi Behçet tarafından tekrarlayan oral aft, genital ülser ve hipopyonlu iridosiklit içeren üç ana semptomun gözlendiği bir hastalık olarak tanımlanmıştır. Tarihi İpek Yolu'nun geçtiği coğrafik bölgelerde daha sık görülen Behçet hastalığı, neredeyse tüm dünyada gözlenen bir hastalıktır. Hastalığın en sık gözlendiği ülke ise Türkiye olarak bildirilmektedir. Behçet hastalığının etyolojisi ve patogenezi halen tam olarak bilinmemekle birlikte genetik olarak duyarlı bireylerde çevresel faktörlerin tetiklediği yoğun immün-aracılı enflamatuar yanıt sonucu ortaya çıktığı düşünülmektedir (Doğanavşargil ve Keser, 2005; Alpsoy ve Akman, 2007). Behçet hastalığında görülen doku hasarı, nötrofil kaynaklı lizozomal enzimlerin hücre dışı ortama salınmasına ve uyarılan nötrofiller tarafından aşırı serbest radikal üretimi nedeniyle gerçekleştiği düşünülmektedir (Köse ve ark., 2002).
Serbest radikaller üzerinde çok durulan ve sıkça araştırılan bir konudur. Serbest radikal, dış orbitalinde tek sayıda eşlenmemiş elektron bulunan bir atom veya moleküldür. Canlılığın devamının zorunlu bir parçası olan oksijen radikalleri çok sayıda enzimatik reaksiyonun ve biyolojik fonksiyonların gerçekleşmesi için gerekli moleküllerdir (Erden, 1992). Bunun yanında proteinler, lipitler, karbonhidratlar ve nükleik asitler gibi biyomoleküllere ciddi hasarlar vererek çeşitli hastalıkların oluşumuna neden olmaktadır (Diplock, 1998). Serbest radikallerin aşırı üretimini ve bunların meydana getirdiği hasarı önlemek için vücutta birçok savunma mekanizmaları gelişmiştir. Bu savunma mekanizmalarında görevli elemanlar “antioksidanlar’’ olarak bilinirler. Hücrede olağan metabolizma sırasında ya da patolojik etkilerle meydana gelen serbest radikaller ile antioksidan savunma sistemleri arasındaki dengeli ilişkinin serbest radikaller lehine kayması durumunda “oksidatif stres” oluşur. Bu dengenin korunması ve oksidatif hasarın engellenmesi için antioksidan sistemler oldukça önemli rol oynamaktadır (Buga ve ark., 1989; Farber ve ark., 1989).
Oksidatif stres, Behçet hastalığı ile ilişkisi kurulan hastalık etkenlerinden birisidir. Behçet hastalığında ana etken olan enflamasyona reaktif oksijen türlerinin sebep olduğu
bildirilmektedir. Behçet hastalığında reaktif oksijen türlerinin (ROT) miktarındaki artış ile oksidatif stresin doku hasarına neden olduğu ifade edilmektedir (Yazıcı ve ark., 2004). Behçet hastalığının atak dönemlerinde nötrofil immünitesinde ve reaktif oksijen türlerinin (süperoksit radikali, hidrojen peroksit kaynaklı hidroksil radikali ve malondialdehit) üretiminde artış olduğu gösterilmiştir. Behçet hastalarında; süperoksit dismutaz (SOD), glutatyon peroksidaz (GPX), katalaz (CAT) gibi endojen serbest radikalleri temizleyen enzim aktivitelerinde azalma olduğu bilinmektedir (Kökçam ve Nazıroğlu, 2002; Köse ve ark., 2002; Erkılıç ve ark., 2003).
Süperoksit dismutaz enzimi özellikle süperoksit radikallerine karşı önemli bir savunma sağlayan antioksidan enzimdir. Antioksidan sistemdeki görevi süperoksit radikalini hidrojen peroksite dönüştürmektir (Zejnilovic ve ark., 2009). Glutatyon peroksidazlar hidrojen peroksit ve organik hidroperoksitleri su ve oksijene dönüştüren antioksidan enzimlerdir. Hidrojen peroksiti yıkarak lipit peroksidasyonunun başlamasının önlemesinde önemli bir rol oynamaktadırlar (Küçükergin, 2010). Paraoksonaz 1 (PON1) enziminin ilk keşfedilen özelliği toksik organik molekülleri hidroliz etme aktivitesi olduğundan dolayı toksikolojik bir enzim olarak değerlendirilmiştir. Ancak antiaterojenik, antienflamatuvar ve antioksidan etkilerinin belirlenmesiyle son yıllarda güncellik kazanmıştır (Anıl, 2009).
Bu çalışmadaki amacımız; SOD2, GPX1 ve PON1 enzimlerini kodlayan genler üzerinde gözlenen ve enzim aktivitelerinde değişikliğe neden olan SOD2 Ala-9Val, GPX1 Pro198Leu, PON1 L55M ve PON1 Q192R polimorfizmlerinin Behçet hastalığının patogenezinde rol oynayıp oynamadığını araştırmaktır.
2. GENEL BİLGİLER
2.1. Behçet Hastalığı
2.1.1. Tanım
Behçet hastalığı ilk olarak hastalığa ismini veren Prof. Dr. Hulusi Behçet tarafından 1937 yılında tanımlanmıştır (Behçet, 1937). Behçet hastalığı ağız içinde aftlar, genital bölgede yaralar, deri lezyonları ve göz tutumu gözlenen enflamatuar seyirli kronik bir hastalık olup nedeni tam olarak anlaşılamamıştır (Ohno ve ark., 1982). Bu belirtilere ek olarak eklem, santral sinir sistemi, akciğer, gastrointestinal sistem (GİS) ve böbrek gibi birçok organı tutabilen multisistemik bir hastalık olduğu bilinmektedir (Scully ve ark., 1998; Jorizzo, 1993).
2.1.2. Epidemiyoloji
Dünyanın çeşitli bölgelerinde görülmektedir ancak tarihi ipek yolu üzerindeki Akdeniz ülkelerinde daha sık gözlenmektedir (Ohno ve ark., 1982). Kuzey Avrupa ve Amerika’da daha az gözlenirken Türkiye, Çin, Kore, İran, Tunus gibi Akdeniz ülkelerinde daha sık olduğu bilinmektedir (Yurdakul, 1997; Pamuk ve Çakır, 2005). Japonya’da 15 / 100 000 oranında görülmekte iken Türkiye’de 370 / 100 000 gibi yüksek bir orandadır (Ohno ve ark., 1986; Moutsopoulus, 1991). Behçet hastalığının dağılımının en yaygın olduğu ülke Türkiye’dir (Önder ve Gürer, 2007).
Türkiye’de yapılan çalışmalara bakıldığında hastalığın görülme oranı Fatsa’da 31 / 10 000, Silivri’de 8 / 10 000, İstanbul’da 42 / 10 000, Ankara’da 11 / 10 000 olarak bulunmuştur ( Pamuk ve Çakır, 2005).
Erkek ve kadınlar arasındaki dağılıma bakıldığında hastalığın görülme sıklığı erkeklerde kadınlara göre 3/2 oranda daha yüksektir (Önder ve Gürer, 2001). Ancak bu oranı 1,03 olarak belirten çalışmalar mevcuttur (Tursen ve ark., 2003). Almanya, Kore, Amerika
ve Japonya’da yapılan çalışmalarda ise kadınlar arasındaki prevalansın daha yüksek olduğu bildirilmektedir. Ancak son yıllardaki çalışmalar kadınlar ve erkekler arasındaki dağılımın benzer oranda olduğu gözlenmektedir (Zouboulis, 1999).
