Postmodern (Farklılıklara Dayalı) Feminizm

A separação dos ácidos orgânicos foi avaliada por HPLC. O equipamento utilizado (Shimadzu) consistiu de um sistema de bombas binárias com uma alça de amostragem de 20 L e detecção na região UV, com o comprimento de onda de análise selecionado para 205 nm. A separação foi realizada em uma coluna Shimpack CLC-ODS (M) (Shimadzu) com 25 cm x 4,6 mm, 5 m. A fase móvel foi composta por tampão fosfato de sódio (NaH2PO4.H2O)

20 mmol L-1_{, pH 2,20, ajustado com ácido fosfórico, no modo de eluição isocrática, vazão de}

1,0 ml min-1 _{e temperatura ambiente.}

O desenvolvimento da metodologia para separação dos ácidos orgânicos foi feito com padrões de seis ácidos presentes em uvas e vinhos: tartárico, málico, lático, acético, cítrico e succínico. Soluções estoque 5 mg mL-1 foram preparadas para cada ácido, e diluições foram feitas a partir de uma solução de concentração 1 mg mL-1 para estudos de linearidade, repetibilidade e reprodutibilidade. Para seleção do comprimento de onda a ser utilizado foi feita uma varredura preliminar de cada ácido em um espectrofotômetro UV-Vis Jasco.

O mosto foi obtido a partir das uvas retiradas de diferentes partes dos cachos, descongeladas em banho de gelo, esmagadas em almofariz até um volume de 15 mL e centrifugadas a 3000 rpm (centrífuga Baby Excelsa II, 206R) por 10 min. O preparo de amostra consistiu na remoção dos compostos polifenólicos por precipitação com PVPP (polivinilpolipirrolidona).119 Foram adicionados 0,1 g de PVPP a 1,5 mL do mosto e centrifugados a 3000 rpm (centrífuga Baby Excelsa II) por 15 min. O sobrenadante foi retirado, centrifugado novamente a 10000 rpm (microcentrífuga 5415 R, Eppendorf) por 5 min e diluído com água desionizada antes da injeção.

3.2 Açúcares

O método desenvolvido para a quantificação de glicose e frutose, açúcares majoritários nas uvas, foi adaptado do descrito por Rovio et al. (2007)103. As separações foram feitas em um equipamento de eletroforese capilar P/ACE MDQ CE (Beckman-Coulter) com detecção por arranjo diodos. Um eletrólito consistindo de NaOH 130 mmol L-1 e Na2HPO4.7H2O foi preparado pela mistura de uma solução estoque de hidrogenofosfato de

64 sódio pentahidratado 450 mmol L-1 com NaOH 1 mol L-1. A solução resultante apresentou pH 12,8 e foi filtrada em membrana de 0,45 µm antes das análises, sendo substituída a cada amostra (4 replicatas).

O capilar foi condicionado antes de cada amostra com NaOH 1 mol L-1 por 15 min, NaOH 0,1 mol L-1 por 5 min, água deionizada durante 5 min e o eletrólito de corrida por 10 min, e entre cada replicata com NaOH 0,1 mol L-1 por 5 min, água deionizada durante 2 min e o eletrólito de corrida por 5 min. As lavagens foram feitas pela aplicação de 20 psi de pressão.

Capilares de sílica fundida com 75 µm de diâmetro interno, 60 cm de comprimento total e 50 cm de comprimento efetivo foram empregados nos experimentos. As amostras foram injetadas por aplicação de 0,5 psi durante 3 s, seguida por injeção do eletrólito de corrida por 3 s. O capilar foi termostatizado para 15 °C e a separação foi feita em polaridade normal utilizando 14 kV como potencial de separação. O monitoramento dos compostos foi realizado em 270 nm, comprimento de onda no qual se observa a absorção de um ânion formado pelos carboidratos em solução alcalina concomitante à aplicação de um campo elétrico.

Soluções estoque de glicose e frutose foram preparadas em água deionizada em sistema Milli-Q na concentração de 5 mg mL-1, e diluições foram feitas para estudos de linearidade, repetibilidade e reprodutibilidade.

As amostras para análise foram obtidas a partir das uvas descongeladas, esmagadas em almofariz até um volume de 5 mL e centrifugadas a 10000 rpm (microcentrífuga 5415 R, Eppendorf) por 10 min e diluídas em água deionizada, de acordo com o estádio de maturação.

3.3 Compostos Fenólicos 3.3.1 Antocianinas

A avaliação das condições de separação das antocianinas foi feita de acordo com os resultados apresentados por Kammerer et al. (2004)167, em um equipamento de HPLC com sistema de bombas binárias e detector por arranjo de diodos (Shimadzu), utilizando-se como fase móvel A água / ácido fórmico / acetonitrila (87 : 10 : 3, v/v/v) e como fase B água / ácido fórmico / acetonitrila (40 : 10 : 50, v/v/v), com o seguinte gradiente de eluição: 10 a 25% B durante 10 min, 25 a 31% B até 15 min, 31 a 40% B até 20 min, 40 a 50% B até 30 min, 50 a 100% B até 40 min, retornando a condição inicial em 45 min.

65 A separação foi realizada em uma coluna Zorbax Eclipse XBD C18 (Agilent Technologies) com 25 cm x 4,6 mm, 5 µm, operada a temperatura ambiente e vazão de 0,8 mL min-1, e um volume de injeção de 20 µL. Uma varredura de 200 a 600 nm foi realizada e o monitoramento das antocianinas foi feito em 520 nm.

