Duygu Yaşar Şirin1, Numan Karaarslan2
1Tekirdağ Namık Kemal Üniversitesi, Fen-Edebiyat Fakültesi, Moleküler Biyoloji Anabilim Dalı, Tekirdağ 2Tekirdağ Namık Kemal Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Beyin ve Sinir Cerrahisi Anabilim Dalı, Tekirdağ
GİRİŞ: Toksik etki ilaç endüstrisi için büyük bir sorundur. toksisiteye neden olma potansiyeli olan
ilaçları belirlemek amacıyla yapılan çalışmalar sayesinde tedavi süresi ve dozları belirlenebilmekte veya uygun önlemler alınabilmektedir (1). Literatürde dejenere intervertebral disk dokusu ile yapılan çok sayıda çalışma olmasına karşın intakt doku ayrıca primer veya eksplant kültürlerde yapılan çalışma sayısı oldukça sınırlıdır. Bu sunumda intakt intervertebral disk dokusundan elde edilen primer ve eksplant annulus fibrosus /nucleus pulposus (AF/NF) hücre kültürlerinde daha önce etkileri değerlendirilmemiş olan ilaçlar (iopromid, gadoksetik asit, nimodipin ve pregabalin) ile yaptığımız çalışmaların sonuçlarının sunulması amaçlanmıştır.
İopromid ve gadoksetik asit, diskografide sıklıkla kullanılan radyo kontrast ajanlardır (2). Kalsiyum kanal bloke edicileri olarak bilinen bir ilaç grubuna dâhil olan Nimodipin, serebrovasküler kaynaklı iskemik nörolojik hasarı önlemek için kullanılmaktadır (3). Pregabalin (PGB) bir GABA analogu olan bir farmakolojik ajandır (4). Kimyasal yapısı ve farmasötik özellikleri nedeniyle PBG, epilepsi, periferik nöropatik ağrı (5), kronik kas-iskelet sistemi ağrısı, lomber - ameliyatı sonrası postoperatif ağrı (6), anksiyete, somnipati ve fibromiyalji (7) tedavisi için kullanılmaktadır.
MATERYAL ve YÖNTEM: Laminektomi ve diskektomi ile elde edilen intakt intervertebral disk
dokusundan hazırlanan primer hücre kültürlerde ilaç uygulamaları gerçekleştirilmiştir. AF/NP kültürlerine İopromid final konsantrasyonu 0,0025 mmol/mL ve gadoksetik asit 0,39 mg/mL olacak şekilde 2, 4 ve 6 saat süreyle, nimodipin ve pregabalinin ise final konsantrasyonu 100 μMolar olacak şekilde 24 ve 48 saat süreyle uygulanmıştır. Hücrelerin gelişimi invert mikroskobi ile takip edilmiş ve görüntülenmiştir. Canlılık analizi; MTT analizi ve Akridin orange/ Propidyum iyodit (AO/PI) boyama sonrasında floresan mikroskobi ile gerçekleştirildi. İlaç uygulanan kültürlerde özellikle hücre proliferasyonu ve ekstraselüler matriks oluşumu üzerine etkili olduğu daha önceki çalışmalar ile bildirilen chondroadherin (CHAD), type II collagen (COL2A1) ve hypoxia-inducible factor 1 alpha (HIF 1α) genlerinin ekspresyonu qRT-PCR yöntemi ile değerlendirildi. Veriler one-way ANOVA ve post-hoc Tukey HSD yöntemleri kullanılarak istatistiksel olarak değerlendirildi.
SONUÇLAR ve TARTIŞMA: Literatürde yaptığımız çalışmadan önce, Nöroşirujide diskografi
metodolojisinde kullanılan radyo-kontrast farmasötikler iopromid ve gadoksetik asitin intakt disk dokusu hücrelerinin canlılığı ve proliferasyonu üzerine etkisini net bir şekilde gösteren hiçbir çalışma yapılmamıştır. İopromid ve gadoksetik asitin AF/NP hücrelerine negatif bir etki göstermediği saptanmıştır (2).