Behçet hastası erkeklerde mortalite ve mobiditenin kadınlara göre daha fazla, eritema nodozumun ise kadınlarda erkeklerde daha fazla olduğu belirtilerek cinsiyetin aynı zamanda hastalığın klinik bulgularını ve prognozunu etkileyen bir neden olduğu söylenmektedir (Kural-Seyahi ve ark., 2003; Marshall, 2004). Kore’de yapılan bir çalışmada da hastalığın erkeklerde daha ağır seyrettiği ifade edilmiştir ( Bang ve ark., 2003). Bu bulguları destekleyici şekilde kadınlarda genital ülser ve eritema nodozum, erkeklerde ise püstüler lezyon, oküler bulgular ve vasküler lezyonların daha fazla geliştiğini destekleyen yayınlar bulunmaktadır (Davatchi ve ark., 2003; Bang ve ark., 2003).
Behçet hastalığının tanı konulma yaşı Asya ülkelerinde 30 yaşın üstünde, Türkiye gibi Akdeniz ülkelerinde 30 yaşın altındadır. Hastalığın ileri yaşlarda başlama durumu ise seyrektir (Pamuk ve Çakır, 2005). Hastalığın başlama yaşı Japonya’da 35,7 iken Türkiye’de ise 23,3 olarak bildirilmiştir (Önder ve Gürer, 2007).
2.1.3. Etyopatogenez
Behçet hastalığının nedeni şimdiye kadar net olarak açıklanamamıştır (Zouboulis, 2003). Araştırmalarda genetik, çevresel etkenler, enfeksiyonel ajanların neden olduğu immün yanıtlar, oksidatif dengede bozukluk, koagulasyon sistemindeki bozukluklar gibi etkenlerin hastalığa neden olduğu ifade edilmektedir (Doğanavşargil ve Keser, 1999).
Genetik
Behçet hastalığının belirli coğrafik bölgelerde sık gözlenmesi, yakın akrabalarda birden çok hastanın gözlenmesi genetik etkenlerin hastalıkta rol aldığı görüşünü güçlendirmektedir (Doğanavşargil ve Keser, 2005). Behçet hastası olan kişilerin kardeşleri üzerinde yapılan bir çalışmada kardeşi Behçet hastası olan kişilerde hastalığın
ortaya çıkma riskinin genel topluma göre yüksek çıkması da bu görüşü desteklemektedir ( Gül ve ark., 2000).
Yapılan araştırmalarda dikkat çeken bir husus HLA-B51 antijeni ile Behçet hastalığı arasındaki ilişkidir. Behçet hastalığı ve HLA-B51 antijeninin bölgesel prevelansı birbiriyle örtüşmektedir ve ayrıca Behçet hastalarında HLA-B51 antijeni görülme oranı % 50-80 gibi yüksek bir orandadır (Yazıcı ve ark., 1980, 1983). Tunus’da yapılan bir çalışmada normal bireylerde %25,5 olarak bulunan HLA-B51 oranı Behçet hastalarında %54 olarak bulunmuştur (Houman ve ark., 2007). HLA-B51’in Behçet hastalığı için doğrudan ya da dolaylı olarak bir etken olduğu netlik kazanmamıştır. Doğrudan ya da dolaylı olarak hastalığa yol açtığına dair görüşler mevcuttur. HLA-B51 geninin hastalığı doğrudan etkilediğine dair görüş immün sistemin etkileyici ve düzenleyici hücrelerine belli antijen grubunu sağlayarak ya da sağlamayarak gerçekleştirdiğidir. Dolaylı yoldan hastalığı etkilediğine dair görüş ise dengesiz bağlantılı (linkage disequilibrium) olduğu başka bir gen ile taşınarak hastalığa neden olabileceğidir (Fresko, 1997; Türsen ve Gürler, 2000).
HLA-B51 geninin hastalığın seyrine ve şiddetine etki ettiğine dair görüşlerde ileri sürülmektedir. HLA-B51 geni taşıyan hastalarda hastalığın daha ağır seyrettiği ve üveitin daha sık görüldüğünü ifade eden yayınlar mevcuttur (Fresko, 1997; Türsen ve Gürler, 2000). HLA-B51 geninin erkeklerde daha fazla gözlendiği, hastalığın erken yaşta başlamasına neden olduğu, eritema nodozum ve üveit riskini artırdığını ileri süren çalışmalar vardır (Koumantaki ve ark., 1998). Diğer bir çalışmada ise bu antijeni bulunduran Behçet hastalarında tromboz ve körlüğe kadar varan üveit vakaları belirtilmiştir (Zoubolis ve ark., 1993). Göz ve nörolojik tutulumu olan Behçet hastalarının çoğunda HLA-B51 pozitifliği bulunan çalışmalar mevcuttur (Lehner ve ark., 1979). Ailevi vakalar Behçet hastalarında %4-17 arasında dağılım göstermesine karşın klasik mendelian tipi kalıtım tespit edilememiştir (Türsen ve Gürler, 2000).
HLA (Human Leukocyte Antigen) ismiyle de bilinen Majör Histokompatibilite Kompleksi (MHC) 6. Kromozomun kısa kolunda yer alır ve antijenlerin immünolojik yönden tanınması ve immün sistemde görev yapan moleküllerin tanınmasını sağlayarak
T hücrelerine antijen sunmakla görevlidir (Alpsoy ve ark., 1998). HLA-B51 antijeninin periferik kan nötrofil hücrelerinin fazla miktarda proenflamatuar sitokin üretimini otokrin kontrol edebildiği ve HLA-51 pozitif olan transgenik farelerin nötrofil hücrelerinden süperoksit ve oksidatif ürünlerin fazla miktarda üretildiği gösterilmiştir (Takeno ve ark., 1993). Proenflamatuar sitokinlerden olan tümör nekrozis faktör-α (TNF-α) geninde promotor bölgedeki polimorfizmler ile Behçet hastalığı arasında ilişki gösteren çalışmalar da mevcuttur (Krause ve Weinberger, 2008)
Çevresel ve Enfeksiyonel Faktörler
Bakteri ve virüslerin Behçet hastalığının oluşmasında ajan olarak rol oynadığı bildirilmektedir. Bu ajanlar arasından bazıları herpes simpleks tip I virüsü, çeşitli streptokoklar (S. Pyogenes, S. Oralis, S. Faecalis, S. Salivarus), hepatit A, B, C, E virüsleri, helikobakter pilori gibi antijenik yapıları benzer olan bakteri ve virüslerdir (Chang ve ark., 2001; İlknur ve ark., 2006). Araştırmalarda bu ajanların Behçet hastalığıyla ilişkisi gösterilmesine rağmen hastalığın kesin sebebi olarak gösterilememiştir (Yıldırım ve ark., 2009). Bakteri veya virüslerin hastalığa direkt olarak değil, antijenlerinin neden olduğu bir immün bozukluk ile hastalığa yol açabileceği şu anki ortak görüşü ifade eder (Bayvot, 2004).
Behçet hastalığına neden olabilecek faktörlerden bir diğeri de ısı şok proteinleridir. Isı şok proteinleri (HSP) prokaryotik ve ökaryotik hücrelerde stres şartlarında sentez edilen immün reaktif proteinlerdir. Oral mukoza antijenleriyle yukarıda bahsedilen virüs ve bakteriler arasında çapraz reaksiyon tespit edilmesi bu organizmalarda ortak olarak bulunan 65 kd ısı şok proteinlerinin hastalığa neden olabileceği fikrinin ortaya atılmasına neden olmuştur. Behçet hastalarında yapılan çalışmalarda 65 kd ısı şok proteinlerine karşı immünglobülin G (IgG) ve immünglobülin (IgA) antikorlarının üretildiği gösterilmiştir (Bayvot, 2004). Aynı şekilde eritama nodozum ve mukokutanöz ülser bulunan Behçet hastalarının aktif deri lezyonlarında yukarda bahsedilen bakterilerde bulunan 65 kd ısı şok proteinlerine yapısal olarak çok benzeyen 60 kd ısı şok proteinlerinin fazla miktarda sentezlendiği tespit edilmiştir (Ergun ve ark., 2001).
