Negatif Regülatör Genler ve IL-10’a ait +1082 Polimorfizmin Genotiplerinin Değerlendirilmesi

Negatif regülatör genler ΔCt sonucu bakımından, IL-10’a ait +1082 polimorfizmin, AA, GA, GG genotiplerine göre değerlendirildi (Non-parametrik Kruskal Wallis yöntemi). +1082 polimorfizmin üç genotipi açısından değerlendirildiğinde IRAK-M (p=0.043) hasta grupta anlamlı bulunurken, SIGIRR (p=0.048) sağlıklı kontrol grupta anlamlı bulunmuştur (Çizelge 4.8).

Hasta ve sağlıklı gruplara göre anlamlı bulunan polimorfizmleri ikili genotipler halinde değerlendirdiğimizde hasta grubunda IRAK-M negatif regülatör gen ile +1082 polimorfizmi GG-AA (p=0.038) ikili genotipi açısından anlamlı bulunurken (Şekil 4.7), bunun aksine SIGIRR negatif regülatör gen ise sağlıklı kontrol grupta +1082 polimorfizmin GA-AA (p=0.042) ikili genotipi açısından anlamlı bulunmuştur (post hoc-box-plot analizi) (Şekil 4.8).

Çizelge 4.8. IL-10’a ait +1082 polimorfizmin genotiplerinin negatif regülatör genler ile değerlendirilmesi.

Negatif Regülatörler

Gruplar^a +1082 Genotipler^b P Değeri

AA GA GG

b 1082 polimorfizmine ait genotipler.

45

Şekil 4.7. IRAK-M’in +1082 polimorfizmi açısından hasta ve sağlıklı kontrol grubuna göre değerlendirilmesi

Şekil 4.8. SIGIRR’ın +1082 polimorfizmi açısından hasta ve sağlıklı kontrol grubuna göre değerlendirilmesi

46

5. TARTIŞMA

Çalışmamızda; TB’a karşı inflamatuvar cevapta rol alan proinflamatuvar sitokin IL-1β ile aşırı inflamatuvar yanıtın doku ve hücreleri harabedici özelliğini kontrol altına alma adına vücudun doğal immun cevabında rol alan IL-10, A20, SOCS-1, SOCS-3, SIGIRR, ST2, TOLLIP, MKP1, IRAK-M gibi anti-inflamatuvar sitokin ve negatif regülatör genlerin TB’a yatkınlıkla ilişkilerinin araştırılması hedef alındı.

Bu amaç çerçevesinde; 50 TB hastası ve 50 sağlıklı asemptomatik TB negatif kontrol birey çalışmaya dahil edilmiştir. Bütün bireylerden alınan kan örneklerinde A20, SOCS-1, SOCS-3, SIGIRR, ST2, TOLLIP, MKP1, IRAK-M negatif regülatör genlerin mRNA ekspresyon düzeyleri kantitatif Real-Time PCR ile araştırıldı, sonuçlar istatistiksel yöntemlere göre kıyaslanarak anlamlandırıldı. Buna ek olarak; TOLLIP genine ait rs5743899A/G ve rs3750920C/T, IL-1β’ya ait +3954C/T ve IL-10’a ait +1082G/A genlerdeki (SNP) gen polimorfizmleri de çalışmamızda değerlendirildi.

Negatif regülatör genlerin infeksiyona karşı ekspresyon seviyeleri yüksek ise gelişmesi muhtemel pro-inflamatuvar cevabın gerçekleşmemesi veya gecikmesine sebebiyet verir. Bu durum da hastalığın ortaya çıkmasına yol açar. Bu yüzden immun sistem içerisinde yer alan mediyatörlerin karşılıklı denge içerisinde seyretmesi kişi için hem infeksiyon halinin seyri açısından hem de doku ve hücrelerin zarar görmemesi bakımından önem arzetmektedir.

TOLLIP insanda 11. kromozomda kodlanan özellikle TLR2 ve TLR4 üzerinden etki göstererek pro-inflamatuvar cevabı anti-inflamatuvar cevaba dönüştürebilmektedir.

Yapılan çalışmalarda özellikle tüberküloz hastalığına yatkınlıkla ilişkilendirilmiş TOLLIP genine ait rs5743899 (intron bölgesinde) ve rs3750920 (exon bölgesinde) SNP’leri çalışmamızda değerlendirildi⁹⁵.

