Bahadır ÖZTÜRK 1, Güler YAVAŞ 2, Suray PEHLİVANOĞLU 3, İlkay SAK 1, Hilal TESTİCİ 1
1 Selçuk Üniversitesi, Tıp Fakültesi Tıbbi Biyokimya Anabilim dalı, Konya-Türkiye 2 Selçuk Üniversitesi, Tıp Fakültesi Radyasyon Onkolojisi Anabilim dalı, Konya-Türkiye 3Necmettin Erbakan Üniversitesi, Moleküler Biyoloji ve Genetik Anabilim dalı, Konya-Türkiye
Özet:
Meme kanseri gelişmiş ve gelişmekte olan ülkelerde kadınlarda görülen kanserlerin %33’üne ve kanserle ilişkili ölümlerin %20’sine neden olmaktadır. MCF-7 insan meme adenokarsinomundan türetilmiş ve hücre zarında östrojen hormon reseptörü (ER), progesteron hormon reseptörü (PR) bulunduran ancak insan epidermal büyüme faktörü reseptörü 2 (HER2) reseptörünü bulundurmayan bir epitel kanser hücre dizisidir [1].
Twist1, hücreleri epitelyal mezenkimal geçişe teşvik ederek hücre metastazını destekleyen bir onkogen olarak tanımlanmıştır. Twist1 olması gerekenden başka bir bölgede ekspresyonun sağlanmasıyla, E-Kaderin ekpresyonunu baskılamakta ve mezenkimal belirteçlerde artış ve beraberinde hücre motilitesinde artışa yol açmaktadır [2].
Epitelyal mezenkimal geçiş radyasyon direnci ile ilişkilidir. Twist1 bir epitel mezenkimal geçiş düzenleyicisi olduğundan, radyasyon direnci ile ilgili olabilecek potansiyel bir faktör olabilmektedir [3].
Radyasyon tedavisi birçok kanser türü için kullanılan bir tedavi yöntemidir. İyonize radyasyon(IR) tedavisi, iltihaplı süreçleri aktive ederek hücre sağkalımını etkileyebilecek çok miktarda molekülün salınmasına neden olur. Radyasyon, kanser hücrelerinin canlılığını azaltmadaki doğrudan etkisinin yanında, tümör büyüme ve gelişmesini etkileyebilecek lokal mikro ortamlarda değişikliklere neden olabilmektedir. Meme kanserinde kullanılan IR, tümör eksizyonu sonrasında kalan rezidü hücreleri ortadan kaldırmak için kullanılmaktadır [4].
Bu çalışmada, Twist1 geni ile transfekte edilmiş MCF-7 hücre hattına farklı dozlarda uygulanan iyonize radyasyonun etkilerini incelemek amaçlanmıştır.
Yöntem ve gereçler:
MCF-7 hücreleri 10% fetal bovine serum içeren Dulbecco’s modified Eagle’s medium’da 37ºC’de ve %5 CO2‘li ortamda kültüre edildi.%70-80 konfluent olan hücreler transfeksiyon deneyi için kullanıldı. Escherichia coli DH5a bakteri suşundan izole edilen Twist1 geni pozitif pcDNA3.1 vektörleri MCF-7 hücrelerine lipofectamine 2000 (invitrogen) yardımıyla transfekte edildikten sonra kültür işlemine devam edildi [2].
Hücrelere radyasyon uygulanması
Twist1 geni ile transfekte hücreler konfluense olduktan sonra 1x106hücre olacak şekilde üç grup olarak petri kaplarına pasajlandı. Birinci grup kontrol olarak, ikinci gruba 8 Gy, üçüncü gruba ise 24 Gy dozlarında iyonize radyasyon (NOVAC7 İntraoperatif Elektron Radyasyon Tedavi Sistemi) uygulandı [3]. Hücrelerin sayı ve canlılık durumu radyasyon uygulamasından 24 saat ve 48 saat sonra Flow Sitometri cihazında (Muse Cell Analyzer, Merck Millipore), sayı ve canlılık testiyle analiz edildi.