Oksidatif Stres
Oksidatif stres Behçet hastalığı ile ilişkisi kurulan nedenlerden birisidir. Behçet hastalığında ana etken olan enflamasyona reaktif oksijen türlerinin (ROT) sebep olduğu bildirilmektedir. Behçet hastalığında ROT miktarındaki artış ile oksidatif stresin doku hasarına neden olduğu ifade edilmektedir (Yazıcı ve ark., 2004). Hastalığın aktif dönemlerinde nötrofil aracılı immün cevap ve ROT miktarında artış görülmektedir. Süperoksit radikali, hidroksil radikali ve malondialdehit (MDA) üretiminin hastalığın şiddetlendiği dönemlerde artışı tespit edilmiştir. Bu durum aktif dönem Behçet hastalarının inaktif hastalara göre oksidatif strese daha fazla maruz kaldığını göstermektedir (Evereklioğlu, 2005). SOD, GPX ve CAT gibi antioksidan enzimlerin Behçet hastalarında azaldığı bilinmektedir. Ayrıca nitrik oksit’in (NO) Behçet hastalarında endotel doku hasarına neden olarak hastalık patogenezinde rol oynadığı ifade edilmektedir (Kiraz ve ark., 2001). Behçet hastalarında antioksidan sistemde önemli rol oynayan glutatyon, vitamin A, vitamin E ve betakaroten miktarının da azaldığı bildirilmiştir (Karaca ve Güder, 2009).
2.1.4. Klinik Bulgular
Oral ve genital ülserler, deri, göz, eklem tutulumları hastalığın en sık görülen bulgularındandır. Bunun yanında GİS, damar, kardiyovasküler, pulmoner tutulumlarda gözlenmektedir.
Oral Aft
En sık gözlenen oral aft bulgusu çoğu zaman hastalığın ilk olarak bulgusu olarak rastlanır ve diğer bulgular gözlenmeden tek belirti olarak gözlenebilir. Ancak %1-3 oranında oral aftlar olmadan da diğer bulgulara rastlanabildiği bilinmektedir. Genellikle dil, dudak, gingiva ve yanak mukozasında gözlenirler (Yazıcı ve ark., 2002). Oral ülserlerin major, minor ve herpetiform şeklinde 3 formu bulunmaktadır. Bu formlardan minör form klinik olarak oral ülserlerin toplamda %90’ını oluştururlar. Behçet hastalığında oral ülserlerin rekürren aftöz stomatitten (RAS) ayırt edilmeleri zor
olmaktadır. Ancak klinik olarak oral ülserlerin daha fazla sayıda olması ve lezyon çaplarının farklı olmasından dolayı RAS’dan ayırt edilmesi mümkündür (Aktan ve İlknur, 2007). İdiyopatik RAS tanısı alan hastaların %2,8 oranında Behçet hastası olduğu ve bu hastaların uzun zamanlı takibinde %52,2’sinin Behçet hastalığı geliştiğini ifade eden çalışmalar vardır (Kim ve LeBoit, 2000; Alpsoy, 2003). Oral ülserler için tetikleyici faktör genelde diş çekimi ve cerrahi girişimler sonucu oluşan travmadır. Lezyonlar bu travma bölgelerinde gözlenmektedir. Bunun yanında stres, hormonsal değişimler, viral enfeksiyonlar ve beslenme bozuklukları oral ülserleri tetikleyebilir (Gürler, 1997; Marshall, 2004).
Genital Ülser
Behçet hastalığında sık görülen bulgulardan biri olan genital ülserler oral aftlara morfolojik olarak benzerlik gösterirler ancak daha geniş ve derin olmakla birlikte oral aftlara göre daha seyrek görünür ve zor iyileşirler (Yazıcı ve ark., 2002; Marshall, 2004). Genital ülserler kadınlarda belirtisiz seyredebilirken, erkeklerde genelde ağrılıdır, bununla beraber fiziksel aktivitelerde zorlanmaya neden olabilir (Kalaycıyan ve Arzuhal, 2005). Erkeklerde skrotum alt ve yan yüzeylerinde %90 oranında lokalize olmakla birlikte nadiren glans ve korpus peniste gözlenebilmektedir. Kadınlarda ise genelde labium majör ve minörde gözlenmektedir. Nadiren de vajinal ve servikal lezyonlara rastlanmaktadır. Derin ülserlerde mesane, üretra ve rektumda gözlendiği de bilinmektedir (Ghate ve Jorizzo, 1999). Genital lezyonlar herhangi bir tedavi uygulanmaksızın 3-6 hafta içerisinde kendiliğinden gerilemektedir (Tüzün ve ark., 2008).
Deri Bulguları
Behçet hastalığının %80 oranında deri bulguları gözlenmektedir. Eritema nodozum lezyonları ve papulopüstüler lezyonlar bu deri bulgularının içerisinde en sık görülenleridir. Bunların yanında yüzeyel tromboflebit ekstragenital ülser paterji reaksiyonu diğer belirtilere örnek olarak verilebilir (Alpsoy, 2003).
Papülopüstüler lezyonlar Behçet hastalığında %28-66 oranında görülmekte olup en sık gözlenen deri bulgularından biridir. Papül şeklinde başlayıp 24-48 saat içerisinde püstül halini alarak vücudun gövde, alt ekstremiteler ve yüz bölgesinde yerleşirler. Folikülit veya akne şeklinde steril püstüller şeklindedir (Arca ve Gür, 2003).
Eritema nodozum benzeri lezyonlar ise çoğunlukla alt ekstremitelerde nadiren de yüz, ense veya kalça bölgelerinde gözlenen ağrılı deri altı lezyonlarıdır. Behçet hastalarının %15-78’inde görülüp kadınlarda daha fazla gözlenmektedir. Yuvarlak ya da oval fındık ve ceviz büyüklüğünde kırmızı renkli ağrılı akut gelişen lezyonlardır. Sıklıkla tekrarlanır ve 2-3 hafta içerisinde iyileşirler (Arca ve Gür, 2003).
Behçet hastalığında sık görülen vasküler tutulumun en sık gözlenen damar tutulum şekli %47,3 oranla yüzeyel tromboflebittir. Eritema nodozum ile genellikle karıştırılabilir. Yüzeyel tromboflebitli hastaların lezyonları hassas ve doğrusal bir dizilim gösteren derialtı nodüller şeklindedir. Vena safena magna en sık tutulan vendir ve nodüller genellikle tek taraflıdır (Tüzün ve ark., 2008). Erkek hastalarda daha sık gözlendiği bilinmektedir (Alpsoy, 2003).
Behçet hastalığında nadir görülen deri bulgularından ekstra genital ülserin görülme oranı %3’tür. Ekstra genital ülserler inguinal, perianal, rektal, aksiller, servikal, ayak parmak araları ve meme gibi yerlerde gözlenir. Keskin sınırlı, ödemli, çevresi eritemli ve sarı renkte ülserlerdir. Behçet hastalığının en spesifik lezyonlarındandır (Kalaycıyan ve Arzuhal, 2005; Aktan ve İlknur, 2007).
