3.1. Örneklerin Toplanması
Klinik prognoz ve tüberküloza yatkınlıkta; Toll-Like Reseptörleri (TLRs) ile iletişime girerek inflamatuvar cevabı negatif yönde düzenleyen mekanizmalar arasında yer alan Toll-interacting protein (TOLLIP)’i, bir pro-inflamatuvar sitokin olan IL-1β’i ve güçlü bir IFNγ sentez inhibitörü olan anti-inflamatuvar sitokin IL-10’u kodlayan genlerdeki muhtemel mutasyonların moleküler yöntemler ile sorgulanması ve immun cevabın negatif regülatörlerinin gen ekspresyonunun da Real-Time PCR ile kantitatif olarak tespit edilmesini hedef alan çalışmamıza; 01 Aralık 2015 – 01 Aralık 2017 tarihleri arasında ÇÜ THAUM ve Bölge Tüberküloz Laboratuvarı’na gönderilen örneklerden seçilen, fenotipik ve genotipik yöntemlerle tespit edilen ardışık 50 tüberküloz hastası, yine bu yöntemlerle tüberküloz olmadığı belirlenen 50 sağlıklı gönüllü dahil edildi.
3.1.1. Örnek Grupları
Adana Seyhan Devlet Hastanesi Gögüs Hastalıkları hastanesi (Çukurova Aşkım Tüfekçi Devlet Hastanesi) ve Balcalı Göğüs Hastalıkları Polikliği’ne 01 Aralık 2015 – 01 Aralık 2017 tarihleri arasında akciğer tüberkülozu şüphesi ile gönderilen hasta örnekleri, fenotipik ve genotipik olarak irdelenerek biri tüberküloz (TB) pozitif hasta diğeri TB negatif sağlıklı kontrol grubu olmak üzere iki grupta incelendi. Çalışmamızda iki grup şeklinde incelenen bireylerin; sistemik lupus eritematozus, romatoid artrit, kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH) ve akut astım hastalığı gibi otoümmin hastalığının bulunmadığı kişilerin klinik geçmişleriyle doğrulandı. Bu hastalıkları bulunan kişiler çalışma dışında tutuldu. Yine çalışmamıza dahil edilen kişilerin laboratuvar tanısını doğrulama adına kişilerden tekrar balgam örnekleri istendi.
Tüberküloz olup olmadığı belirlendikten sonra çalışmamızı gerçekleştirmek üzere hasta ve sağlıklı kişilerden 8 ml EDTA’lı tüplere venöz kan örnekleri alındı. Kan örnekleri alınan tüm bireylerin yaş ve cinsiyet bilgileri alındı ve bireylere aydınlatılmış onam formları imzalatıldı.
15 3.1.1.1. Hasta Grubu
Çalışmamızın hasta grubunu oluşturmak üzere; 01 Aralık 2015 – 01 Aralık 2017 tarihleri arasında Adana Seyhan Devlet Hastanesi Gögüs Hastalıkları (Çukurova Aşkım Tüfekçi Devlet Hastanesi) hastanesi tarafından laboratuvarımıza ARB (acid-resistant-bacilli)-pozitif tespit edilmiş olarak gönderilen ardışık örnekler dahil edildi. Daha sonra ARB pozitif bu örneklerin doğrulamasını yapma adına hastalardan tekrar balgam örnekleri alındı. ARB pozitiflikleri doğrulanan örneklerden kültür pozitif örnekler seçilerek tüberküloz etkeni Mycobacterium tuberculosis Kompleks (MTBK) suşlarını diğer ARB pozitif boyanan bakteriler ve tüberküloz dışı mikobakteri (TDM)’lerden ayırt etmek için fenotipik ayırıcı tanı testlerine tabi tutuldu. Bu testler sonucunda fenotipik olarak MTBK tespit edilen suşların DNA ekstraksiyonları gerçekleştirilerek genotipik olarak da tüberküloz olduğu doğrulandı. Hem fenotipik hemde genotipik yöntemlerle TB olduğu kesinleşen hastalardan çalışmamızı gerçekleştirmek üzere 8 ml EDTA’lı tüplere venöz kan örnekleri alındı. Bu şekilde laboratuvarımızda TB şüphesi götürmeyen pozitif ardışık 50 hasta örneği belirlendi ve çalışmamızın ilk grubunu oluşturdu.
3.1.1.2. Sağlıklı Kontrol Grubu
Çalışmamızın kontrol grubunu 01 Aralık 2015 – 01 Aralık 2017 tarihleri arasında Çukurova Üniversitesi Gögüs Hastalıkları Polikliniği’nden gönderilen, birinci grubun tasarlanmasında kullanılan fenotipik ve genotipik yöntemlere göre tüberküloz negatif olduğu belirlenen ve altta yatan başka bir hastalığı bulunmayan ardışık 50 sağlıklı kontrol birey oluşturdu.