Bulgular:
Twist1 geni transfeksiyon işleminden sonra üç farklı petri kabına ayrılan hücreler sırasıyla kontrol, 8 Gy ve 24 Gy radyasyon uygulanan gruplara ayrıldı. Ayrıca MCF-7 hücresi de kontrol olarak
kullanıldı.Twist1 geniyle transfekte edilmiş MCF-7 hücrelerinde sayı ve canlılık incelendi. IR uygulanmamış kontrol grupları arasında anlamlı bir farklılık görülmedi. Kontrol MCF-7 hücreleri, IR uygulanmamış Twist1 geni transfekte MCF-7 hücreleri ve IR uygulanmış (8 ve 24 Gy) Twist1 geniyle transfekte MCF-7 hücreleri karşılaştırıldı. 8 Gy ve 24 Gy radyasyon verilmiş hücrelerin sayı ve canlılık oranında 24 saat ve 48 saat sonunda kontrol gruplarına göre bir farklılık
görülmedi.(Tablo1, Şekil1)
0 50 100 150
Twist1 geni(-) Twist1 geni(+) Twist1
geni(+)(8 Gy) Twist1 geni(+)(24 Gy)
Grafik Başlığı
24 saat 48 saat
Tablo 1: Twist1 geni transfekte ve transfekte olmayan MCF-7 hücrelerinde IR uygulama sonrası sayı ve
canlılık yüzde oranları.
Şekil1: (a,b)Twist1 geniyle transfekte edilmemiş, radyasyon uygulanmamış MCF-7 hücrelerinin 24 saat ve 48 saat sayı ve canlılık flow sitometri sonuçları, (c,d)Twist1 geni transfekte edilmiş, radyasyon uygulanmamış MCF-7 hücrelerinin 24 saat ve 48 saat sayı ve canlılık flow sitometri sonuçları, (e,f)Twist1 geni transfekte edilmiş 8 Gy radyasyon uygulanmış MCF-7 hücrelerinin 24 saat ve 48 saat sayı ve canlılık flow sitometri sonuçları, (g,h)Twist1 geni transfekte edilmiş 24 Gy radyasyon uygulanmış MCF-7 hücrelerinin 24 saat ve 48 saat sayı ve canlılık flow sitometri sonuçları.
Tartışma:
Literatür incelendiğinde, Twist1 kanser metastazının ana düzenleyicisi olarak tanımlanmıştır. Meme kanseri, tiroit kanseri, akciğer kanseri, mide karsinomu, kolorektal kanser, hepatoselüler karsinom, pankreas kanseri gibi maling tümörlerde fazla eksprese edilir. Twist1 geni ekspresyonunun down regülasyonunun in vivo olarak akciğer kanseri metastazını azalttığı gözlemlenmiştir [5].
Birçok metastatik meme kanseri hücre hattında Akt2 ve Twist1 seviyeleri birbirlerine pozitif olarak bağımlıdır. Akt2, Twist1 üzerinde düzenleyici bir etkiye sahiptir. MCF-7 hücrelerinde, Akt2 aktivasyonu, Ser42 rezidüsünde Twist1 fosforilasyonuna yol açar. Twist1 fosforilasyonu radyasyon tedavisi ile indüklenen DNA hasarına cevaben p53 seviyelerinin azalmasına ve p53 kaynaklı apoptozun baskılanmasına yol açarak hücre sağkalımını arttırmıştır [6]. Bizim çalışmamızda ise MCF-7 hücrelerinde Twist1 geni transfeksiyonuyla hücrelerde radyasyon duyarlılığı üzerinde bir etki görülmemiştir.
Kaynaklar:
1. Teles RHG1,Moralles HF2,Cominetti MR1, Global trends in nanomedicine research on triple negative breast cancer: a bibliometric analysis, Int J Nanomedicine.2018 Apr 17;13:2321-2336. 2. Aktaş Kont K, Necmettin Erbakan Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Moleküler Biyoloji ve Genetik Anabilim Dalı Twist1 Transkripsiyon Faktörünün Glikoz Metabolizmasındaki Rolünün Araştırılması, Konya-2018
3. Valentina Bravatà, Luigi Minafra, Giusi Irma Forte, Francesco Paolo Cammarata, Giorgio Russo, Federica Maria Di Maggio, Giuseppa Augello, Domenico Lio & Maria Carla Gilardi, Cytokine profile of breast cell lines after different radiation doses, International Journal of Radiation Biology, 93:11, 1217-1226,
4. Zang C1,Liu X1,Li B2,He Y1,Jing S1,He Y1,Wu W1,Zhang B1,Ma S1,Dai W1,Li S1,Peng
Z1. IL-6/STAT3/TWIST inhibition reverses ionizing radiation-induced EMT and radioresistance in esophageal squamous carcinoma. Oncotarget. 2017 Feb 14;8(7):11228-11238
5. Ren H1,Du P1,Ge Z2,Jin Y1,Ding D3,Liu X4,Zou Q1TWIST1 and BMI1 in Cancer Metastasis and Chemoresistance, J Cancer.2016 May 25;7(9):1074-80
6.Lucı´lia Pereira1, Sara Horta2, Rita Mateus2 and Mafalda A. Videira2, Implications of Akt2/Twist crosstalk on breast cancer metastatic outcome, Drug Discovery Today, Volume 20, Number 9, September 2015