Paterji testi Behçet hastalığının aktif döneminde %50-80 oranında pozitif sonuç verir ve özgünlüğü oldukça yüksektir (Ergün ve ark., 2001). Bu test hastanın önkoluna steril iğne kullanılarak 45 derecelik açıyla 5 mm batırılarak yapılır. İğne batırılan bölgede 24-48 saatte görülen 2 mm’den büyük kızarık püstül pozitif sonuç olarak değerlendirilir. Oluşan püstül 4-5 günde kaybolur. Testin özgünlüğü yüksektir ancak duyarlılığı tartışmalıdır. Özgünlüğünün yüksek olmasından dolayı Uluslar Arası Behçet Hastalığı Çalışma Grubunun tanı kriterlerine dahil edilmiştir (Sharqote ve ark., 2002; Doğanavşargil ve Keser, 2005).
Göz Tutulumu
Behçet hastalığında sık görülen bulgulardan göz tutulumunun hastalıkta görülme sıklığı %70-85 oranındadır (Ghate ve Jorizzo, 1999). Göz tutulumu olan olguların %10-20’si körlükle sonuçlanmaktadır (Yurdakul ve ark., 1994). Erkek hastalarda daha sık gözlenen göz tutulumu bulgusunun seyri kadınlarda daha iyidir (Tursen ve ark., 2003). %20 oranında Behçet hastalığının ilk belirtisi olarak gözlenebilir (Kural-Seyahi ve ark., 2003). HLA-B5 ve paterji testi pozitif olan hastalarda göz tutulumu daha fazla görülmektedir (Atmaca ve Sönmez, 2004). Göz tutulumunun Japonya, Türkiye ve İran’da daha fazla ve şiddetli izlendiği ifade edilmektedir (Davatchi ve ark., 2005). Hastalığında başında tek taraflı tutulum gözlense de genellikle çift taraflı tutulum gözlenmektedir (Marshall, 2004). Hastalığın başında ön üvea bölgesini etkileyen tutulum zamanla iki taraflı kronik olarak tekerrür eden posterior ya da pan üveit şeklinde gelişmektedir. Ülkemizde yapılan geniş çaplı bir araştırma sonucuna göre pan üveit %60,2, arka üveit %28,8 oranında ve ön üveit %11,7 oranında tespit edilmiştir (Tugal-Tutkun ve ark., 2004).
Eklem Tutulumu
Behçet hastalığında eklem tutulumu oranı %50-90 oranındadır Eklem bölgesinin hassasiyetinde artma, şişlik, eklem hareketlerinde azalma, sabah tutukluğu ve kızarıklık gözlenen bulgulardandır (Evereklioğlu, 2005). 3 gün ile 4 hafta süren oligoartrit şeklinde gözlenmekle birlikte en sık tutulan eklemler diz, ayak bileği, el bileği ve dirsektir (Yurdakul ve ark., 1994; Önder ve Gürer, 2001).
Nörolojik Tutulum
Behçet hastalarının %5-10 kadarında nörolojik tutulum görülür (Marshall, 2004). Ülkemizde bu oran %5,3-7,6 olarak bilinmektedir (Saylan ve ark., 1999). Hastalığın ilk belirtilerinde sonra 1-7 yıl arasında baş ağrısı, ateş kusma şeklinde ortaya çıkmaya başlar. Gülme, ağlama, yutmada zorluk gibi beyin sapı etkilenmesini gösteren belirtiler ve duyu organ bütünlüğüne dair belirtiler de görülebilmektedir (Doğanavşargil ve
Keser, 1999). Hastalığın erken dönemlerinde nörolojik belirtiler olmadan spinal sıvıda lenfosit ve protein artışı gözlenebilmektedir. Ayrıca migren benzeri baş ağrıları da fazlaca görülen belirtilerdendir. Bağ ağrısı çeken Behçet hastalarında %20 oranında nörolojik tutulum gözlenen çalışmalar mevcuttur ( Özkan, 2007).
Vasküler Tutulum
Vasküler tutulum oranı Behçet hastalığında %7-40 oranında görülmektedir (Gül ve ark.,2008). Hastalığın ilk beş yılında kendini göstermektedir (Doğanavşargil ve Keser, 2005). Venler arterlere oranla daha fazla tutulum göstermektedir. Yüzeyel tromboflebit tutulumun en çok rastlanan bulgusudur. Alt ektremitelerde safen ven en çok tutulum gösteren bölgedir (Koç ve ark., 1992). Arterlerde tutulum oranı %1-3,5 arasındadır ve anevrizma oklüzyona göre daha fazla izlenmektedir. Pulmoner arter anevrizmasına neden olan tek vaskülit nedeni Behçet hastalığıdır (Özkan, 2007).
GİS Tutulumu
GİS tutulumunun Türkiye’deki Behçet hastalarında görülme oranı %1,4-2,8 olarak bilinmektedir. Japonya’da ise bu oran %60 gibi daha yüksek seyreder (Marshall, 2004; Borlu ve ark., 2006). Ağız ve anüs arasında herhangi bir bölgede tutulum gözlenebilir. En fazla gözlenen bölgeler ise iloçekal bölge ve kalın bağırsaktır. GİS tutulumuna bağlı şikayetler şiddetli ağrı, karın bölgesinde gerginlik, ishal, kusma, bulantı gibi bulgulardır (Zouboulis ve ark., 1997).
Diğer Sistemik Tutulumlar
Behçet hastalığında önceden bahsi geçen sistemik tutulumların yanında daha nadir görülenlerine örnek olarak pulmoner, renal, epididimit, kardiyak tutulumları da gözlenebilmektedir. Bunlardan pulmoner tutulum oranı ülkemizde yapılan bir çalışmada %1,1 oranında gözlenmiştir (Saylan ve ark., 1999). Pulmoner damarlardaki tutulum ile pulmoner arter anevrizma, akciğerde parankimal değişimler, plörezi ve fibrozis
gözlemlenebilir (Önder ve Gürer, 2001; Doğanavşargil ve Keser, 2005). Ender olarak gözlenen renal tutulum bulguları genellikle hematüri, proteinüri ve amiloidoz şeklindedir (Özkan, 2007). 1-2 hafta süren akut ağrılı epididimit tutulumu tekrarlayıcı özelliktedir (Doğanavşargil ve Keser, 1999). Kardiyak tutulumu ise kendini endokardit, miyokardit, perikardit, kalp yetmezliği, zaman zamanda koroner arter tutulumuna bağlı olarak miyokard enfarktüsü ile kendini göstermektedir (Sharqote ve ark., 2002).
2.1.5. Tanı Kriterleri
Özgün laboratuar bulgularının olmayışı nedeniyle Behçet hastalığı tanısı klinik bulgularla konulmaktadır. Uluslararası Behçet Hastalığı Çalışma Grubu’nun 1990 yılında belirlediği tanı kriterleri günümüzde hastalığa tanı konulmasında kullanılmaktadır.
Uluslararası Behçet Hastalığı Çalışma Grubu Tanı Kriterleri:
Tekrarlayan oral ülserler: Doktor veya hasta tarafından gözlenen, 12 aylık süre boyunca en az 3 kez tekrarlayan minör, major veya herpetiform aft bulgusu
Tekrarlayan genital ülserler: Doktor veya hasta tarafından gözlenen genital ülserasyon veya skatris bulgusu
Göz lezyonları: Göz doktorunun saptadığı anterior üveit, posterior üveit, panüveit, retinal vaskülit veya biyomikroskopik muayenede vitreusta hücre bulgusu
Deri lezyonları: Doktor veya hasta tarafından gözlenen eritema nodozum benzeri lezyonlar, kortikosteroid tedavisi almayan puberte sonrası hastalarda doktor tarafından gözlenen akneiform papülopüstüler, psödofolikülit veya nodüler lezyonlar
Pozitif paterji testi: Önkolun steril enjektörle delinmesinden sonraki 24. ve 48. saatte doktor tarafından testin pozitif yorumlanması
Uluslar arası Behçet Hastalığı Çalışma Grubu’na göre tekrarlayan oral ülserlerin yanında yukarıda belirtilen bulgulardan en az ikisinin hastada olması gerekmektedir (ISGBD, 1990).