3.2. Balgam Örneklerinde Mycobacterium tuberculosis Kompleks (MTBK) Tanısının Doğrulanması
Çalışmamızın örnekleri (balgam) direk ve teksif sonrası preparat yaymalarla mikroskobik olarak, BACTEC MGIT 960 otomatize sistemiyle sıvı, Löwenstein-Jensen (LJ) ile de katı besiyerlerine örneklerin ekimi yapılarak değerlendirildi. Kültür pozitif çıkan örnekler de tür düzeyinde MTBK ve tüberküloz dışı mikobakteri (TDM)’leri ayırt etmek üzere uygulanan p-nitro-α-asetilamino-β-hidroksi-propiofen (NAP) ve BD MGIT TBc Identification ((TBc ID) MPT64 kart) Test’leriyle fenotipik identifikasyonları
16
sonucu tüberküloz şüphesi götürmeyen hastalar şeklinde doğrulandı. Kültür pozitif örneklerin Mickle cihazı (The Mickle lab. Engeneering CO. LTD. Gomshall Surrey, UK) yardımıyla mekanik DNA ekstraksiyonu gerçekleştirildi. Hsp65 genine ait spesifik bölgeyi hedef alan TB11 ve TB12 primerleri kullanılarak mikobakteri pozitif tespit edilen örnekler arasından MTBK suşlarının identifikasyonu için de INS1 INS2 primerleri kullanılarak MTBK tanısı moleküler olarak da doğrulandı.
3.2.1. Fenotipik İncelemeler
Gruplarımızda bulunan hastaların balgam örnekleri laboratuvarımızın rutin işleyişine tabi tutularak doğrudan ve teksif sonrası mikroskopik olarak inceledikten sonra mikobakterilerin identifikasyonunda altın standart olarak kabul edilen kültür ortamında izolasyon için LJ besiyeri ve MGIT 960 otomatize sistemi kullanıldı. ARB’si negatif, sıvı ve katı besiyerlerinde herhangi bir üreme olmayan, klinik geçmişleriyle de korelasyon sağlanarak herhangi bir kronik hastalığı bulunmayan bireyler (sistemik lupus eritematozus, romatoid artrit, kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH) ve akut astım hastalığı gibi) negatif olarak kabul edilip çalışmanın ikinci grubuna dahil edildi. ARB ve kültür pozitif tespit edilen örneklerde MTBK türleri ve TDM türlerinin ayrımı için NAP testi ve İmmünokromatografik TB Ag MPT64 kart testleri kullanılarak fenotipik identifikasyonları yapıldı.
3.2.1.1. Direk ve Teksif Sonrası Mikroskopik İnceleme
Çalışmamızda yer alan örneklerin boyama işlemi; öncelikle hiçbir işlem yapılmaksızın doğrudan (direkt ARB boyama) ve dekontaminasyon–homojenizasyon ve konsantrasyon işleminden sonra (teksif sonrası ARB boyama) yayma preparatları hazırlanarak Ehrlich-Ziehl-Neelsen (EZN) yöntemiyle boyandı. Mikroskopta mavi zemin üzerinde pembe-kırmızı basiller görülmesiyle ARB-pozitif olarak kabul edildi.
Örneklerimiz bu şekilde tekrar mikroskopik olarak değerlendirilmiş oldu.
3.2.1.2. Kültür
Örnekler BACTEC MGIT 960 otomatize sistemine ve Löwenstein-Jensen (LJ) besiyerine ekim yapılarak MGIT için 42 gün, LJ için ise 60 boyunca 37 °C de inkübe edildi. Bu süre zarfının sonunda pozitif sonuç vermeyen örnekler negatif kabul
17
edilirken, pozitif sonuç veren örneklere ise; MTBK ve TDM ayrımı için NAP testi ve MPT64 kart testleri uygulandı (Çizelge 3.1).
Çizelge 3.1. NAP/p-NBA test sonucu ve immünokromatografik TB Ag Mpt64 kart test sonuçlarının birlikte değerlendirilmesi.
NAP/p-NBA Test Sonucu İmmünokromatografik TB Ag Mpt64Kart Test Sonucu Tek Çizgi (I) İki Çizgi (II)
Tek Tüp (I) Geçersiz MTBK
İki Tüp (II) TDM Koinfeksiyon
3.2.2. Moleküler İnceleme ile MTBK’nin Doğrulanması
ARB, kültür ve sonrasında NAP ve MPT64 kart testleri sonucuna göre fenotipik olarak mikobakteri tespit edilen kültür örnekleri, mikobakteri’lerin hsp65 genine ait spesifik bölgeyi hedef alan TB11 ve TB12 primerleri ve bu primerlerle mikobakteri pozitif tespit edilen örnekler arasından, MTBK suşların identifikasyonu için de INS1 INS2 primerleri kullanılarak moleküler olarak da MTBK tanısı doğrulandı.
3.2.2.1. DNA Ekstraksiyonu
DNA ekstraksiyonu için MICKLE cihazında mekanik ekstraksiyon protokolü uygulandı (Şekil 3.1).
Fenotipik olarak izole edilen MTBK kültüründen 0,5 ml alınarak 1,5 ml’lik mikrosantrifüj tüplerine koyuldu.
İşlemler aşağıdaki sıraya göre gerçekleştirildi: