Bahadır ÖZTÜRK1, Güler YAVAŞ2, Suray PEHLİVANOĞLU3, İlkay SAK1, Hilal TESTİCİ1 ,İlker GÜVEN1
1Selçuk Üniversitesi, Tıp Fakültesi Tıbbi Biyokimya Anabilim dalı, Konya-Türkiye 2Selçuk Üniversitesi, Tıp Fakültesi Radyasyon Onkolojisi Anabilim dalı, Konya-Türkiye 3Necmettin Erbakan Üniversitesi, Moleküler Biyoloji ve Genetik Anabilim dalı, Konya-Türkiye
ÖZET: Meme kanseri, dünya çapında kadınlarda en sık teşhis edilen malignitedir ve kanserin ikinci
ölüm nedenidir (1).MDA-MB 231 insan meme adenokarsinomundan türetilmiş ve hücre zarında östrojen reseptörü (ER), progesteron reseptörü (PR) ve insan epidermal büyüme faktörü reseptörü 2(HER2) ifadelerinin eksikliği ile üçlü negatif meme kanseri (TNBC)olarak tanımlanan ve meme kanserinin yaklaşık% 15-20'sini oluşturan bir epitel kanser hücre dizisidir (2).
Antiapoptotik ve prometastatik bir transkripsiyon faktörü olan TWIST1, düzenleyici temel bir sarmal ilmek-sarmal (bHLH) transkripsiyon faktörleri ailesinin oldukça korunmuş bir üyesidir ve birçok kanser hücresi tipinde migrasyondan sorumludur (3,4).Twist1 aynı zamanda E-cadherin baskılanması ve N- cadherinin indüksiyonu yoluyla epitelyal mezenkimal geçişi (EMT)
düzenlemektedir (4,5).Twist1'in, çok çeşitli insan kanserlerinde, apoptozu inhibe ederek ve DNA hasarı veya onkogen aktivasyonu sonrasında hücre sağkalımını teşvik ederek onkogenezde yer aldığına dair birçok yayın vardır (6).
Radyasyon tedavisi (RT), kanser hücrelerinde DNA hasarına neden olur, bu da hücresel ölümün ardından büyüme inhibisyonuna yol açar(7). RT, üçlü negatif meme kanseri (TNBC) tedavisi için birincil yöntemlerden biridir (8).
Kanser için en yaygın kullanılan tedavi yöntemlerinden biri olan iyonize radyasyon (IR), DNA çift sarmalının kopmasına neden olur ve tümör döngüsünün durmasını ve/veya kanser hücrelerinin ölümünü indükleyerek tümörlerin büyümesini önler (9, 10). IR maruziyeti apoptoz ve senesens gibi çeşitli hücresel reaksiyonlara neden olabilir (11).
Bu çalışmanın amacı, Twist1 antisens geni ile transfekte edilmiş MDA-MB 231 hücre hattına farklı dozlarda uygulanan iyonize radyasyonun etkilerinin incelenmesidir.
YÖNTEM VE GEREÇLER: Hücre kültürü ve Transfeksiyon
MDA-MB 231 hücreleri 10% fetal bovine serum içeren Dulbecco’s modified Eagle’s medium’da 37ºC’de ve %5 CO2‘li ortamda kültüre edildi.%70 konfluent olan hücreler transfeksiyon deneyi için kullanıldı. Escherichia coli DH5a bakteri suşundan izole edilen twist1 antisens pozitif pcDNA3.1 vektörleri MDA-MB 231 hücrelerine lipofectamine 2000(invitrogen) yardımıyla transfekte edildikten sonra kültür işlemine devam edildi(12).
Hücrelere radyasyon uygulanması
Twist1 antisens ile transfekte hücreler konfluense olduktan sonra 1x106hücre olacak şekilde üç grup olarak kültür kaplarına pasajlandı. Birinci grup kontrol olarak kullanıldı ikinci gruba 8 Gy üçüncü gruba ise 24 Gy dozlarında iyonize radyasyon (NOVAC7 İntraoperatif Elektron Radyasyon Tedavi Sistemi) uygulandı (13). Hücrelerin apoptotik durumu uygulamadan 24 saat ve 48 saat sonra Flow Sitometri cihazında (Muse Cell Analyzer, Merck Millipore), Annexın V-Dead cell testiyle analiz edildi.