2.2. Serbest Radikaller ve Reaktif Oksijen Türleri
Serbest radikaller en dıştaki atomun yörüngesinde bir veya birden fazla çift oluşturmamış elektron içeren yüksek enerjili, dengeli olmayan moleküllerdir. Çiftlenmemiş elektronlar, serbest radikallere büyük bir reaktiflik kazandırarak protein, lipit, DNA ve nükleotit koenzimler gibi birçok biyolojik maddeye zarar vermelerine sebep olmaktadır (Diplock, 1998). Serbest radikal oluşumu endojen ve çevresel faktörlerin etkisiyle oluşabilir (Tablo 2.1) Elektron transfer sistemi, bazı enzim reaksiyonları sonrası, otooksidasyon gibi faktörler endojen kaynaklara örnek olarak verilebilir (Greene ve Paller, 1991). Çevresel faktörlere ise hava kirliliği, ultraviyole ışınlar, iyonize radyasyon ve ksenobiyotikler örnek olarak verilebilir (Young ve Woodside, 2001).
Serbest radikallerin zararlı etkilerinin yanında vücuttaki bazı doğal mekanizmalar için gerekli olduğu da bilinmektedir. Örneğin damar gerginliğinin düzenlenmesi, oksijen basıncının değerlendirilmesi, oksijen yoğunluğu ile kontrol edilen mekanizmaların düzenlenmesi, düşük konsantrasyonlarda hastalık etkenine karşı hücresel cevap verilmesi bunlardan bazılarıdır (Dröge, 2002; Valko ve ark., 2006).
Hücrelerde moleküler oksijenin çoğu enzimatik işlemlerle suya dönüştürülürken geriye kalan küçük bir kısmı ise diğer moleküllerden elektron alarak indirgenir ve stabil olmayan oksijen türevleri oluşur (Şekil 2.1). Bunlara reaktif oksijen türleri (ROT) denir (Barber ve Harris, 1994). Başlıca ROT türleri süperoksit radikali (O2•), hidrojen peroksit (H2O2) ve hidroksil radikali (HO•)’dir.
Tablo 2.1. Eksojen ve endojen olarak serbest radikal oluşumuna neden olan kaynaklar (Kuran, 2008)
Eksojen Kaynaklar Endojen Kaynaklar
Antibiyotikler Mitokondrial taşınma
Anestetikler Mikrozomal sistem
Sigara dumanı Plazma zarları
İskemi Fagositoz olayı
Hipoksi Peroksizomlar
İnflamasyon Çesitli sitozolik enzimler
Antineoplastik ajanlar
Hava kirliligi
Radyasyon
2.2.1. Serbest Radikal Oluşumu
Serbest radikaller bağın yapısına giren iki elektrondan herbirinin bir atom üzerinde kalmasıyla yani bağın homolitik kırılmasıyla veya elektron transfer reaksiyonları sonucu oluşurlar (Akpoyraz ve Durak, 1995).
Kovalent bağ taşıyan bir molekülün homolitik yıkılımı sonucu bölündükten sonra bölünen her bir parçada ortak elektronlardan birisinin kalmasıyla serbest radikal oluşabilir (Eşitlik 1).
X:Y → X• + Y• (1)
Normal bir moleküle bir elektron ilavesiyle serbest radikal oluşabilir (Eşitlik 2).
X + e- → X• (2)
İnsan metabolizmasında yukarıdaki reaksiyon türlerinden herhangi birisiyle serbest radikal üretimi gerçekleşebilir. Bunlardan bazıları şöyledir;
Mitokondriyal elektron transport zinciri
Normal elektron akışı sonucu oluşan son ürün sudur (Eşitlik 3).
O2 + 4H+ + 4e- → 2H2O (3)
Ancak elektron transport zincirinden kaçan elektronların moleküler oksijen ile doğrudan reaksiyona girmesi sonucu süperoksit radikali oluşmaktadır (Eşitlik 4).
O2 + e- → O2-• (4)
Mitokondride gerçekleşen elektron transport zincirinde akan elektronların yaklaşık %1-2’si süperoksit radikali oluşumuna sebep olur (Şekil 2.2). Mitokondride bulunan MnSOD enziminin aktivitesi sonucu süperoksit radikali düzeyi dengede tutulur (Peiter, 1995).
Şekil 2.2. Mitokondrial elektron transport zincirinde elektron kaçağı sonucu süperoksit radikal oluşumu (Altınışık, 2001)
Mikrozomal elektron transport zinciri
Endoplazmik retikulumda endojen maddelerin ve özellikle ksenobiyotiklerin metabolizması sonucu yan ürün olarak serbest radikal oluşmaktadır. Ksenobiyotiklerin mikrozomal sitokrom P450 ile reaksiyonuyla moleküllerden bir elektron çıkarılır ya da bir elektron eklenir. Sonuçta serbest radikal oluşur (Şekil 2.3).
Şekil 2.3. Mikrozomal elektron transport zinciri ile serbest radikal oluşumu (Altınışık,2001)
Oksidaz enzimlerinin reaksiyonları
Amino oksidaz, sitokrom oksidaz, monoamin oksidazlar ve ksantin oksidaz serbest radikal oluşumuna neden olan oksidaz enzimleridir. Bunlardan özellikle ksantin oksidaz önemlidir. Ksantin oksidaz hasarlanmamış dokularda bir dehidrojenaz olarak vardır, pürinlerin yıkılım yolunda hipoksantinden ksantin ve ksantinden ürik asit oluşumu basamaklarında elektron akseptörü olarak moleküler oksijenden daha çok NAD+
kullanır. Oksijensizliğe bağlı olarak ADP'nin ATP'ye fosforilasyonunun azaldığı durumlarda yani iskemi durumunda ADP yıkılır ve pürin bazı, ksantin oksidazın bir oksidaz olarak etkili olmasıyla hipoksantine dönüştürülür. Ksantin oksidazın oksidaz olarak aktivite göstermesi durumunda hipoksantin ksantine ve ksantin ürik aside dönüşürken moleküler oksijen kullanılmakta, moleküler oksijen hidrojen perokside indirgenmektedir. İskemi durumlarında oksijen seviyesi düşük olduğundan önemli hasar olmaz. Ancak oksijen seviyesi reperfüzyon sırasında normale dönünce iskemi yerinde ksantin oksidaz etkisiyle fazla miktarda hidrojen peroksit ve süperoksit radikali oluşur. Bunların etkisiyle de iskemi/reperfüzyon hasarı ortaya çıkar (Altınışık, 2001; Taş, 2010).
Fagositik solunumsal patlama
Aktive olmuş makrofajlar, nötrofiller ve eozinofillerde fagositik solunumsal patlama sırasında da çeşitli serbest radikaller oluşur. Fagositik lökositler çeşitli mikroorganizmalar ya da kimyasal uyarıcılarla uyarıldıkları zaman lizozomal içeriklerini dışarı vermeye başlamasıyla reaktif oksijen türlerinin oluşumuyla mitokondri dışında oksijen tüketiminde bir artış gözlenir. Bu duruma solunumsal patlama adı verilir. Fagositozla içeri alınmış bakteri solunumsal patlama sonucu oluşan ürünlerle yok edilir. Bu aşamada NADPH oksidaz ve myeloperoksidaz enzimleri reaktif oksijen türlerinin oluşumunda rol alırlar. Solunumsal patlamada oluşan reaktif ürünler süperoksit radikali ve hipoklorik asittir (Şekil 2.4). Bu olay normalde vücut savunma sisteminde önemli bir rol oynasa da oluşan oksidan ürünler hücrenin antioksidan savunma sisteminin baş edebileceğinden fazla olursa çeşitli hastalıkların oluşumunda rol alırlar. Örneğin romatoit artritli (RA) hastaların diz eklemlerinde fazla miktarda nötrofil birikir ve bu nötrofillerden ortama salıverilen serbest radikaller eklem hasarını hızlandırırlar (Altınışık, 2001).