İnsanlarda TOLLIP genine ait rs5743899 polimorfizminin A alleli genel olarak G alleline nazaran daha fazladır. Çalışmamızda TB hastalarında sağlıklı kontrol bireylere nazaran TOLLIP genine ait rs5743899 polimorfizmin AA genotipi, GG ve AG genotipine göre daha fazla gözlemlendi. TOLLIP’in rs5743899A/G polimorfizmini hasta ve sağlıklı toplam 100 bireyde beraber değerlendirdiğimizde, örneklem sayımızın küçüklüğünden dolayı istatistiksel olarak anlamlı farklar çıkmasa da, AA ve GG

47

genotiplerinin hastalarda yüksek çıktığı, AG genotipinin ise hastalarda düşük sağlıklı kontrollerde ise yüksek olduğu görülmektedir. Bu durum göz önünde tutulduğunda majör homozigot (AA) ve minör homozigot (GG) genotiplerden ziyade heterozigot (AG) genotipin TB hastalığında daha dengeleyici bir rol aldığı söylenebilir. Bu sonuçlar diğer kaynaklarla örtüşmektedir. Yine insanlarda TOLLIP genine ait rs3750920 polimorfizminin C alleli T alleline göre daha fazladır. Çalışmamızda TB hastalarında sağlıklı kontrol bireylere nazaran TOLLIP genine ait CC genotipi, CT ve TT genotipine göre daha fazla gözlemlendi. TOLLIP genine ait her iki polimorfizimdeki majör homozigotların (AA, CC) çalışmamızın sonuçlarına göre TB hastalarında sağlıklı kontrol bireylerine nazaran yoğunlukta olması, toplum genelinde bu polimorfizimlerde A ve C allellerindeki yoğunluk insanların genelinin TB hastalığına ne derece yatkın olduğunu açıklamaktadır. Fakat TOLLIP geninin bu polimorfizmlerinin majör A ve C allellerine veya majör homozigotlarına sahip kişilerin hepsinin hastalanmaması TB patogenezinde kişiye ve bakteriye ait birçok risk faktörünün birlikte rol aldığını düşündürmektedir. 2012 yılında Shah JA ve ark.’nın yaptığı TOLLIP polimorfizmleri ve TOLLIP mRNA ekspresyonlarını değerlendirdikleri ve Real-Time PCR Tagman Probe yöntemini kullandıkları bir çalışmada; bebek kordon kanından elde ettikleri sadece sağlıklı bireylerden oluşan 84 örneğin mononükleer hücrelerinde çalışmışlar rs3750920 polimorfizmin minör (TT) homozigotta TOLLIP mRNA ekspresyon seviyesinin yüksek, majör (CC) homozigotta TOLLIP mRNA’sının ise düşük olduğunu, rs5743899 polimorfizmin minör (GG) homozigotta TOLLIP mRNA’sının düşük 6’nın ise yüksek olduğunu, majör (AA) homozigotta TOLLIP mRNA’sının yüksek IL-6’nın ise düşük olduğu gösterilmiştir⁷. 2015 yılında Araujo FJ ve ark.’larının TB gibi hücre içi bir mikroorganizma olan Leishmania’nın TOLLIP’e ait rs3750920 ve rs5743899 polimorfizmlerini PCR-RFLP yöntemi ile değerlendirdikleri bir çalışmada bu polimorfizmlerin kütanöz leishmania gelişim riskini arttırdığını ortaya koymuşlardır⁹⁶.

Bir pro-inflamatuvar sitokin olan IL-1β’ya ait +3954C/T polimorfizmi hasta ve sağlıklı kontrol grubun tamamını göz önüne alarak değerlendirdiğimizde diğer kaynaklarda olduğu gibi bizim çalışmamızda da anlamlı bir fark oluşturmadığı gözlemlenmiştir. Mao X ve ark’larının 2015 yılında yaptıkları bir çalışmada IL-1β’ya

48

ait +3954C/T polimorfizminin TB hastalığında anlamlı bir fark oluşturmadığını bulmuşlar ⁹⁷.

Anti-inflamatuvar bir sitokin olan IL-10’a ait +1082G/A polimorfizmi hasta ve sağlıklı kontrol grubu 100 örnekte değerlendirdiğimizde anlamlı bir fark oluşturmadığı, fakat IL-10’a ait +1082G/A polimorfizmi allel frekansları açısından AA, GA ve GG genotipleri bizim bulduğumuz sonuç ile eşitlik analizine göre beklenen sonuçları kıyasladığımızda bu polimorfizmin genotiplerinin anlamlı bir fark oluşturduğu gözlenmiştir. Bu sonucun aksine TOLLIP’e ait rs3750920 ve rs5743899, IL-1β’ya ait +3954C/T polimorfizimlerin allel frekansları bakımından eşitlik analizine göre anlamlı bir fark görülmemiştir.

