Glutatyon peroksidaz (GPX) (EC 1.11.1.9)

Glutatyon peroksidazlar glutatyonu indirgeme substratı olarak kullanan bir izozim ailesinin genel adıdır (Foster ve ark., 2006). Glutatyon peroksidazlar hidrojen peroksit ve organik hidroperoksitleri su ve oksijene dönüştüren antioksidan enzimlerdir. Hidrojen peroksiti yıkarak lipit peroksidasyonunun başlamasının önlemesinde önemli

bir rol oynamaktadır. Buna ilave lipit peroksitlerini de metabolize ettiği için lipit peroksidasyonunun ilerlemesini de durdurabilmektedir. Glutatyon peroksidaz enzimi reaksiyonlarında redükte glutatyonu (GSH) hidrojen vericisi olarak kullanmaktadır. Sonuçta hidrojen peroksit ve lipit hidroperoksitleri indirgenirken glutatyon yükseltgenerek okside glutatyon (GSSG) haline dönüşmektedir (Eşitlik 18, 19) (Küçükergin, 2010).

2GSH + H2O2 → GSSG + 2H2O (18)

2GSH + ROOH → GSSG + ROH + H2O (19)

Membrana bağlı güçlü bir antioksidan olan E vitamini yetersizliğinde membrandaki lipitleri peroksidasyondan korumaktadır. Yapısında vücutta büyüme, gelişme, üreme gibi işlevlerde hayati öneme sahip selenyum elementi bulunmaktadır. Selenyum eksikliğinde ise enzimin aktivitesi azalmaktadır (Brigelius-Flohe, 1999). İlk tanımlanan GPX sitozolik GPX diğer adıyla klasik GPX’dir. Sitoplazmada lokalize olsa da hücre çekirdeğinde de bulunmaktadır. Antioksidan olarak etkin bir görevi bulunan GPX spermiogenezis, spermatozoanın olgunlaşması, farklılaşma, sinyal iletimi, preenflamasyon sitokin üretiminin regülasyonu, bakteri klonizasyonuna karşı koruma, enflamasyonla oluşan ROT’nin etkisizleştirilmesi gibi bir çok önemli olayda rol almaktadır (Chu ve ark., 2004; Pappas ve ark., 2008). Araştırmalarda hemen hemen tüm dokularda aktivite gösterdiği bildirilse de karaciğer ve böbreklerdeki aktivitesinin en yüksek düzeyde olduğu bildirilmektedir (Tablo 2.6) (Cheng ve ark., 1998).

Tablo 2.6. GPX izozimlerinin bulunduğu dokular ve özellikleri (Köse, 2011)

GPX Bulunduğu Yer Yapısı Selenyum

GPX1 Sitozolik, mitokondriyal Homotetramer Var

GPX2 Gastrointestinal yol Homotetramer Var

GPX3 Plazma, ekstrasellüler, böbrek Homotetramer Var

GPX4 Hücre membranı, sperm, çoğu doku Monomer Var

GPX5 Epididimis Homotetramer Yok

Memelilerde dört selenyum bağımlı GPX izozimi mevcuttur. Bunlar klasik GPX (GPX1), gastrointestinal GPX (GPX2), plazma GPX (GPX3) ve fosfolipit GPX (GPX4)’dir. Araştırmalara göre bu izozimlerin karakteristik yapıları benzerlik göstermektedir. GPX1 izozimi ile GPX2 %57,7, GPX3 %36,8 ve GPX4 %28,1 benzerlik göstermektedir (Fukuhara ve Kageyama, 2005). GPX1, 2 ve 3 homotetramer yapıda iken GPX4 monomer yapıdadır. GPX1 ve 2 hidrojen peroksit ve yağ asidi hidroperoksitlerini hızla indirgerken GPX3 kolesterol hidroperoksitlerini zayıf aktivitesi ile indirgemektedir. GPX3 bu yönüyle GPX1 ve 2’den ayrılmaktadır. GPX4 ise fosfolipit hidroperoksitlerini etkin bir şekilde indirgemektedir. Ancak GPX4 hidrojen peroksitin indirgenmesinde zayıf aktivite göstermektedir (Tablo 2.7) (Esworthy ve ark., 1993; Brigelius-Flohe, 1999; Arthur, 2000). GPX izozimlerinin yapısı Şekil 2.18’de gösterilmiştir.

Tablo 2.7. GPX izozimlerinin görevleri (Köse, 2011)

GPX Görev

GPX1

Hidrojen peroksit ve yağ asit hidroperoksitlerini indirger. GPX2

GPX3 Zayıf aktivitesi vardır. Kolesterol hidroperoksitlerini indirger.