Araşidonik asit metabolizması
Araşidonik asit metabolizması reaktif oksijen türlerinin oluştuğu bir yoldur. Fagositik hücrelerin uyarılması fosfolipaz ve protein kinazları aktive ederken plazma membranından araşidonik asitin ayrılmasına neden olmaktadır. Membrandan ayrılan araşidonik asit bir takım enzimlerin oksidasyonuyla beraber serbest radikal ara ürünlerinin oluşumuna ve lökotrien ve prostoglandinler gibi aktif kimyasalların oluşumuna neden olur (Şekil 2.5). Araşidonik asit metabolizmasında görev alan önemli enzimler lipooksijenaz ve siklooksijenaz enzimleridir (Altınışık, 2001).
2.2.2. Reaktif Oksijen Türleri
Süperoksit Radikali (O2•)
Moleküler oksijenin indirgenmesi sonucu ortaya çıkan süperoksit radikali enzimatik oksidasyon sonucunda oluşur. İç mitokondri zarında solunum zinciriyle, iskemi-reperfüzyon sonucunda aktifleşen ksantin oksidaz, lipooksijenaz, siklooksijenaz enzimlerinin reaksiyonları sonucunda oluşur (Zimmerman ve Granger, 1994; Al-Omar ve ark., 2004). Süperoksit radikali kendiliğinden ya da enzimatik dismutasyon reaksiyonu ile bir ara ürün olarak hidrojen peroksit oluşur (Eşitlik 5). SOD enziminin katalizlediği dismutasyon reaksiyonu ile süperoksit radikalinin spontan dismutasyon reaksiyonundan 109 kat daha hızlıdır (Hinder ve Stein, 1991).
2O2• + 2H+ → H2O2 + O2 (5)
Süperoksit radikali meydana geldikten sonra glutatyon (GSH) üzerindeki tiyol gruplarıyla etkileşime girerek hücrenin oksidatif stres durumunu ilerletebilir. Aynı şekilde enzimler ya da proteinler üzerindeki tiyol gruplarıyla da reaksiyona girerek onları inhibe edebilirler (Rubanyi ve Vanhoutte, 1986; Brent ve Rumack, 1993). Süperoksit radikali demir (Fe+2) varlığında hidrojen peroksit ile reaksiyona girerek aşırı
reaktif hidroksil radikalinin olumuna da neden olmaktadır. Bu reaksiyona Haber-Weiss reaksiyonu denmektedir (Eşitlik 6).
O2• + H2O2 → OH• + OH +O2 (6)
Süperoksit radikali ferritin gibi demir depolarından demiri serbest hale getirir. Ferritin Fe+3 değerli demir içermekte iken süperoksit radikali Fe+2 değerli demire çevirerek demiri serbest hale getirme özelliğine sahiptir. Serbest hale geçen demir ise Haber-Weiss reaksiyonu gibi demire bağlı radikal üreten reaksiyonlar aracılığıyla radikal üretimine neden olabilmekte ve dolayısıyla hücre hasarına neden katkıda bulunabilmektedir (Aydın ve ark., 2001).
Süperoksit radikali birçok oksidasyon reaksiyonu sonucu oluşabilir. Bunlardan önemli bir tanesi oksihemoglobin oluşumudur. Hemoglobin iki adet α aminoasit zincir ve iki adet de β aminoasit zinciri olmak üzere dört adet protein alt üniteye sahiptir. Her bir zincir oksijeni geri dönüşümlü olarak bağlayabilen “hem” grubu içerirler. Hemoglobin oksijeni bağlamadan önce Fe+2
iyonu içerirken oksijen bağlandığı zaman bir elektron demir iyonu ile oksijen arasında yer değiştirir (Eşitlik 7).
Fe+2 + O2 ↔ Fe+3 + O2• (7)
Bu reaksiyon sonucu oluşan oksihemoglobin dekompozisyona uğrayarak süperoksit radikali üretebilir (Eşitlik 8).
Hem-Fe+2 + O2 → Hem-Fe+3 + O2• (8)
Süperoksit radikali ile beraber oluşan Hem-Fe+3
yapısı oksijen bağlayamayan, biyolojik olarak aktivitesini kaybetmiş bir yapıya dönüşerek “methemoglobin” ismini alır. Bu oksidasyon reaksiyonu günlük olarak insan eritrositlerinin içerdiği hemoglobin miktarının %3’ünde meydana gelerek süperoksit radikali üretimine neden olur. Bu nedenle eritrositler sürekli olarak süperoksit radikali etkisine maruz kalırlar (Halliwell ve Gutteridge, 1989).
Hidroksil Radikali (HO•)
Hidroksil radikali en güçlü radikallerdendir. Hidroksil radikali de vücutta bazı reaksiyonlar sonucu oluşabilmektedir. Bunlardan bir tanesi yukarıda bahsedildiği gibi Haber-Weiss reaksiyonudur. Demir varlığında süperoksit radikali ve hidrojen peroksit reaksiyona girerek hidroksil radikalini oluşturabilir. Su molekülü iyonize edici radyasyon ışınlarına maruz kaldığında da hidroksil radikali oluşabilir. Hidrojen peroksitin demir ile reaksiyona girmesi ile de hidroksil radikali oluşabilir (Eşitlik 9) (Fujimoto ve ark., 1993).
Hidroksil radikali çoğu hücresel yapıya zarar verebilmektedir. Etki ettiği en önemli yapılara lipitler, proteinler, nükleik asitler ve sitokromlar örnek olarak verilebilir. Hidroksil radikalinin DNA üzerinde mutajenik etki oluşturduğuda bilinmektedir. DNA ve RNA yapısında bulunan pürin ve pirimidin bazlarının yapısına katılarak radikal oluşturabilir. DNA zincirinin kırılmasına neden olabilir (Aydın ve ark., 2001). Hücre ve hücre içi organel zarlarının yapısında bulunan membran fosfolipitlerinin doymamış yağ asidi içeriği oksidatif etkilere karşı hassastırlar. Bu zarlarda meydana gelen oksidasyon reaksiyonları hücrenin veya organellerin fonksiyonlarını bozmaktadırlar (Kamal ve ark., 1989). Lipit peroksidasyonu ile hücre zarının akışkanlığı azalır, normalde hücre içine giremeyen maddelerin hücre içine girişi artar, membrana bağlı enzimlerin aktivitesi bozulur, protein sentezi inhibe olur, DNA replikasyonunu önlenir ve mitokondriyal solunum durur ve membrana bağlı ya da yakın DNA’lar hasar görür (Şekil 2.6) (Halliwell ve Gutteridge, 1989; De Flora ve ark., 1991; Brent ve Rumack, 1993). Lipit peroksidasyonunun sebep olduğu önemli etkilerden bir tanesi de kalsiyum iyonunun hücre zarından içeri doğru akışını artırmaktır. Bu durum hücre içi tahribata neden olmaktadır. Mitokindri organelinde kalsiyum birikimi apoptozisi başlatıcı etki göstermektedir (Kuran, 2008). Hidrojen peroksiti yıkan CAT ve selenyum bağımlı GPX gibi enzimler, demir bağlayan şelatör ajanlar hidroksil radikali oluşumunu dolayısıyla lipit peroksidasyonunu önlemektedirler (Aydın ve ark., 2001).