İskemik nörolojik hasarın önlenmesinde kullanılan Nimodipine uygulanan kültürlerde hücre proliferasyonunun yavaşladığı ve hücre ölümü gerçekleştiği saptandı. Şekil 1. de nimodipin uygulanan kültürlere ait AO/PI boyama ve invert mikroskobi görüntüleri sunulmuştur (Şekil 1). AO/PI boyamaları incelendiğinde özellikle nimodipin uygulamasının 48. saatinde apoptotik hücre ölümlerinin gerçekleştiği görülecektir.
Nimodipin uygulanan intact AF/NP kültürlerin 0, 24 ve 48. saatlerinde RNA izolasyonunu takiben qRT-PCR ile özellikle ekstraselüler matriks oluşumu ile ilişkisi daha önceki çalışmalar ile saptanmış olan COL2A1, CHAD ve HIF 1α genlerinin ekspresyonları belirlenmiştir. 0 saat kültürleri referans olarak kabul edilmiş ve bu kültürlerdeki gen ekspresyon seviyesinin RQ = 1 (% 100) olduğu kabul edilmiştir. 24 ve 48. saatlerdeki gen ifadesi referans ile kıyaslanarak kat olarak hesaplanmıştır. COL2A1 gen ifadesi kontrol veya nimodipin uygulanmış hiçbir kültürde saptanamamıştır. CHAD gen ekspresyonu nimodipin uygulamasından etkilenmemiştir. HIF 1α ifadesinin ise kontrol grubuna göre azaldığı saptanmıştır. Ancak, nimodipine uygulaması ile çalışılan genlerin ifadelerinde
gözlenen değişim arasında bir korelasyon saptanmamıştır.
Pregabalin uygulanan kültürlerde doz ve süreden bağımsız olarak hücre proliferasyonunun baskılandığı gözlenmiş ancak hücre ölümü belirlenmemiştir.
Pregabalin uygulanan intact AF/NP kültürlerin 0, 24 ve 48. saatlerinde de qRT-PCR yöntemi ile COL2A1, CHAD ve HIF 1α genlerinin ekspresyonları araştırılmıştır. Bu kültürlerde COL2A1 gen ekspresyonu değişmeden kalırken, CHAD ve HIF-1α genlerinin ifadesinde azalma belirlenmiş istatistiksel olarak anlamlı bulunmuştur.
Sonuç olarak yaptığımız çalışmalar tek başına ilaç uygulamalarının klinik etkilerini yanıtlamasa da, uygulama süre ve dozlarının belirlenmesinde yön verici olabilecek yeni veriler sağlamıştır.
KAYNAKÇA
1.Zhu JJ, Xu YQ, He JH, Yu HP, Huang CJ, Gao JM, et al. Human cardiotoxic drugs delivered by soaking and microinjection induce cardiovascular toxicity in zebrafish. J Appl Toxicol
2014;34(2):139-48.
2.Karaarslan N., Yılmaz İ., Özbek H., Yaşar Şirin D., Kaplan N., Çalışkan T., Özdemir Ç., Akyuva Y., Ateş Ö., Are Radio-Contrast Agents Commonly used In Discography Toxic to the Intact Intervertebral Disc Tissue Cells?,Basic Clin Pharmacol Toxicol. 2018;1–9.
3.Karaarslan N., Yılmaz İ., Yaşar Şirin D., Özbek H., Kaplan N., Kaya Y. E., Akyuva Y., Gürbüz M. S., Öznam K., Ateş Ö., Pregabalin treatment for neuropathic pain may damage intervertebral disc tissue, Experimental and Therapeutic Medicine, vol. 16, pp.1259-1265, 2018.4.
4. Goodman CW and Brett AS: Gabapentin and pregabalin for pain-is increased prescribing a cause for concern? N Engl J Med 377: 411-414, 2017.
5.Blommel ML and Blommel AL: Pregabalin: An antiepileptic agent useful for neuropathic pain. Am J Health Syst Pharm 64: 1475-1482, 2007.
6.Zarei M, Najafi A, Mansouri P, Sadeghi-Yazdankhah S, Saberi H, Moradi M and Farzan M: Management of postoperative pain after lumbar surgery-pregabalin for one day and 14 days-a randomized, triple-blinded, placebo-controlled study. Clin Neurol Neurosurg 151: 37-42, 2016. 7.Roth T, Arnold LM, Garcia-Borreguero D, Resnick M and Clair AG: A review of the effects of pregabalin on sleep disturbance across multiple clinical conditions. Sleep Med Rev 18: 261-271, 2014.