RP-HPLC metodu ile belirlenen biyoaktif peptid profili/pik sayısı

Şekil 4.23. İnek Tulum peynirinden elde edilen suda çözünebilir peptidler. Phenomenex jupiter C18

column kullanılmış olup ölçümler 214 nm'de yapılmıştır. Grafikler aşağıdan yukarıya doğru 0., 60. ve 120. günlerdeki peptid profilini göstermektedir.

Şekil 4.24. Keçi Tulum peynirinden elde edilen suda çözünebilir peptidler. Phenomenex jupiter C18

column kullanılmış olup ölçümler 214 nm'de yapılmıştır. Grafikler aşağıdan yukarıya doğru 0., 60. ve 120. günlerdeki peptid profilini göstermektedir.

Peynir olgunlaşması boyunca gerçekleşen proteolizin; rennin (koagülant), sütte bulunan enzimler, stater ve starter olmayan mikroorganizmalara ya da sekonder mikrofloraya ait enzimler ve ekzojen proteinaz ve peptidaz enzimleri ile katalizlendiği bildirilmiştir (Sousa ve ark., 2001). RP-HPLC ile Tulum peyniri örneklerinden elde

edilen suda çözünebilen biyoaktif peptid örneklerine ait sonuçlar Şekil 4.23. ve 4.24'te gösterilmiştir. Ölçümler 214 nm'de gerçekleştirilmiştir.

Şekillerde olgunlaşma süresinin 0., 60. ve 120. günlerinde suda çözünebilir peptidlerde belirlenen profil gösterilmiştir. En fazla çeşitlilik olgunlaşma süresinin 120. gününde belirlenmiştir. RP-HPLC grafiklerinde 500 mAU'nun üzerindeki değerlerde belirgin peptid piki oluşumu gözlemlenmiştir. Bu nedenle 500 mAU'nun üzerinde pik sayısı hesaplanmıştır. Elde edilen pik sayıları olgunlaşma süreleri ile beraber Çizelge 4.61.'de verilmiştir.

Çizelge 4.61. Farklı tip sütlerden yapılmış Tulum peyniri örneklerinden olgunlaşma süresince elde edilen

suda çözünebilen peptidlerin pik sayılarındaki (adet) değişim

Peynir Tipi Olgunlaşma Süresi (gün)

0. 15. 30. 60. 90. 120. İnek Tulum Peyniri 6 7 7 10 12 31 Keçi Tulum Peyniri 11 11 19 20 24 30 * Verilen değerler iki tekerrür ortalamasıdır.

Her pikin farklı peptid çeşidini yansıttığı düşünülerek sonuçlar sayısal olarak değerlendirilmiştir. Çizelge 4.61.'den de anlaşılacağı gibi olgunlaşma süresi ile birlikte peptid sayılarında artış gözlemlenmiştir. Olgunlaşma süresinin 90. gününe kadar peptid sayısı keçi Tulum peynirinde daha yüksek miktarda bulunurken olgunlaşma süresinin sonunda her iki Tulum peynirinin de yaklaşık aynı miktarda pik sayısına sahip olduğu görülmüştür. Keçi Tulum peynirinden elde edilen peptid ekstraktlarının pik sayılarında belirlenen yüksek miktarlar, keçi sütündeki mikrofloranın ve olgunlaşma süresince gelişen mikrofloranın daha çeşitli ve aktif olmasından ayrıca keçi Tulum peynirinde daha fazla proteolitik enzim bulunmasından kaynaklanmış olabilir. Olgunlaşma süresince peptid piki sayılarında meydana gelen değişimi daha iyi incelemek amacıyla Şekil 4.25. düzenlenmiştir.

yi= 4,0857x - 2,1333 yk= 3,8571x + 5,6667 0 5 10 15 20 25 30 35 0 15 30 60 90 120 P ep ti d pi k i sa yı sı (a d e t) Olgunlaşma süresi (gün)

İnek Tulum Peyniri Keçi Tulum Peyniri Doğrusal (İnek Tulum Peyniri) Doğrusal (Keçi Tulum Peyniri)