Hidrojen Peroksit (H2O2)
Hidrojen peroksit ortaklanmamış elektronlara sahip olmadığından radikal olarak değildir. Membranlardan kolayca geçebilmesi ve başka reaktif oksijen türlerine dönüşebilmelerinden dolayı tehlikelidir (Nordberg ve Arner, 2001). Yukarıda bahsedildiği gibi süperoksit radikalinin dismutasyonu sonucu oluşan hidrojen peroksit, ürat oksidaz, glukoz oksidaz, D-aminosit oksidaz gibi peroksizomal enzimler süperoksit radikaline ihtiyaç duymadan hidrojen peroksit oluşturabilir (Halliwell ve Gutteridge, 1984). Hidrojen peroksit oluştuktan sonra kendiside oksidatif hasar yapabildiği gibi dolaylı olarak süperoksit radikaline dönüşerek de hasara neden olabilir. Hidrojen peroksit zayıf bir oksidan ajandır ancak proteinlerin tiyol gruplarını oksitleyebilir ya da DNA zincirinde kırılmalara neden olabilir. Hidrojen peroksit hücre membranından geçebildiği için DNA üzerinde hasara neden olma olasılığı daha fazladır (Halliwell ve Gutteridge, 1989; Cochrane, 1991). Önceki başlıklarda belirtildiği gibi hidrojen peroksit, Fe+2 ile Fenton reaksiyonunu, süperoksit radikali ile de Haber-Weiss reaksiyonunu vererek güçlü bir oksidan olan hidroksil radikalini oluşturabilmektedir.
Hipokloröz Asit (HOCl)
Hipokloröz asit radikal olmamasına karşın ROT içinde yer almaktadır. Fagositik hücrelerin bakterilere karşı savunmasında önemli görevi vardır. Aktif hale gelen monositler, nötrofiller, eozinofiller ve makrofajlar süperoksit radikali üretirler. İçerdikleri miyeloperoksidaz enzimi aracılığıyla süperoksit radikalinin dismutasyon reaksiyonu sonucu oluşan hidrojen peroksiti klor iyonuyla tepkimeye sokarak antibakteriyel bir ajan olan hipokloröz aside dönüştürürler (Eşitlik 10) (Aydın ve ark., 2001).
Singlet Oksijen (Singlet O2)
Oksijen molekülünün daha reaktif bir türü olan singlet oksijen moleküler oksijenin enerji almasıyla oluşurlar. Klorofil a ve b, bilirübin, retinal, porfirin gibi biyolojik moleküller üzerine belirli dalga boyunda ışık gönderildiğinde de singlet oksijen oluşabilir. Bu nedenle göz retinası sürekli ve yoğun ışığa maruz kaldığından dolayı retinada bulunan retinal pigmenti singlet oksijen üretir. Bu durum gözde hasara neden olabilmektedir. Singlet oksijen biyolojik olarak önemli proteinler, metiyonin, triptofan, histidin ve sistein gibi aminoasitlerin kalıntılarıyla reaksiyon vererek ciddi hasar oluşturabilirler (Buga ve ark., 1989; Aydın ve ark., 2001).
Niktrik Oksit (NO)
Nitrik oksit bir azot ve bir oksijenin çiftlenmemiş elektron vererek oluştuğundan dolayı radikal bir madde olarak tanımlanabilir (Butler ve ark., 1995). Nitrik oksit sentaz (NOS) enzimi ile L-argininden sentezlenen nitrik oksit gazı kolayca düz kas hücrelerine geçerek damar gevşemesini uyarmaktadır (Şekil 2.7) (Aydın ve ark., 2001).
Nitrik oksit yüksüz bir molekül olduğundan dolayı ve çiftlenmemiş elektron taşıdığından dolayı bir hücreden diğerine rahatça geçebilmektedir. Az konsantrasyonlarda nitrik oksit damar düz kaslarının gevşemesine neden olarak damar basıncı ve kan akışını ayarlama, sinirlerden uyarı geçişi gibi hayati olaylarda görev almaktadır (Snyder, 1992; Lowenstein ve ark., 1994). Bakteri duvarının yapısında bulunan lipopolisakkarit damar duvarındaki NOS enzimini aktifleştirerek endojen sitokinlerin (IL-1β, TNF-α ve INF-γ) salınmasını uyarır. Bu olay damar duvarında sürekli nitrik oksit oluşumuna neden olmaktadır (Schulz ve Triggle, 1994). Sitotoksik olarak uyarılmış makrofajlardan salınan nitrik oksitin, yine uyarılmış makrofajlardan salınan süperoksit radikali ile reaksiyona girerek güçlü bir oksidan olan peroksinitrit (ONOOH) oluşturduğu, oluşan peroksinitritin ise son derece güçlü bir oksidan olan hidroksil radikali oluşumuna neden olduğu ileri sürülmektedir (Eşitlik 11, 12, 13).
NO + O2• → ONOO (11)
ONOO + H → ONOOH (12)
ONOOH → NO2 + OH• (13)
Bu durum nitrik oksitin toksisitesini açıklamaktadır. Süper oksit radikalinde olduğu gibi hidrojen peroksitinde nitrik oksitin toksisitesini artırdığını gösteren araştırmalar mevcuttur (Aydın ve ark., 2001).
Çeşitli mekanizmalar sonucu oluşan serbest radikal türlerinin neden olduğu bazı reaksiyonlarılar tablo halinde gösterilmiştir (Tablo 2.2).
Tablo 2.2. Serbest radikaller ve neden olduğu reaksiyonlar (Öğüt ve Atay, 2012) Serbest Radikal Formül Neden Olduğu Hasar
Süperoksit .
O-O-
Fe2+ ve Cu+ iyonlarını geri kazanma yoluyla Haber-Weiss reaksiyonunu katalizleme, hidrojen peroksit veya peroksinitrit oluşumu
Hidrojen peroksit HO-OH Hidroksil radikali oluşumu, enzim inaktivasyonu, biyomoleküllerin oksidasyonu
Hidroksil radikali OH. Hidrojen çıkarılması, serbest radikallerin ve lipit peroksitlerin üretimi, tiyol oksidasyonu
Oksijen O=O Çifte bağlarla reaksiyon, peroksitlerin oluşumu, aminoasitlerin ve nükleotitlerin oluşumu
Nitrik oksit .N=O Peroksinitrit oluşumu, diğer radikallerle reaksiyon
Peroksinitrit O=N-O-O¯
Hidroksil radikali oluşumu, tiyollerin ve aromatik grupların oksidasyonu, ksantin dehidrojenazın ksantin oksidaza dönüşümü, biyomoleküllerin oksidasyonu
Hipoklorit ClO¯ Amino ve kükürt içeren grupların oksidasyonu, klorin oluşması
Radikal R. Hidrojen çıkarılması, radikallerin oluşumu; lipitlerin ve diğer biyomoleküllerin bozunması
Hidroperoksit R-O-OH Biyomoleküllerin oksidasyonu, biyolojik membranların bozulması
Bakır ve demir
iyonları Cu
2+
/ Fe3+ Fenton ve Haber-Weiss reaksiyonlarıyla hidroksil radikali oluşumu
2.2.3. Serbest radikallerin biyomoleküller üzerine etkileri
Serbest radikaller başta lipitler olmak üzere proteinler, karbonhidratlar ve DNA üzerinde zararlı etkilere sahiptir. Serbest radikallerin lipitler üzerindeki en önemli etkileri lipit peroksidasyonunu başlatmalarıdır. Lipit peroksidasyonu hücre zarında bulunan çoklu doymamış yağ asitlerinin oksidasyonuna yol açan kimyasal bir olaydır. Bu kimyasal olay genellikle çoklu doymamış yağ asitlerindeki konjuge çift bağlardan bir hidrojen atomu uzaklaştırılmasıyla başlamaktadır. Böylece yağ asidi zinciri bir lipit radikaline dönmektedir. Oluşan lipit radikali (L.) dayanıksız bir yapıya sahip olduğundan bir takım değişikliklere maruz kalmaktadır. Lipit radikali moleküler oksijenle etkileşerek peroksil radikaline (LOO.) oluşturmaktadır. Oluşan peroksil radikali membran yapısında mevcut olan diğer çoklu doymamış yağ asitlerinin yeni lipit radikalleri oluşturmasına neden olmaktadır. Peroksil radikalinin kendiside açığa çıkan hidrojen atomlarını alarak lipit peroksitlerine (LOOH) dönüşmektedir. Bu durum zincirleme bir reaksiyon olarak devam etmektedir. Lipit peroksitler yıkıldığında ise biyolojik olarak aktif aldehit gruplarını oluşturmaktadır. Bu bileşiklerde oluşan hasarı hücrenin diğer bölümlerine yaymaktadırlar.
