Anadolu’ da Kadın Kimliği

A MS é uma técnica que mede a relação entre a massa e a carga (m/z) de moléculas ionizadas em fase gasosa, sendo um espectrômetro de massas constituído por uma fonte de ionização, um analisador de massas, um detector e um sistema de aquisição de dados. Na fonte de ionização as moléculas são ionizadas e transferidas para a fase gasosa. No analisador de massas os íons formados são separados de acordo com suas relações massa/carga (m/z) e posteriormente detectados. A Figura 3.2 apresenta um diagrama de blocos dos componentes de um espectrômetro de massas.

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Figura 3.2 – Diagrama de blocos ilustrando os componentes de um espectrômetro de massas.

Fonte: Adaptado de SKOOG, D. A.; HOLLER, F. J.; NIEMAN, T. A. Princípios de análise instrumental. São Paulo: Bookman, 2002. 836 p.92

Desde seu surgimento, na década de 80, a espectrometria de massas (MS) tem sido utilizada para a análise de compostos orgânicos de baixa massa molecular, substâncias voláteis e termicamente estáveis. O desenvolvimento das técnicas de ionização a pressão atmosférica foi um grande avanço que permitiu o acoplamento com HPLC e aumentou o número de compostos analisáveis por esta técnica. Na última década tornou-se uma técnica analítica valiosa para análises biológicas, fornecendo de maneira rápida, precisa e sensível informações inerentes a massa molecular de biomoléculas como proteínas, peptídeos, açúcares, ácidos nucléicos, lipídeos entre outros.209

Avanços que levaram esta técnica a ser amplamente utilizada para amostras biológicas incluem o surgimento de técnicas brandas de ionização compatíveis com biomoléculas, ESI (Electrospray ionization)210 _{e MALDI (Matrix-assisted laser desorption/ionization),}211 _{e o}

desenvolvimento de analisadores de massas em sequência (MS/MS), o que aumentou o poder de resolução e melhorou os limites de detecção da técnica, além de permitir a determinação de características estruturais detalhadas de cada peptídeo em uma amostra pela análise dos espectros de fragmentação.

118 Em ESI o processo de ionização ocorre à pressão e temperatura atmosférica. Uma solução levemente básica ou ácida contendo a amostra é bombeada através de um tubo capilar metálico submetido a uma diferença de potencial e forma-se um aerossol (spray) com gotículas carregadas que ao passar por um gás secante causa a evaporação do solvente. As gotículas carregadas tornam-se cada vez menores de modo que a densidade de carga torna-se tão alta que as moléculas carregadas são “ejetadas” para a fase gasosa, seguindo para o analisador de massas.212 Uma representação do processo de ionização por electrospray é apresentado na Figura 3.3.

Figura 3.3 – Representação do processo de ionização por electrospray.

Na ionização tipo MALDI, a solução contendo a amostra é misturada a uma solução saturada de uma matriz orgânica, e a solução resultante dessa mistura é aplicada em uma placa metálica, que é transferida para dentro do espectrômetro de massas. Os cristais formados após a evaporação do solvente são bombardeados por um feixe de laser de alta potência com comprimento de onda correspondente ao máximo de absorção da matriz. Esta energia é absorvida em grande parte pela matriz e transferida de maneira branda para a amostra, resultando em íons na fase gasosa que seguirão para o analisador de massas.213 Uma representação do processo é apresentada na Figura 3.4.

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Figura 3.4 - Representação do processo de ionização por MALDI.

A parte fundamental de um espectrômetro de massas é o analisador de íons, pois é onde os íons são separados de acordo com a sua razão massa/carga (m/z). Os analisadores de massas mais empregados em análise proteômica são íon trap (IT), quadrupolo (Q), tempo de vôo (TOF), e mais recentemente ressonância ciclotrônica de íons (FT-ICR) e orbitrap (OT).

A MS permite não somente avaliar o perfil proteômico de um organismo de forma qualitativa e quantitativa, como também identificar proteínas e caracterizar modificações pós- traducionais. As proteínas podem ser identificadas por duas abordagens: Top-Down, que analisa os espectros das proteínas intactas ou Bottom-Up, que analisa os fragmentos de peptídeos obtidos após digestão enzimática ou tratamento químico, seguida de comparação dos espectros experimentais com espectros teóricos obtidos de sequências de proteínas, genomas ou sequências ESTs (expressed sequence tags), e bancos de dados de MS.214,215 A segunda abordagem é a mais comumente empregada uma vez que espectrômetros relativamente simples de baixo custo são capazes de fornecer resultados satisfatórios para a análise de peptídeos, no entanto a estratégia Top-Down permite uma caracterização mais completa do proteoma, incluindo isoformas e modificações pós-traducionais.192 _{As duas}

abordagens podem ser utilizadas juntas, uma vez que os resultados obtidos por uma podem complementar os da outra. Diversas estratégias e algoritmos podem ser usados para identificar as proteínas, entre eles peptide mass fingerprint (PMF), espectrometria de massas sequencial (MS/MS) e sequenciamento de novo. PMF é válido apenas quando a sequência da proteína está presente no banco de dados de interesse, e geralmente é usado se o genoma do organismo está completamente sequenciado. Em MS/MS as sequências de peptídeos são identificadas por correlação dos espectros dos íons fragmento adquiridos e espectros teóricos previstos para

120 cada peptídeo presente em um banco de dados de sequência de uma proteína. No sequenciamento de novo os espectros de massas dos íons fragmento são interpretados manualmente para inferir a sequência de aminoácidos do peptídeo.191,216

As plataformas MALDI-TOF e ESI-MS/MS são as mais amplamente utilizadas em análise proteômica. MALDI-TOF PMF mede as massas dos peptídeos derivados da digestão tríptica de proteínas, gerando uma lista de massas de peptídeos que com a ajuda de algoritmos são comparados com os fragmentos trípticos previstos teoricamente para cada proteína em um banco de dados de sequência. A outra plataforma, ESI-QTOF ou ESI-IT envolve a seleção de um peptídeo precursor de uma m/z específica em determinado tempo, fragmentação do peptídeo e detecção dos íons fragmento que constituem um espectro MS/MS. Os dados podem ser interpretados por sequenciamento de novo, ou podem ser usados para pesquisa em bancos de dados. Quando integrado com HPLC para separação de peptídeos esta plataforma pode ser automatizada e tem sido amplamente usada em proteômica de plantas. No entanto, MALDI-TOF PMF é o método preferido por se relativamente barato, rápido e eficiente.216