Şekil 4.25. Olgunlaşma süresince peptid sayısına (adet) ait değerlerdeki değişim

Şekil 4.25.'te görüldüğü gibi olgunlaşma süresinin 0., 15., 60. ve 90. günlerinde her iki Tulum peynirinin de benzer bir değişim gösterdiği gözlemlenmiştir. Olgunlaşma süresinin 30. günündeki keçi Tulum peynirindeki peptid sayısındaki değişim, aynı olgunlaşma süresinde bulunan inek Tulum peynirinin değişim değerinden fazla olmuştur. Olgunlaşma süresi boyunca peptid sayısındaki en yüksek değişim olgunlaşma süresinin 120. gününde inek Tulum peynirinde belirlenmiştir. Olgunlaşma süresi sonunda her iki Tulum peynirindeki peptid sayısının aynı olduğu görülmektedir. Bu durumun inek Tulum peynirinde olgunlaşma süresinin 90. gününden sonra proteolitik organizmaların gelişimlerinin yoğun bir şekilde gerçekleşmesinden kaynaklandığı düşünülmektedir.

Tulum peyniri örneklerinde peynir tipinin, olgunlaşma süresinin ve bu iki faktöre ait interaksiyonun peptid piki sayısı üzerindeki etkisini belirlemek amacıyla yapılan varyans analizi sonuçları Çizelge 4.62.’de verilmiştir. Çizelge 4.62.'den de anlaşılacağı gibi peynir tiplerinin (p<0.01), olgunlaşma sürelerinin (p<0.01) ve bu iki faktöre ait interaksiyonun (p<0.01) peptid piki sayılarındaki değişim üzerinde önemli ölçüde etkili olduğu gözlemlenmiştir

Çizelge 4.62. Farklı tip sütlerden yapılmış Tulum peyniri örneklerinden olgunlaşma süresince elde edilen

suda çözünebilen peptidlerin pik sayılarına (adet) ait varyans analizi sonuçları

Varyasyon Kaynakları (VK) SD KT KO F

Peynir Tipleri Arası 1 294.000 294.000 1,764.000**

Hata 1 2 0.333 0.167

Olgunlaşma Süreleri Arası 5 1,362.500 272.500 743.182**

Peynir Tipi x Olgunlaşma Süresi

İnteraksiyonu 5 129.500 25.900 70.636**

Hata 2 10 3.667 0.367

*(p<0.05) düzeyinde önemli, **(p<0.01) düzeyinde önemli.

Olgunlaşma sürelerinde, peynir tiplerinde ve olgunlaşma süreleri ile peynir tipleri arasındaki interaksiyonda farklılığın kaynağını belirlemek amacıyla yapılan Duncan çoklu karşılaştırma testi sonuçları Çizelge 4.63.'te verilmiştir.

Duncan çoklu karşılaştırma sonuçlarına göre peynir tipleri arasındaki fark önemli bulunmuştur (p<0.01). Keçi Tulum peynirinin daha yüksek sayıda peptid içerdiği belirlenmiştir. Bu durumun, kullanılan sütün bileşimindeki mikroflora farklılığından, peynirde proteolitik enzimlerin sayısındaki ve aktivitesindeki farklılıktan ve keçi Tulum peyniri prosesinde ısıl işlem kullanılmasından kaynaklandığı düşünülmektedir. Olgunlaşma süresi boyunca en fazla peptid sayısı olgunlaşma süresinin 120. gününde belirlenmiştir (p<0.01). Yani olgunlaşma süresinin 120. gününde yoğun bir proteoliz gerçekleşmiştir. Olgunlaşma süresinin 0. ve 15. günlerindeki peptid sayısı benzer bulunmuştur. Olgunlaşma süresi boyunca peptid sayısı olgunlaşma süresinin 15. gününden itibaren artmaya başlamıştır. Sforza ve ark. (2012) Parmigiano-Reggiano peynirlerindeki oligopeptidlerin oluşumunun olgunlaşma zamanı ile paralellik gösterdiğini bildirmiştir. Ayrıca Kırmacı ve ark. (2014) Urfa peynirinde olgunlaşma süresi boyunca proteolizin arttığını belirtmiştir.