As análises de LC-MS foram feitas em um espectrômetro de massas LCQ Deca XP Max ion trap equipado com uma interface electrospray (Thermo Finnigan), acoplado a um cromatógrafo a líquido com sistema de bombas quaternárias, injetor automático com controle de temperatura e detecção por arranjo de diodos (Thermo Finnigan). As condições cromatográficas e a coluna de separação foram as mesmas utilizadas para o sistema LC-DAD. O volume de injeção foi de 10 µL, e para este sistema utilizou-se um split na saída da coluna cromatográfica para reduzir a vazão de fase móvel para 0,3 mL min-1 _{na entrada do}

espectrômetro de massas. A ionização foi feita em modo positivo e o espectro de massas armazenado de 150 – 1000 m/z. Nitrogênio foi utilizado como gás de nebulização a uma pressão de 40 (unidades arbitrárias). A temperatura do capilar foi de 275 °C e a voltagem do spray 5 kV. Experimentos de MS/MS foram realizados e, como não haviam padrões disponíveis, os resultados de íon molecular e fragmentos foram comparados com a literatura para identificação das antocianinas presentes nos extratos.

Para o preparo das amostras as bagas das uvas foram finamente trituradas em almofariz com nitrogênio líquido. A 2 g das amostras pulverizadas foram adicionados 50 mL de metanol / 0,1% HCl (v/v) e a mistura mantida sob agitação durante 1 h. Os extratos foram filtrados e o material re-extraído com mais 50 mL do solvente durante 1 h sob agitação. Os sobrenadantes foram combinados, rotoevaporados a 35 °C, e os resíduos dissolvidos em 12 mL de água acidificada com HCl a pH 3,0. Antes da injeção, as amostras foram centrifugadas a 8000 rpm (microcentrífuga 5415 R, Eppendorf) por 1,5 min e diluídas com a fase móvel na proporção 1:1.

3.3.2 Polifenóis não-antociânicos

O perfil dos polifenóis não-antociânicos foi avaliado por LC-DAD. O gradiente de solvente foi feito utilizando-se água / ácido acético (98 : 2 v/v) como fase móvel A e acetonitrila / solvente A (80 : 20 v/v) como fase móvel B, como segue: 0 – 44 % B durante 50 min, 44 – 100 % B até 55 min, 100 % B durante 5 min, retornando às condições iniciais entre 60 e 65 min. O tempo de corrida longo foi necessário para obter uma boa resolução entre os

66 picos, devido à complexidade dos extratos polifenólicos obtidos. Vinte microlitros foram injetados e a separação realizada em uma coluna Zorbax Eclipse XBD C18 (Agilent Technologies) com 25 cm x 4,6 mm, 5 µm, operada a temperatura ambiente, e vazão de 1 mL min-1. O monitoramento foi feito nos comprimentos de onda máximos de absorção de três classes de polifenóis: 275 nm para ácidos benzóicos e flavanóis, 320 nm para ácidos hidroxicinâmicos e 360 nm para flavonóis.

Os compostos fenólicos não-antociânicos foram obtidos por extração líquido-líquido a partir do extrato obtido para as antocianinas. Os compostos foram extraídos quatro vezes com acetato de etila na proporção 1:1 a partir de 10 mL de solução. Os extratos foram combinados, secos em rotoevaporador a 30 °C e ressuspendidos em 2 mL de ácido acético 2%.

3.4 Análise multivariada dos dados

Os resultados de concentração obtidos para os ácidos orgânicos e açúcares presentes nas uvas em diferentes estádios de maturação foram analisados por PCA para verificar a influência destes compostos na maturação das uvas e nas diferentes variedades e origens. Os dados foram normalizados e analisados pelo programa Minitab® 16 (Minitab Inc.).

Os dados cromatográficos dos perfis de compostos fenólicos, antocianinas e não- antocianinas, foram submetidos à análise multivariada pela ferramenta de PCA. No caso das antocianinas, uma matriz foi construída usando o cromatograma obtido em 520 nm, e no caso dos polifenóis não-antociânicos, os cromatogramas obtidos nos três comprimentos de onda estudados: 275, 320 e 360 nm.

Os dados foram alinhados pelo programa Matlab® v. 7.5 (MathWorks Inc.), de acordo com o procedimento descrito por Skov et al. (2006)171 e utilizado por Martins et al. (2011)107 para classificar amostras de plantas, com um algoritmo implementado (http://www.models.kvl.dk/source/DTW_COW/index.asp). Esta etapa de alinhamento é necessária, pois frequentemente os dados cromatográficos originais apresentam pequenos deslocamentos dos picos causados pelas próprias condições da cromatografia líquida.105 Para proceder a análise multivariada os dados necessitam estar em uma matriz uniforme de forma que os picos de todos os cromatogramas estejam nas mesmas colunas da matriz.171 Várias técnicas matemáticas são descritas na literatura para alinhamento de picos cromatográficos, entre elas Correlation Optimized Warping (COW), utilizada neste trabalho. Este algoritmo preserva a forma e área dos picos dos cromatogramas originais, utilizando um cromatograma

67 alvo como referência para estender ou comprimir os segmentos.172 A seleção dos parâmetros para utilizar esta ferramenta foi atualizada e automatizada por Skov et al. (2006),171 para selecionar as melhores condições de alinhamento, assim como a melhor amostra referência.

Depois de alinhados os dados foram centrados na média e uma seleção de variáveis foi feita com ajuda do gráfico de loadings. Os dados selecionados foram autoescalados e as análises de PCA feitas no software Pirouette® v. 4.0 (Infometrix).

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4 RESULTADOS E DISCUSSÃO