T.C
ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ TIBBİ MİKROBİYOLOJİ ANABİLİM DALI
TOLL-INTERACTING PROTEİN (TOLLIP), IL-1β VE IL-10 GEN POLİMORFİZMLERİ İLE İNSAN DOĞAL İMMÜN
CEVABININ NEGATİF REGÜLATÖRLERİNİN
EKSPRESYONUNUN TÜBERKÜLOZA DUYARLILIKLA İLİŞKİSİ
Emel EKER
TIBBİ MİKROBİYOLOJİ ANABİLİM DALI DOKTORA PROGRAMI
DOKTORA TEZİ
TEZ DANIŞMANI
Dr. Öğr. Üyesi Toğrul NAĞIYEV
Bu çalışma TDK-2016-5493 nolu proje olarak Çukurova Üniversitesi Araştırma Projeleri tarafından desteklenmiştir.
ADANA-2018
iii
TEŞEKKÜR
Eğitim sürem boyunca bilimsel desteklerini esirgemeyen, her zaman hoşgörülü davranan Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Başkanımız Sayın Prof.Dr. Fatih KÖKSAL’a ve akademik tecrübelerinden faydalandığım, her konuda rahatlıkla ulaşıp danıştığım danışman hocam Sayın Dr.Öğr.Üyesi Toğrul NAĞIYEV’e ve Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı değerli Öğretim Üyeleri’ne sonsuz saygı ve teşekkürlerimi sunarım.
Türkiye Bilimsel ve Teknolojik Araştırma Kurumu (TÜBİTAK)’na 2211-C Öncelikli Alanlar Doktora Burs programı kapsamında doktora tezim boyunca desteğinden ötürü teşekkürlerimi sunarım.
Doktora eğitimim boyunca birlikte çalışmaktan kıvanç duyduğum, başta bölüm sekreterimiz Suna GÖKMEN olmak üzere Ç.Ü Tıp Fakültesi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı’ndaki bütün çalışma grubuna, çalışmalarım boyunca Çukurova Üniversitesi Tropikal Hastalıklar Araştırma ve Uygulama Merkezi (Ç.Ü-THAUM)’inde bulunan çalışma arkadaşlarıma teşekkürlerimi sunarım.
Çalışmamızın örneklerinin toplanmasında titizlikle ve özveriyle yardım eden Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Gögüs Hastalıkları Anabilim Dalı Öğretim Üyelerinden Prof.Dr. İsmail HANTA’ya ve Adana Seyhan Devlet Hastanesi Gögüs Hastalıkları birimi doktorlarından Uzm.Dr. Hasan COŞKUN’a teşekkür ve saygılarımı sunarım.
Yine tez sonuçlarımın istatiksel yöntemlerle anlamlandırılmasında bana yardımcı olan Ç.Ü Tıp Fakültesi Biyoistatistik Anabilim Dalı değerli Öğretim Üyesi Doç.Dr. Yaşar SERTDEMİR ve asistanlarına teşekkürlerimi sunarım.
