12- Santrifüj işlemi akabinde üstte ki sıvı DNA olarak alındı
3.3. Kan Örneklerinde Konağa Ait Faktörlerin İncelenmesi
3.3.1. Polimorfizmlerin İncelenmesi
Sağlıklı ve TB hastası bireylerin EDTA’lı tüplere alınan 8 ml’lik kan örneklerinin 2 ml’sinden TOLLIP, IL-1β ve IL-10’daki polimorfizmleri incelemek üzere DNA izolasyonu yapıldı. İzolasyon QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) ile üretici firmanın önerileri doğrultusunda aşağıdaki gibi uygulandı84.
İzolasyon sonrası DNA ölçümleri NanoDrop ND-1000 cihazı ile yapıldı.
(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) ölçümler sonucunda DNA miktarı ve saflığının OD 260/280, değer aralığına göre 1.7-1.9 arasında çıkan örnekler çalışmaya dahil edildi (Şekil 3.2).
Kan örneklerinden DNA izolasyonu;
1- 1,5 ml’lik mikro santrifüj tüpüne 200 µl tam kan koyuldu.
2- Daha sonra bu tam kanın üzerine 20 µl proteinaz K eklendi.
3- Sonra 200 µl Buffer AL eklenip 15 saniye vortekslendi.
4- Bu karışım önceden ayarlanmış 56 °C’de 10 dakika inkübe edildi.
5- Bu süre sonunda kapağa buharlaşan sıvı için mini spin attırıldı.
6- Daha sonra 200 µl %100’lük etanol eklendi ve 15 saniye vortekslendi.
7- Sonra karışım QIAamp mini spin kolona aktarıldı.
8- Karışım 8000 rpm’de 1 dakika santrifüj edildi.
9- Alttaki sıvı döküldü ve toplama tüpü tekrar takıldı.
10- Sonra 500 µl Wash Buffer 1 (AW1) eklendi ve 8000 rpm’de 1 dakika santrifüj edildi.
11- Alttaki sıvı döküldü ve toplama tüpü tekrar takıldı.
12- Daha sonra 500 µl Wash Buffer 2 (AW2) eklendi ve 14000 rpm’de 3 dakika santrifüj edildi.
13- Alttaki sıvı döküldü ve toplama tüpü tekrar takıldı.
14- Yine 14000 rpm’de 1 dakika boş santifüj edildi.
15- Alttaki tüp atılıp temiz 1,5 ml’lik mikro santrifüj tüp takıldı.
21
16- Son olarak; 200 µl Eloution Buffer eklendi ve oda ısısında 1 dakika inkübe edildi. Sonra 8000 rpm’de 1 dakika santrifüj edildi.
17- Alttaki sıvı DNA olarak -80 °C’de saklandı.
3.3.1.1. Polymerase Chain Reaction - Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP) Yöntemiyle Toll-interacting Protein (TOLLIP)’in Yaygın Single Nükleotid Polimorfizm (SNP)’lerinin Tespiti Sağlıklı ve hasta bireylerin örneklerini incelenmek üzere; yaygın olarak çalışılmış ve konakta TB hastalığına karşı yatkınlıkla ilişkilendirilmiş Toll Like Reseptör (TLR) ailesinin negatif düzenleyicisi olarak bilinen, anti-inflamatuvar cevapta rol oynayan TOLLIP’in; rs5743899A/G mutasyonunun tespiti için Hha I enzimi ve rs3750920C/T mutasyonu için ise; Msp I enzimleri kullanılarak PCR-RFLP moleküler yöntemiyle muhtemel mutasyonlar tespit edildi.
TOLLIP’in; rs5743899 bölgesi için,
Forward: 5’-GGC AAT GGC AGT GGC CAC CAG TGA-3’
Reverse: 5’-CCG ATG CCC GCA CAC CTG TGT GAT-3’ şeklinde iken TOLLIP’in; rs3750920 bölgesi için ise;
Forward: 5’-AGG CGT GCA GCT CAC CGC GTA GGA-3’
Reverse: 5’-GAG AGC CTT CTC CAT GGA CGA CCG C-3’ primerleri kullanılarak PCR amplifikasyonları gerçekleştirildi.
Öncelikle her iki polimorfizmi incelemek üzere 2 ayrı PCR karışımı hazırlandı.
PCR karışımı 2 mmol/L MgCl2, 0.2 pmol/L forward ve reverse primerlerden, herbir dNTP’den 40 μmol/L, 50 ng DNA ve 2 U taq polimeraz 500 mmol/L KCL ve 100 mol/L Tris-HCL(pH: 8.3) şeklinde hazırlandı. Her iki polimorfizm için PCR amplifikasyon döngüsü aşağıdaki şekilde belirtildiği gibi uygulandı;
95 oC’de 5 dak. – ilk denaturasyon 95 oC’de 15 sn. - denaturasyon
62 oC’de 15 sn. - bağlanma (annealing) 40 döngü 72 oC’de 30 sn. - uzama (extension)
72 oC’de 7 dak. - son uzama (extension)
22
3.3.1.1.1. TOLLİP’in rs5743899a/G Mutasyonunu Tespit Etmek İçin Hha I Enzimi ile Kesme İşlemi
TOLLİP’in rs5743899 bölgesi 279 bp’de GelCompar II yazılım sistemiyle görüntülendi. Akabinde enzimle kesme işlemi gerçekleştirildi. Enzimle kesme işleminin sonrasında ‘’G’’ allelinin varlığında 279 bp’lik bölgenin 125, 93 ve 61 bp’lik bölgeler halinde ayrıldığı görülürken, ‘’A’’ allelinin varlığında ise 279 bp’lik bölgenin 218 ve 61 bp olarak ayrıldığı görüntülendi.