BULGULAR:
Transfeksiyon işleminden sonra üç ayrı kültür kabına ayrılan hücreler sırasıyla kontrol, 8 Gy radyasyon uygulanan ve 24 Gy radyasyon uygulanan gruplara ayrıldı. Bunun yanında MDA-MB 231 hücresi de kontrol olarak kullanıldı.Twist1 antisensle transfekte MDA-MB 231 hücrelerinin apoptozu incelendi. IR uygulanmamış kontrol grupları arasında total apoptoz oranında fark görülmedi.Kontrol MDA-MB 231hücreleri,IR uygulanmamış twist1 antisens transfekte MDA-MB 231 hücreleri ve IR uygulanmış (8 Gy,24 Gy) twist1 antisensle transfekte MDA-MB 321 hücreleri karşılaştırıldı. 8 Gy ve 24 Gy radyasyona maruz kalan hücrelerin 24 ve 48 saat sonra kontrol gruplarına göre total apoptoz miktarları artmış olduğu görüldü (Tablo 1, Şekil 1).
0 Gy(Tw1
AS-) 0 Gy(Tw1AS+) 8 Gy(Tw1AS+) 24 Gy(Tw1AS+)
24 saat 2,55 3,83 16,38 22,23 48 saat 2,82 3,55 21,21 25,4 0 5 10 15 20 25 30 Ap op to z y üz de o ra nı
Tablo 1
Tablo 1: Twist1 Antisens(AS) transfekte ve transfekte olmayan MDA-MB 231 hücrelerinde radyasyon
Şekil 1: Twist1 antisens geniyle transfekte edilmemiş radyasyon verilmemiş MDA-MB 231 hücrelerinin 24 ve
48 saat Annexın V flow sitometri sonuç grafiği (a,b). Twist1 antisens geniyle transfekte edilmiş radyasyon verilmemiş MDA-MB 231 hücrelerinin 24 ve 48 saat Annexın V flow sitometri sonuç grafiği (c,d). Twist1 antisens geniyle transfekte edilmiş 8 Gy radyasyon verilmiş MDA-MB 231 hücrelerinin 24 ve 48 saat Annexın V flow sitometri sonuç grafiği (e,f).Twist1 antisens geniyle transfekte edilmiş 24 Gy radyasyon verilmiş MDA- MB 231 hücrelerinin 24 saat,48 saat Annexın V flow sitometri sonuç grafiği (g,h).
TARTIŞMA
Twist1, kanser hücrelerinde motilite, invazivlik ve anjiyogenez oluşumunun arttırılması dahil olmak üzere çok çeşitli biyolojik fonksiyonlara sahiptir. Literatür incelendiğinde Twist1 transfeksiyonlu Nazofarenks mukozal epitelinden kaynaklanan nazofrenks karsinomu (NPC) hücreleri radyasyona maruz kaldıktan sonra twist1 hücrelerin apoptozunu inhibe ettiği bildirilmiştir (14).Twist1 geni ile transfeksiyonun Özefagus skuamöz karsinomunda radyasyona maruziyetle hücrelerin apoptozunu arttırdığı ifade edilmiştir(15).H1299 ve H460 insan küçük hücreli olmayan akciğer kanseri ( NSCLC) hücrelerine siRNA transfeksiyonu sonucu twist1 seviyesi düşürülmüş ve NSCLC'lerde arsenik trioksit ve iyonize radyasyon kaynaklı hücre ölümünü arttırdığı gösterilmiştir(16). Bizim çalışmamızda da MDA-MB 231 hücrelerine Twist1 antisense geni transfeksiyonu sonucunda radyasyon uygulamasının apoptozu arttırdığı görülmüştür.
KAYNAKÇA
1-Kirkham AA1,Beaudry RI2,Paterson DI3,Mackey JR4,Haykowsky MJ5. Curing breast Cancer and killing the heart: A novel model to explain elevated cardiovascular disease and mortality risk among women with early stage breast Cancer. Prog Cardiovasc Dis.2019 Feb 21
2-Hong Y1,Fan D2. Ginsenoside Rk1 induces cell cycle arrest and apoptosis in MDA-MB-231 triple negative breast cancer cells. Toxicology.2019 Feb 21
3-Qi W1,2,Yang Z1,2,Li H1,2,Cui Y3,Xuan Y1,2. The role of Tenascin-C and Twist1 in gastric cancer: cancer progression and prognosis. APMIS. 2019 Feb;127(2):64-71.