GPX4 Fosfolipit hidroperoksitlere güçlü, hidrojen peroksitlere zayıf etkilidir. GPX5 Sperm olgunlaşmasında antioksidan savunmada etkilidir.

GPX6 Burun epiteli ve embriyonik dokularda antioksidan savunmada görevlidir.

GPX1 enzimi homotetramerik yapıda olup her bir alt biriminde selenosistein içeren bir selenoproteindir. GPX1 geni ise 3. kromozom üzerinde 3p21.3 bölgesinde bulunmaktadır. Gen üzerinde 2 ekzon bölgesi mevcuttur. GPX1 geni üzerinde bir kaç polimorfizm tanımlanmıştır. Bunlar -602 pozisyonunda A↔G, ekzon 1 üzerinde +2 pozisyonunda C↔T, ekzon 1 üzerinde kodon 7-11 bölgesinde gözlenen polialanin (5Ala/6Ala) ve ekzon 2 üzerinde kodon 198 üzerinde gözlenen C↔T polimorfizmleridir. Kodon 198 üzerindeki 593. nükleotitte sitozin yerine timin gelmesiyle prolin aminoasidini kodlayan CCC dizisi, lösin aminoasidini kodlayan CTC dizisine gönüşmektedir (Lei ve ark., 2007; Küçükergin, 2010). Prolin yerine lösin aminoasidinin enzimin yapısına girmesi selenyum elementinin enzime bağlanmasını etkilediği ve enzimin yapısında meydana gelen değişikliklerle enzimin aktivitesinin düştüğü bildirilmektedir (Hu ve Diamond, 2003).

GPX1 Pro198Leu polimorfizmi ile akciğer, mesane, meme, baş-boyun, hepatosellüler, kolorektal kanserleri, koroner arter, bronşiyal astım, myokard infarktüsü, inme gibi birçok hastalık arasındaki ilişki araştırılmış bu hastalıkların arasındaki ilişkiye bakılmıştır. Etnik köken, hastalık türü, cinsiyet gibi farklara göre değişebilen sonuçlar tespit edilmiştir. Lösin allelinin akciğer ve meme kanseri patogenezinde rol aldığını belirten çalışmalar olduğu gibi, prolin/lösin allelinin mesane kanseri riskini artırdığını gösteren çalışmalar da mevcuttur. Bu sonuçların tersine meme, prostat, kolorektal kanseri ile Pro198Leu polimorfizmi arasında ilişkinin olmadığını söyleyen araştırmalar vardır (Anıl, 2009). Koroner arter hastalarında yapılan bir çalışmada prolin/lösin ve

lösin/lösin genotipli bireylerin, prolin/prolin genotipli erkeklere göre daha fazla risk altında olduğu bildirilmiştir (Tang ve ark., 2008). Bronşiyal astım hastaları üzerinde yapılan bir başka çalışmada ise prolin/lösin gentotipli hastalar, prolin/prolin ve lösin/lösin genotipli hastalara göre daha fazla risk altındadır (Solodilova ve ark., 2007). GPX1 Pro198Leu polimorfizmi üzerine yapılan bazı araştırmalarda kontrol gruplarında gözlenen genotip frekansları tablo halinde gösterilmiştir (Tablo 2.8).

Tablo 2.8. GPX1 Pro198Leu polimorfizminin coğrafik bölgelerde dağılımı

Referans Ülke N Genotip Frekansı (%) ________________ Allel Frekansı (%) ____________ Pro/ Pro Pro/ Leu Leu/

Leu Pro Leu ASYA

Ichimura ve ark., 2004 Japonya 209 89,5 10,5 0 95 5

Tang ve ark., 2008 Çin 265 83,8 16,2 0 92 8

AVRUPA

Hansen ve ark., 2005 Danimarka 397 49,3 41 9,5 60 30 Lightfoot ve ark., 2006 İngiltere 1444 54 38 8 73 27 Raaschou ve ark., 2007 Danimarka 798 43,6 44,8 11,5 66 34 Mostowska ve ark., 2007 Polonya 90 58,8 41,1 0 80 20 Zarbock ve ark., 2007 Almanya 117 49,6 43,6 6,8 72 28 Arsova ve ark., 2009 Makedonya 123 46,3 38,2 15,4 66 34 Süzen ve ark., 2010 Türkiye 250 41,6 44 14,4 64 36

Köse, 2011 Türkiye 265 48,6 39,2 12,7 68 32

Bizim Çalışmamız Türkiye 100 46 44 10 68 32 KUZEY AMERİKA

Hu ve ark., 2004 Amerika 517 47,2 40,4 12,4 67 33

Knight ve ark., 2004 Kanada 372 45 44 10 68 32

Cox ve ark., 2004 Amerika 1910 47,5 42,6 9,88 69 31

Yang ve ark., 2004 Amerika 165 52 35 13 70 30

Ahn ve ark., 2005 Amerika 1088 48 42 10 69 31

2.3.2.6. Paraoksonaz (PON) (EC 3.1.8.1)

İnsanlarda PON1, PON2 ve PON3 olmak üzere üç çeşit PON enzimi bulunmaktadır. Bu enzimi oluşturan proteinleri kodlayan genler 7. kromozom üzerinde 7q21.3 ve 7q22.1 bölgeleri arasında lokalizedir (Şekil 2.19). PON proteini aminoasit dizilimlerinin dokulardaki dağılımları değişiklik göstermektedir. Yapılan araştırmalarda PON1 ve PON3 enziminin karaciğer ve plazmada, PON2 enziminin ise karaciğer, beyin, böbrek, kalp, aort düz kas hücreleri ve testis endotel tabakasında bulunduğu gösterilmiştir (Li ve ark., 2003). PON enzimlerinin özellikle kardiyovasküler hastalıklarda ve plazma lipitlerinin oksidasyonunu önlemedeki rolünü içeren birçok çalışma mevcuttur. Bunun yanı sıra diyabet, sepsis, alzheimer ve parkinson gibi diğer birçok hastalıkla da ilişkisini araştıran çalışmalar mevcuttur (Hong-Liang ve ark., 2003).

Şekil 2.19. PON 1, PON 2 ve PON 3 genlerinin insan 7. kromozomu q21. ve q22. bantları üzerindeki yerlerinin gösterimi

PON1 enzimi kalsiyum bağımlı, 354 aminoasit içeriği olan, moleküler ağırlığı 43 kDa olan, glikoprotein yapıda bir enzimdir ve karaciğerde sentezlenmektedir (Blatter ve ark., 1993). PON1 proteininin yapısında bulunan tek disülfid bağı nedeniyle PON1 enzimi siklik bir yapıdadır (Şekil 2.20). PON1 toksik organik molekülleri hidroliz etme aktivitesi ilk keşfedilen özelliği olduğundan dolayı toksikolojik bir enzim olarak değerlendirilmiştir. Ancak antiaterojenik, antienflamatuar ve antioksidan etkilerinin belirlenmesiyle son yıllarda güncellik kazanmıştır (Anıl, 2009).

Şekil 2.20. PON1 enzim yapısı (La Du ve ark., 1999)

Organofosfat nörotoksinleri, aromatik karboksilik asit esterlerini ve insektisitleri hidroliz etme yeteneği, PON1’nin en iyi bilinen koruyucu fonksiyonudur. Ayrıca PON1’in belirlenen diğer biyolojik fonksiyonu antioksidan aktivite göstermesidir. PON1 plazmada HDL ile birlikte bulunur ve plazma lipoproteinlerinin oksidasyonunu önlemede rolü bulunmaktadır. Peroksidasyona uğramış olan lipitler bu enzim tarafından metabolize edildiğinden, lipit peroksitlerinin hem HDL’de hem de LDL’de birikimi önlenir. Bu özelliği nedeniyle, HDL’nin LDL’yi oksidasyona karşı koruyucu etkisinden PON1 sorumludur (Mackness ve ark., 1991; Mackness ve ark., 1996). Oksidatif stres altında lipoproteinlerin dışında hücrenin yapısındaki lipitler de lipit peroksidasyonuna uğramaktadır. PON1 lipit peroksitlerinin aterojenik etkilerini nötralize eder ve hücre membranlarının korunmasında önemli role sahiptir (Aviram ve ark., 2000). PON1 hücre

membranında dış yüzeyinde bulunmaktadır ve lipoproteinler aracılığıyla HDL’ye geçmektedir (Şekil 2.21).

Şekil 2.21. Hücre membranında bulunan PON1’in HDL’ye geçişi (Öztürk, 2008)

PON1 enzimi kalsiyum bağımlı olduğundan dolayı kalsiyum varlığında en etkin şekilde aktivitesini gösterir. Üç boyutlu konformasyonunda iki adet kalsiyum iyonu içermektedir. Ancak enzimin kalsiyum bağımlılığı organofosfat subsratlarına karşı hidrolitik aktivitesi için geçerlidir. Lipit hidroperoksitlerin birikmesini önleyici aktivite gösterirken kalsiyum iyonunun enzim aktivitesi için gerekli olmadığı bildirilmiştir (Harel ve ark., 2004; Khersonsky ve Tawfik, 2005). PON1 karaciğerde sentezlenip plazmaya salınmaktadır. Lipoproteinlerin yokluğunda kanda az miktarda iken lipoproeinlerin artmasıyla PON1 seviyesinin de kanda arttığı gözlenmiştir. PON1 enziminin LDL lipoproteini ile etkileşim göstermemesine karşın LDL üzerindeki lipitlerin oksidasyonunu nasıl engellediği konusu henüz netlik kazanmamıştır (Deakin ve James, 2004).

PON1 enzimi fosfolipitlere ve lipoproteinlere N terminal ucundaki hidrofobik sinyal peptidi aracılığıyla bağlanır. HDL kolesterol yapısındaki apoA1 ve apoJ proteinleriyle ilişkilidir. Araştırmalar PON1 enziminin LDL’yi serbest radikallerin neden olduğu oksidasyondan koruduğunu, LDL türevi okside fosfolipitleri inaktive ettiğini ve HDL oksidasyonunu engelleyerek HDL’nin fonksiyon kaybını önlediğini göstermiştir. PON1

enzimi antioksidan özelliğini okside fosfolipitleri hidroliz etmesiyle fosfolipaz-A2

benzeri aktivite göstermesi, lipit hidroperoksitlerini ve hidrojen peroksiti yıkarak ise peroksidaz benzeri aktivite göstermesi ile kazanmaktadır (Li ve ark.,2003). PON1 enziminin bir başka önemli işlevi de proteinlerin inaktivasyonuna ve hücre hasarına neden olan protein homosisteinilasyonunu önlemesidir (Perla-Kajan ve Jakubowski, 2010).

PON gen ailesinden PON1, tanımlanan diğer PON genleriyle (PON2, PON3) kıyaslandığında uzun yıllardır çalışılmış olanı ve biyokimyasal fonksiyonu daha iyi aydınlatılmış olanıdır (Hong-Liang ve ark., 2003). PON1 geninde iki adet yaygın görülen tek nükleotit polimorfizmi mevcuttur. Bunlar 55. kodonda adenin ve timin değişikliği (A↔T) sonucu oluşan lösin aminoasidi yerine metiyonin aminoasidinin kodlandığı L55M polimorfizmi, diğeri ise 192. kodonda adenin ve guanin değişikliği (A↔G) değişikliği sonucu oluşan glutamin aminoasidinin yerine arjinin aminoasidinin kodlandığı Q192R polimorfizmidir (Şekil 2.22).

Şekil 2.22. PON enzim ailesini kodlayan gen bölgesi ve sık gözlenen mutasyonlar (Robertson ve ark., 2003).

Q192R polimorfizmi PON1 protein konsantrasyonunu etkilememekte ancak enzim aktivitesini büyük ölçüde etkilemektedir. Çalışmalar en yüksek PON aktivitesinin 192R genotipinde gözlendiğini bildirmektedir. Bunun yanında PON1 enzimi en yüksek arilesteraz aktivitesi Q192 genotipinde göstermektedir (Precourt ve ark., 2011). 192R genotipli bireylerin serumunda paraoksonu hidroliz eden aktivite yüksek, Q192 genotipli bireylerde daha düşük, Q192R genotipli bireylerde ise orta düzeyde aktivite görülmüştür. Buna karşılık Q192 genotipli bireylerde PON1 enziminin lipit

peroksitlerinin hidrolizinde daha yüksek aktivite gösterdiği bildirilmektedir (Imai ve ark., 2000; Watson ve ark., 2001).

L55 genotipi taşıyan bireylerin PON1 enzim konsantrasyonları dikkate değer şekilde yüksektir. Ancak bu durum büyük ölçüde L55M polimorfizminin bir promotor bölge polimorfizmi olan C(-108)T polimorfizmi ile sıkı bir şekilde bağlantılı (linkage disequilibrium) olmasından kaynaklanmaktadır (Precourt ve ark., 2011). L55 genotipine sahip enzimin, 55M genotipli enzime göre paraoksanı hidroliz etme aktivitesi daha yüksektir. Lipit peroksidasyonunda ise durum tam tersidir. Yani 55M genotipine sahip PON1 enzimi lipit peroksitlerini daha iyi hidroliz etmektedir (Imai ve ark., 2000; Watson ve ark., 2001). PON1 L55M ve Q192R polimorfizmleri üzerine yapılan bazı araştırmalarda kontrol gruplarında gözlenen genotip frekansları tablo halinde gösterilmiştir (Tablo 2.9).

L55M ve Q192R kodlanma bölgesindeki polimorfizmlerden başka PON1’in promoter bölgesinde de polimorfizmler olduğu tespit edilmiştir (Şekil 2.23). Bu polimorfizmler C(-108)T, G(-126)C, G(-162)A, G(-832)A ve G(-909)C bölgelerinde bulunmaktadır (Brophy ve ark., 2001). PON1 genindeki promotor bölgede gözlenen polimorfizmlerinin gen ekspresyonu ve enzimlerin serum düzeyleri üzerinde önemli etkisinin olduğu tespit edilmiştir (Hong-Liang ve ark., 2003).

Şekil 2.23. PON1 enzimi promotor bölgesi ve polimorfizmleri (dokuz adet ekzon (E1- E9). 5´promotor bölgedeki 5 polimorfizm, kodlayan bölgedeki 2 polimorfizm ve 3´ translasyona girmeyen uçtaki 4 polimorfizm gözlenmektedir (Furlong ve ark., 2002).

Tablo 2.9. PON1 L55M ve Q192R polimorfizmlerinin coğrafik bölgelerde dağılımı Referans Ülke N Allel Frekansı PON1 L55M (%) Allel Frekansı PON1 Q192R (%) L M Q R ASYA

Zama ve ark., 1997 Japonya 115 91 9 41 59

Imai ve ark., 2000 Japonya 431 90 10 34 66

Sanghera ve ark, 1998 Çin 142 96 4 43 57

Hong ve ark, 2001 Kore 113 97 3 40 60

Sirivarasai ve ark, 2007 Tayland 90 94 6 39 61

AVRUPA

Herrmann ve ark, 1996 Fransa 125 62 38 76 24

Blatter-Garin ve ark, 1997 Fransa 531 62 38 70 30 Mackness ve ark, 1997 İngiltere 279 64 36 74 26

Cascorbi ve ark, 1999 Almanya 971 67 33 73 27

Aynacioglu ve Kepekci, 2000 Türkiye 381 72 28 69 31 Bizim çalışmamız Türkiye 100 61 39 72,5 27,5 KUZEY AMERİKA

Jakubowski ve ark, 2001 Amerika 34 64 36 71 29

Serrato ve Marian, 1995; Amerika 247 64 36 69 31

PON enzim ailesinin diğer bir üyesi olan PON2 enzimine giderek artan bir ilgi olmasına rağmen fonksiyonu ve karakteristiği hakkında az bir bilgi vardır. Diğer PON enzimlerinin tersine dolaşımdaki HDL partikülleriyle ilişkili değildir. Ancak oksidatif stresin azaltılması ve ateroskleroza karşı koruma mekanizmalarında rol oynamaktadır. PON2 insanlarda akciğer, karaciğer, kalp ve bağırsaklar dahil neredeyse tüm dokularda eksprese edilir. PON2 geninde gözlenen gen polimorfizmleri kardiyovasküler hastalıklar, tip2 diyabet, iltihaplı barsak hastalığı gibi bir çok hastalıkla ilişkili bulunmuştur (Precourt ve ark., 2011). PON2 geninde 311. kodonda sistein aminoasidi ile serin aminoasidinin yer değiştirmesiyle oluşan bir polimorfizm tespit edilmiştir.

Enzimin glikozilasyonunu ve aktivitesini düşüren bu polimorfizmin akciğerde doğuştan gelen bağışıklık ile büyük bir ilgisi olduğu düşünülmektedir (Stoltz ve ark., 2009).

PON3 enzimi bu ailenin üçüncü üyesidir. PON3 enzimi ekpresyon, fonksiyon ve lokasyonu bakımından PON1 enzimiyle benzeşmektedir. Hem PON1 hem de PON3 enzimi LDL’nin oksidasyonunu geciktirdiği ancak PON1 aktivitesinin PON3 enzimine göre daha etkili olduğu in vitro çalışmalarda gösterilmiştir. Günümüzde PON3 polimorfizmleri hakkında çok az bilgi mevcuttur. Polimorfizm varyantlarının insan hastalıkları üzerinde etkisi de hala net olarak bilinmemektedir (Precourt ve ark., 2011). PON enzimlerinin dokulara göre fonksiyonları Şekil 2.24’de gösterilmiştir.