Çizelge 4.63. Farklı tip sütlerden yapılmış Tulum peyniri örneklerinden olgunlaşma süresince elde edilen

suda çözünebilen peptidlerin pik sayılarına (adet) ait Duncan çoklu karşılaştırma testi sonuçları*

Olgunlaşma Süresi Peynir Tipi

İnek Tulum Peyniri Keçi Tulum Peyniri Genel

0. gün 5.50±0.71E_{* 11.00±0.00}D_{* 8.25±3.20}E 15. gün 6.50±0.71E_{* 10.50±0.71}D_{* 8.50±2.38}E 30. gün 7.00±0.00E_{* 18.50±0.71}C_{* 12.75±6.65}D 60. gün 10.00±0.00D_{* 20.00±0.00}C_{* 15.00±5.77}C 90.gün 12.00±0.00D_{* 24.00±0.00}B_{* 18.00±6.93}B 120. gün 31.00±1.41A_{* 30.00±0.00}A_{* 30.50±1.00}A Genel 12.00±0.118B _19.00±0.118A

*Farklı harflerle işaretlenmiş ortalamalar istatistiksel olarak birbirinden farklıdır (p<0.01). Mavi ile ifade edilen harfler olgunlaşma süreleri arasındaki farkı, kırmızı ile ifade edilen harfler peynir tipleri ile olgunlaşma süreleri interaksiyonları arasındaki farkı ve yeşil ile ifade edilen harfler ise peynir tipleri arasındaki farkı göstermektedir.

Peptid sayısı üzerinde peynir tipi ile olgunlaşma süresi interaksiyonu istatistiksel olarak önemli bulunmuş olup (p<0.01) en yüksek peptid sayısı olgunlaşma süresinin 120. gününde inek ve keçi Tulum peynirlerinde belirlenmiştir. Bu interaksiyonda en düşük peptid sayısı ise inek Tulum peynirinde olgunlaşma süresinin 0., 15. ve 30. günlerinde tespit edilmiştir. İnek Tulum peynirde olgunlaşma süresinin 60. ve 120. günlerindeki peptid sayılarında artış gözlemlenmiştir (p<0.01). İnek Tulum peynirinde olgunlaşma süresinin 0., 15. ve 30. günlerine ait peptid sayıları birbirleriyle benzer bulunurken, olgunlaşma süresinin 60. ve 90. günlerine ait peptid sayıları da birbiriyle benzerlik göstermiştir. Keçi Tulum peynirinde olgunlaşma süresinin 30., 90. ve 120. günlerindeki peptid sayılarında artış belirlenmiştir (p<0.01). Keçi Tulum peynirinde olgunlaşma süresinin 0. ve 15. günlerindeki peptid sayıları birbiriyle benzerlik gösterirken, olgunlaşma süresinin 30. ve 60. günlerine ait peptid sayıları da birbiriyle aynı bulunmuştur. Olgunlaşma süresine bağlı olarak peynirde kalan koagülanttaki (rennin) aktif enzimlerin ve plazminin ya da endojen proteolitik enzimlerin kazeinleri orta büyüklükteki (oligopeptidler gibi) peptidlere parçaladığı ve bu peptidlerin de starter ve starter olmayan laktik asit bakterilerine ve sekonder floraya ait proteinazlar ve peptidazlar tarafından kısa zincirli peptidlere ve amino asitlere parçalandığı bildirilmiştir (Gupta ve ark., 2009). Sonuçlarda meydana gelen farklılıkların enzimatik değişimlere bağlı olarak meydana geldiği düşünülmektedir. Elde edilen peptidlerin biyoaktif peptid olarak tanımlanması göstermiş olduğu fonksiyonel özelliklerinden kaynaklanmaktadır. Biyoaktif peptidlerin genellikle 2-20 amino asit kalıntısı içeren kısa zincirli bir yapıya sahip olduğu, fakat bazı durumlarda 20'den fazla amino asit içeren biyoaktif peptidlerin bulunduğu bildirilmiştir (Hartmann ve Meisel, 2007).

4.3.2. Tulum peyniri örneklerinden elde biyoaktif peptidlerin fonksiyonel