4-Gort EH1,Suijkerbuijk KP,Roothaan SM,Raman V,Vooijs M,van der Wall E,van Diest PJ. Methylation of the TWIST1 promoter, TWIST1 mRNA levels, and immunohistochemical expression of TWIST1 in breast cancer. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2008 Dec;17(12):3325-30
5-Tsukamoto H1,Shibata K,Kajiyama H,Terauchi M,Nawa A,Kikkawa F. Irradiation-induced epithelial- mesenchymal transition (EMT) related to invasive potential in endometrial carcinoma cells. Gynecol Oncol. 2007 Dec;107(3):500-4. Epub 2007 Oct 1.
6-Vichalkovski A1,Gresko E,Hess D,Restuccia DF,Hemmings BA. PKB/AKT phosphorylation of the transcription factor Twist-1 at Ser42 inhibits p53 activity in response to DNA damage. Oncogene. 2010 Jun 17;29(24):3554-65
7-Wu SY1,2,Chen CL3,Tseng PC4,5,Chiu CY4,Lin YE4,Lin CF4,5. Fractionated ionizing radiation facilitates interferon-γ signaling and anticancer activity in lung adenocarcinoma cells. J Cell Physiol. 2019 Feb 14 8-Zhou KX1,Xie LH2,Peng X3,Guo QM4,Wu QY4,Wang WH4,Zhang GL4,Wu JF4,Zhang GJ5,Du CW6. CXCR4 antagonist AMD3100 enhances the response of MDA-MB-231 triple-negative breast cancer cells to ionizing radiation. Cancer Lett. 2018 Apr 1;418:196-203
9-Wang Y1,Wang Y2,Liu S3,Liu Y4,Xu H5,Liang J6,Zhu J7,Zhang G8,Su W9,Dong W10,Guo Q11. Upregulation of EID3 sensitizes breast cancer cells to ionizing radiation-induced cellular senescence. Biomed Pharmacother. 2018 Nov;107:606-614
10-Liakou E1,Mavrogonatou E1,Pratsinis H1,Rizou S2,Evangelou K2,Panagiotou PN3,Karamanos
NK4,Gorgoulis VG2,5,6,Kletsas D1. Ionizing radiation-mediated premature senescence and paracrine interactions with cancer cells enhance the expression of syndecan 1 in human breast stromal fibroblasts: the role of TGF-β. Aging (Albany NY). 2016 Aug;8(8):1650-69.
11-Nguyen HQ1,To NH2,Zadigue P3,Kerbrat S4,De La Taille A5,Le Gouvello S6,Belkacemi Y7. Ionizing radiation-induced cellular senescence promotes tissue fibrosis after radiotherapy. A review. Crit Rev Oncol Hematol. 2018 Sep;129:13-26
12-Aktaş Kont K, Necmettin Erbakan Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Moleküler Biyoloji ve Genetik Anabilim Dalı Twist1 Transkripsiyon Faktörünün Glikoz Metabolizmasındaki Rolünün Araştırılması, Konya- 2018
13-Valentina Bravatà, Luigi Minafra, Giusi Irma Forte, Francesco Paolo Cammarata, Giorgio Russo, Federica Maria Di Maggio, Giuseppa Augello, Domenico Lio & Maria Carla Gilardi, Cytokine profile of breast cell lines after different radiation doses, International Journal of Radiation Biology, 93:11, 1217-1226,
14-Linli Zhang,1Beibei Su,1Wei Sun,1Wenwen Li,1Min Luo,1Dongbo Liu,1Qi Mei,1Guoxian Long,1Guangyuan Hu,1and Guoqing Hu1Twist1 promotes radioresistance in nasopharyngeal carcinoma Oncotarget. 2016 Dec 6; 7(49): 81332–81340.
15-Zang C1,Liu X1,Li B2,He Y1,Jing S1,He Y1,Wu W1,Zhang B1,Ma S1,Dai W1,Li S1,Peng Z1. IL- 6/STAT3/TWIST inhibition reverses ionizing radiation-induced EMT and radioresistance in esophageal squamous carcinoma. Oncotarget. 2017 Feb 14;8(7):11228-11238
16-Seo SK1,Kim JH1,Choi HN1,Choe TB2,Hong SI3,Yi JY4,Hwang SG1,Lee HG5,Lee YH6,Park IC7. Knockdown of TWIST1 enhances arsenic trioxide- and ionizing radiation-induced cell death in lung cancer cells by promoting mitochondrial dysfunction. Biochem Biophys Res Commun. 2014 Jul 11;449(4):490-5.