2013 yılındaMeenakshi P ve ark.’larının TB’a yatkınlıkta değerlendirdikleri IL-1β’ya ait +3954C/T polimorfizmin genotiplerinin hasta ve sağlıklı kontrol grup karşılaştırıldığında anlamlı bir fark oluşturmadığını bulurken, aynı çalışmada IL-10’a ait +1082G/A polimorfizmini TB’a yatkınlıkta ilişkisinin olduğunu göstermişlerdir⁵. Akgüneş A ve ark.’larının 2011’da IL-10’a ait +1082G/A polimorfizmini TB’a yatkınlıkta değerlendirdikleri bir çalışmada anti-inflamatuvar cevapta rol alan bu sitokinin polimorfizminin olması durumunda hastalığın gelişim riskini arttırdığı ve TB’a yatkınlıkla ilişkisi olduğunu bulmuşlardır⁹⁸.

A20, SOCS-1, SOCS-3, SIGIRR, ST2, TOLLIP, MKP1, IRAK-M negatif regülatör genlerin ΔCt sonuçlarını 2^-ΔΔCt analizine göre kıyasladığımızda hastalarda sağlıklı kontrol grubuna göre sırasıyla ST2, TOLLIP ve SIGIRR negatif regülatör genlerinin mRNA düzeylerinin ekspresyonlarının yüksek olduğunu gördük. Bu durum da mRNA ekspresyon seviyesindeki bu yüksekliğin TB hastalığına yatkınlık ile ilişkili olabileceğini düşündürdü. ST2 insanlarda 2. kromozomda kodlanmakta olup 2 izoformu vardır. Bunlar anti-inflamatuvar cevapta rol alan soluble formu sST2 ve long form olarak bilinen ve pro-inflamatuvar cevapta rol alan ST2L’dir. ST2’nin bu iki formunun bulunması TB hastalarındaki ST2 mRNA ekspresyon düzeyindeki yüksekliğin tek başına bişey ifade etmediğini ancak diğer negatif regülatör genler ve polimorfizimler ile birlikte değerlendirildiğinde tam ve kesin bir sonuç vereceğini ortaya koymaktadır.

Hastalarda mRNA ekspresyon seviyeleri yüksek bu negatif regülatör genlerin aksine IRAK-M mRNA ekspresyon düzeyinin ise hastalarda sağlıklı kontrol grubuna kıyasla sıfıra yakın düzeyde oldukça düşük olduğu, bunu MKP1’in takip ettiği görüldü. Bu

49

sonuçlara göre çalışmamızda hastalarda sağlıklı kontrole kıyasla ST2, TOLLIP ve SIGIRR’in mRNA ekspresyon düzeylerinin yüksek, IRAK-M ve MKP1’in mRNA’sının ise oldukça düşük olduğu gözlemlenmiştir. Blok ve ark.’larının 2015 yılında bizim çalışmamızda da yer alan 8 negatif regülatör genin ekspresyon düzeylerini kantitatif Real-Time PCR yöntemi ile değerlendirdikleri bir çalışmada, soluble ST2’yi TB hastalığında potansiyel bir biomarker olarak bulmuşlardır⁶.