Üç veya daha fazla çift bağ içeren yağ asitlerinin peroksidasyonu sonucunda oluşan MDA membran yapılarını etkileyerek çapraz bağlanma ve polimerizasyona sebep olabilir (Şekil 2.8). Sonuç olarak da iyon transport bozuklukları, enzim aktivite değişiklikleri, hücre bileşenlerinin agregasyonu gibi değişiklikler ortaya çıkabilir. Özetle serbest radikallerin lipitler üzerine olan etkisiyle oluşan lipit peroksidasyonu membran yapısına ve oluşturduğu reaktif aldehit gruplarıyla da hücre içeriğine zarar vermektedir (Gutteridge, 1995; Uysal, 1998).
Şekil 2.8. Lipit perokisdasyonu (Marnett, 1999)
Proteinler serbest radikallere karşı daha az duyarlıdırlar. Proteinlerin serbest radikallerden etkilenme dereceleri içerdiği aminoasit içeriğine göre değişmektedir. Doymamış bağ ve kükürt içeren triptofan, tirozin, fenilalanin, histidin, metiyonin, sistein gibi aminoasitlere sahip proteinler serbest radikallerden kolaylıkla etkilenirler. Bu etki sonucunda özellikle sülfür radikalleri ve karbon merkezli organik radikaller oluşmaktadır. Serbest radikallerin etkileri sonunda, yapılarında fazla sayıda disülfit bağı bulunan IgG ve albümin gibi proteinlerin tersiyer yapıları bozulur ve normal fonksiyonlarını yerine getiremezler. Prolin ve lizin reaktif oksijen türleri üreten reaksiyonlara maruz kaldıklarında nonenzimatik hidroksilasyona uğrayabilirler. Hemoglobin gibi hem proteinleri de serbest radikallerden önemli oranda zarar görürler. Özellikle oksihemoglobinin süperoksit radikali veya hidrojen peroksitle reaksiyonu methemoglobin oluşumuna neden olmaktadır (Altınışık, 2001).
Karbonhidratlarla serbest radikallerin etkileşmesi sonucu çeşitli ürünler oluşmakta ve patolojik süreçlerde rol oynamaktadırlar. Monosakkaritlerin otooksidasyonu sonucu hidrojen peroksit, peroksit ve okzoaldehitler oluşmaktadır. Açığa çıkan okzoaldehitler proteinlere bağlanabilme özelliklerinden dolayı antimitotik etki göstermektedirler. Bu durum ise kanser ve yaşlanmaya neden olabilmektedir (Akkuş, 1995).
İyonize edici radyasyonla oluşan serbest radikaller DNA'yı etkileyerek hücrede mutasyona ve ölüme yol açarlar (Şekil 2.9). Hidroksil radikali deoksiriboz ve bazlarla kolayca reaksiyona girer ve değişikliklere yol açar. Aktive olmuş nötrofillerden kaynaklanan hidrojen peroksit membranlardan kolayca geçerek ve hücre çekirdeğine ulaşarak DNA hasarına, hücre disfonksiyonuna ve hatta hücre ölümüne yol açabilir. Baz ve şeker radikallerinin reaksiyonları; değişik modifiye baz ve şekerler, kontrolsüz baz dizilimi, zincir kırılmaları ve DNA-protein çapraz bağlarını meydana getirmektedirler. Oksidatif DNA hasarları da denilen bu tip hasarlar mutasyona, kanser ve yaşlanmaya yol açmaktadır (Altınışık, 2001; Halliwell, 2007).
Şekil 2.9. Serbest radikallerin DNA üzerine etkileri (Halliwell, 2007).
2.3. Antioksidan Savunma
Serbest radikallerin aşırı üretimini ve bunların meydana getirdiği hasarı önlemek için, vücutta birçok savunma mekanizmaları gelişmiştir. Bunlar ‘‘antioksidan savunma sistemleri’’ veya ‘‘antioksidanlar’’ olarak bilinirler. Hücrede olağan metabolizma sırasında ya da patolojik etkilerle meydana gelen serbest radikaller ile antioksidan savunma sistemleri arasındaki dengeli ilişkinin serbest radikaller lehine kayması durumunda “oksidatif stres” oluşur (Şekil 2.10). Bu dengenin korunması ve oksidatif hasarın engellenmesi için antioksidan sistemler oldukça önemli rol oynamaktadır (Buga ve ark., 1989; Farber ve ark., 1989). Antioksidan moleküller endojen ve eksojen kaynaklı yapılar olup, oluşan oksidan moleküllerin neden olduğu hasarı hem hücre içi hem de hücre dışı savunma ile etkisiz hale getirilirler (Tablo 2.3).
Şekil 2.10. Oksidatif stres (Altan ve ark., 2006)
Enzimatik olmayan hücre içi antioksidanlar albümin, α-tokoferol, β-karoten, askorbat, transferin, GSH, bilirubin, seruloplazmin, ubikinoller, flavonoidler ve ürik asit gibi çeşitli molekülleri içermektedir. Enzimatik yapıda olan antioksidanlar asıl antioksidan savunmayı sağlamaktadır. Bu enzimler SOD, glutatyon-S-transferaz, GPX, glutatyon
redüktaz, CAT gibi enzimlerdir (Halliwell, 1995). Antioksidanların oksidanlar üzerindeki etkileri şu şekilde sınıflandırılabilir;
1) Antioksidan enzimler aracılığıyla ya da doğrudan reaktif oksijen türlerinin temizlenmesi (toplayıcı etki),
2) Vitamin türü gibi antioksidanlar aracılığıyla reaktif oksijen radikallerine bir hidrojen aktararak radikallerin aktivitelerini azaltma veya inaktif hale dönüştürülmesi (bastırıcı etki),
3) Hemoglobin, seruloplazmin, mineraller gibi antioksidanlar aracılığıyla serbest oksijen radikallerini bağlayarak zincir kırıcı etki ile radikallerin fonksiyonlarının engellenmesi (zincir kırıcı etki),
4) Reaktif oksijen türlerinden etkilenen moleküllerin hasar sonrası tamiri (onarıcı etki) (Kuran, 2008; Taş, 2010).
2.3.1. Enzimatik Olmayan Antioksidanlar
Enzim yapısında olmayan birçok antioksidan molekül mevcuttur. Bunlardan GSH, GPX enziminin substratıdır. GSH glisin, sistein ve glutamat aminoasitlerinden oluşan bir tripeptittir (Şekil 2.11). Antioksidan aktivitesinden sorumlu olan etkin grubu ise sistein aminoasitindeki sülfidril (-SH) grubudur. Proteinlerdeki sülfidril gruplarını redükte halde tutarak oksidasyondan korur. Böylece fonksiyonel proteinlerin ve enzimlerin inaktivasyonunu engeller. Aynı zamanda hidroksil radikali ve singlet oksijen temizleyicisidir (Trenti ve ark., 1992; Altınışık, 2001).