Hha I enzimi ile kesme işlemi aşağıda belirtildiği gibi gerçekleştirildi85. 1- Aşağıdaki karışım hazırlandı.
Su 18 μl
10X Buffer 2 μl
Hhal 1 μl
Amplikon 10 μl
2- Karışım daha sonra 37 oC’de bir gece inkübe edildi.
3- %3’lük Agaroz jel elektroforez ile örnekler görüntülendi.
3.3.1.1.2. TOLLİP’in rs3750920C/T Polimofizm İçin Msp I Enzimi ile Kesme İşlemi
TOLLİP’in rs3750920 bölgesi 169 bp’de GelCompar II yazılım sistemiyle görüntülendi. Akabinde enzimle kesme işlemi gerçekleştirildi. Enzimle kesme işleminin sonrasında ‘’T’’ allelinin varlığında 169 bp’lik bölgenin 117 ve 52 bp’lik bölgeler halinde ayrıldığı görülürken, ‘’C’’ allelinin varlığında ise 169 bp’lik bölgenin ayrılmadığı görüntülendi.
Msp I enzimiyle kesme işlemi aşağıda belirtildiği gibi gerçekleştirildi86. Aşağıdaki karışım hazırlandı.
Su 18 μl
10X Buffer 2 μl
Msp I 1 μl
Amplikon 10 μl
1- Karışım daha sonra 37 oC’de bir gece inkübe edildi.
2- %3’lük Agaroz jel elektroforez ile örnekler görüntülendi.
23
3.3.1.2. IL-1β’nın PCR-RFLP Yöntemi ile Değerlendirilmesi
Çalışmamızda değerlendirilmek üzere DNA ekstraksiyonu gerçekleştirilmiş örneklerimiz; IL-1β genindeki +3954(3953)C/T (rs1143634) polimorfizm için; Taq I enzimi kullanılarak 249 bp’lik bölge,
Forward: 5′-GTT GTC ATC AGA CTT TGA CC-3′
Reverse: 5′-TTC AGT TCA TAT GGA CCA GA-3′
primerleri kullanılarak amplifiye edildi ve değerlendirildi.
PCR karışımı 30 μl olacak şekilde;
- Su 2 μl,
- PCR Master Mix (Taq DNA polimeraz, MgCl2, dNTPs) 15 μl, - Forward 2 μl,
- Reverse 2 μl,
- DNA 9 μl hazırlandı.
PCR amplifikasyon döngüsü aşağıdaki şekilde belirtildiği gibi uygulandı;
95 oC’de 4 dk. İlk denaturasyon 95 oC’de 30 sn. Denaturasyon
59 oC’de 30 sn. Bağlanma (annealing) 30 döngü 72 oC’de 30 sn. Uzama (extension)
72 oC’de 4 dk. Son uzama (final extension)
3.3.1.2.1. IL-1β’nın +3954C/T Polimorfizm için Taq I Enzimiyle Kesme İşlemi
IL-1 β genindeki +3954(3953)C/T (rs1143634), polimorfizmin 249 bp’de oluşturduğu band GelCompar II yazılım sistemiyle görüntülendi. Enzimle kesim işleminin sonunda 249 bp’de band olması TT homozigot allelinin varlığına, 249 bp’nin enzimle kesim işleminden sonra 135 ve 114 bp’lik bölgeler olarak ayrılması durumunda CC homozigot allelin varlığına işaret ederken, 249, 135 ve 114 bp’ler halinde 3 bandında bulunması durumunda CT heterozigot allelin varlığını gösterdi.
Enzimle kesime işlemi aşağıda belirtildiği gibi gerçekleştirildi87. 1- Aşağıdaki karışım hazırlandı.
Su 18 μl
24 10X Buffer 2 μl
Taq I 1 μl
Amplikon 10 μl
2- Karışım daha sonra 65 oC’de bir gece inkübe edildi.
3- %3’lük Agaroz jel elektroforez ile örnekler görüntülendi.
3.3.1.3. IL-10’un Amplification Refractory Mutation System Polymerase Chain Reaction (ARMS-PCR) Yöntemi ile Değerlendirilmesi
IL-10 genindeki -1082G/A (rs1800896) 258 bp’lik polimorfizm için ise;
Primer G (sense/forward): 5′-CTA CTA AGG CTT CTT TGG GAG-3′
Primer A (sense/forward): 5′-ACT ACT AAG GCT TCT TTG GGA A-3′
Generic primer (antisense/reverse): 5′-CAG TGC CAA CTG AGA ATT TGG-3′
İki sense bir antisense primerler kullanıldı88. Her hasta için birine ‘’G’’ allelinin bulunduğu forward primer ve revers, diğerine ‘’A’’ allelinin bulunduğu forward primer ve reverse primerler kullanılarak iki ayrı PCR karışımı hazırlandı.
Total volume 50 µL olacak şekilde PCR karışımı aşağıda belirtildiği gibi gerçekleştirildi89.
Su 14 µl
DreamTaq Green PCR Master Mix (2X) 25 µl
Forward primer 0.5 µl
Reverse primer 0.5 µl
DNA 10 µl
Amplifikasyon döngüsü aşağıda belirtildiği gibi ayarlandı90; 95 oC’de 2 dk. İlk denatürasyon
95 oC’de 30 sn. Denatürasyon
63 oC’de 30sn. Bağlanma (Annealing) 35 döngü 72 oC’de 1 dk. Uzama (Extension)
72 oC’de 10 dk. Son uzama(Final extension)
25
3.3.2. Negatif Regülatör Gen Expresyonlarının Kantitatif Real-Time PCR