Çalışmamızda yer alan hasta ve sağlıklı kontrol grup ayrı ayrı değerlendirilerek, negatif regülatör genlerin ΔCt sonuçları ile dört polimorfizmin genotipleri birlikte karşılaştırıldığında TOLLIP’e ait rs5743899 polimorfizmin genotiplerinin ST2 ve IRAK-M negatif regülatör geni birlikte hasta grupta anlamlı bir fark oluşturduğu, TOLLIP negatif regülatör genin ise rs5743899 polimorfizm ile aynı şekilde hasta grupta sınırlı düzeyde anlamlı olduğunu bulduk. TOLLIP’e ait rs5743899 polimorfizmin genotiplerinin ST2, IRAK-M ve TOLLIP gibi önemli negatif regülatör genlerle birlikte hasta grupta anlamlı çıkması, bu polimorfizmin önceki yayınlarda da bahsedildiği gibi özellikle TB hastalığıyla ilişkilendirilmesi, bizim verilerimizin de ışığında bu biyomarkerların birlikte değerlendirilmesi ile TB immünopatogenezinin daha iyi anlaşılacağı kanaatindeyiz. Yine TOLLIP’e ait ve TB’a yatkınlıkla ilişkilendirilmiş rs3750920 polimorfizmin genotiplerinin A20 ve MKP1 negatif regülatör genlerle birlikte sağlıklı grupta anlamlı bir fark oluşturduğu, SIGIRR’ın ise rs3750920 polimorfizm ile yine sağlıklı grupta sınırlı düzeyde anlamlı olduğunu bulduk. IL-1β +3954 polimorfizminin genotiplerinin ne hasta ne de sağlıklı kontrol grupta negatif regülatör genler ile anlamlı bir fark oluşturmadığını gözlemledik. Bu sonuçlar ışığında;

TB hastalığı ya da TB hastalığına yatkınlık ile ilişkili bulunmuş olan incelediğimiz negatif regülatör genlerin ve polimorfizmlerin birlikte farklı yöntemlerle çalışılıp, farklı istatistiksel değerlendirmeler kullanılarak anlamlandırılması ile; bu kadar küçük örneklem ile çalışılmasına rağmen oldukça anlamlı ilişkiler belirlenmiştir.

Çalışmamızın zayıf yönleri bu bireylerin 1 ve 6 gibi pro-inflamatuvar, IL-10 gibi de anti-inflamatuvar sitokinlerin ekspresyon düzeylerini ya da plazma düzeylerini araştırmamamız, dolayısıyla da bu sitokinleri kodlayan genlerdeki TB ile ilişkilendirilen polimorfizmler ile ekspresyon düzeylerini karşılaştıramamamız idi. Eğer negatif regülatörlerin ekspresyon düzeyleri ve araştırdığımız polimorfizimler ile birlikte bu sitokin düzeyleri de beraber incelenmiş olsaydı, daha anlamlı, ancak buna karşın

50

daha karmaşık sonuçlar çıkabilirdi. Çünkü TB ve/veya diğer infeksiyon etkenleriyle karşılaşma sonucunda bu sitokinler sürekli uyarılmakta, bu da sonuçta TB’a duyarlılık ilişkisini açıklamaya yetmeyecek ve sonucu daha karmaşık hale getirecekti. Ancak hasta ve sağlıklı gruba ek olarak latent TB (LTBI) ve reinfeksiyon/reaktivasyon gruplarının da dahil edildiği ve mikro-RNA (miRNA) gibi diğer genotipik özelliklerin eklendiği daha kapsamlı bir çalışmada pro-inflamatuvar ve anti-inflamatuvar düzeylerinin de incelenmesi ile çok daha anlamlı sonuçlar elde edileceği kanaatindeyiz.

Çalışmamızın bir diğer zayıf yönü de örneklem sayımızın azlığı olabilir. Ayrıca, sigara kullanımının gerek polimorfizimlerin ortaya çıkmasında gerekse de TB’a yatkınlıkta ilişkili olduğu çalışmalar yapılmıştır. Tütün ürünleri kullanımı ve pasif içiciliğe maruziyet, ayrıca inflamasyonu tetiklediği için bu konunun daha kapsamlı bir çalışma içinde değerlendirilmesi gerekmektedir¹⁰¹.

Biz tüm bu faktörleri gerek pro-inflamatuvar gerekse de anti-inflamatuvar cevap düzeyinde hasta ve sağlıklı kontrol grup göz önüne alarak inceledik. Fakat unutulmamalıdır ki infeksiyonun başlamasına sebep olan bakteriyel doz da çok önemlidir¹⁰⁰.

Çalışmamızın en güçlü yönü ise TB’a yatkınlıkla ilişkilendirilen önemli polimorfizimler ile hastalığa karşı doğal bağışıklığın negatif regülasyonunda rol alan genlerin ekspresyon düzeylerini hasta ve sağlıklı gruplarda birarada karşılaştırmış olmamız, böylece incelediğimiz bu immun mediatörlerin hastalıkla ne kadar ilişkili olduklarını görmemizi sağlaması idi. Bildiğimiz kadarıyla, çalışmamız bu biomarkerların birarada TB’a duyarlılıkla ilişkilendirildiği ilk çalışma özelliğini taşımaktadır.

51