Son olarak, hayatımın her aşamasında olduğu gibi doktora eğitimim süresince de hep yanımda olan sevgili annem Zümrüt YARAR, babam Osman YARAR, canım eşim Necip Fazıl EKER ve bitanecik kız kardeşim Müge YİĞİT’e desteklerinden ötürü sonsuz teşekkür ve sevgilerimi sunarım…
iv
İÇİNDEKİLER
Sayfa
TEŞEKKÜR iii
İÇİNDEKİLER iv
ŞEKİLLER DİZİNİ vii
ÇİZELGELER DİZİNİ viii
SİMGELER ve KISALTMALAR DİZİNİ x
ÖZET xii
ABSTRACT xiv
1. GİRİŞ ve AMAÇ 1
2. GENEL BİLGİLER 3
2.1. Tüberküloz (TB) Hastalığı ve Kliniği 3
2.2. Epidemiyoloji 4
2.2. Tüberküloz Hastalığının Bulaşı 5
2.3. Tüberkülozda Patogenez ve İmmünite 5
2.3.1. Bakteriye Ait Faktörler 8
2.3.2. Konağa Ait Faktörler 9
2.4. Tanı 9
2.4.1. Moleküler Yöntemler 10
2.4.1.1 Polymerase Chain Reaction - Restriction Fragment Length
Polymorphism (PCR-RFLP) 11
2.4.1.2 Amplification Refractory Mutation System Polymerase Chain
Reaction - (ARMS-PCR) 12
2.4.1.3. Kantitatif Real-Time PCR 12
2.5. Tedavi ve Kontrol 13
3. GEREÇ ve YÖNTEM 14
3.1. Örneklerin Toplanması 14
3.1.1. Örnek Grupları 14
3.1.1.1. Hasta Grubu 15
3.1.1.2. Sağlıklı Kontrol Grubu 15
3.2. Balgam Örneklerinde Mycobacterium tuberculosis Kompleks
v
(MTBK) Tanısının Doğrulanması 15
3.2.1. Fenotipik İncelemeler 16
3.2.1.1. Direk ve Teksif Sonrası Mikroskopik İnceleme 16
3.2.1.2. Kültür 16
3.2.2. Moleküler İnceleme ile MTBK’nin Doğrulanması 17
3.2.2.1. DNA Ekstraksiyonu 17
3.2.2.2. Mikobakteri’lerin hsp65 Gen Bölgesinin Amplifikasyonu 18 3.2.2.3. Mikobakteri’lerin IS6110 Gen Bölgesinin Amplifikasyonu 18 3.3. Kan Örneklerinde Konağa Ait Faktörlerin İncelenmesi 19
3.3.1. Polimorfizmlerin İncelenmesi 20
3.3.1.1. Polymerase Chain Reaction –
Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP) Yöntemiyle Toll-interacting Protein (TOLLIP)’in Yaygın Single Nükleotid Polimorfizm
(SNP)’lerinin Tespiti 21
3.3.1.1.1. TOLLİP’in rs5743899A/G Mutasyonunu Tespit Etmek İçin Hha I Enzimi ile Kesme İşlemi 22 3.3.1.1.2. TOLLİP’in rs3750920C/T Polimofizm İçin
Msp I Enzimi ile Kesme İşlemi 22
3.3.1.2. IL-1β’nın PCR-RFLP Yöntemi ile Değerlendirilmesi 23 3.3.1.2.1. IL-1β’nın +3954C/T Polimorfizm için Taq I
Enzimiyle Kesme İşlemi 23
3.3.1.3. IL-10’un Amplification Refractory Mutation System Polymerase Chain Reaction (ARMS-PCR)
Yöntemi ile Değerlendirilmesi 24
3.3.2. Negatif Regülatör Gen Expresyonlarının
Kantitatif Real-Time PCR ile İncelenmesi 25
3.3.2.1. Periferal Kan Mononükleer Hücre (PBMC) İzolasyonu 26 3.3.2.2. Periferal Kan Mononükleer Hücre (PBMC)’den
RNA İzolasyonu 26
3.3.2.3. RNA’dan cDNA Sentezi (Revers Transkriptaz Aşaması) 27 3.3.2.4. Kantitatif Real-Time PCR Amplifikasyonu 28
vi
3.3.3. İstatistik Analizi 30
4. BULGULAR 32
4.1. TOLLIP’e ait rs5743899, rs3750920, IL-1β’ya ait +3954 ve IL-10’a ait +1082 Polimorfizmlerin Populasyona
Göre Değerlendirilmesi 32
4.2. Negatif Regülatör Gen Ekspresyonlarının Değerlendirilmesi 34 4.3. Negatif Regülatör Genler ve Tollip’e ait rs5743899
Polimorfizmin Genotiplerinin Değerlendirilmesi 38 4.4. Negatif Regülatör Genler ve Tollip’e ait rs3750920
Polimorfizmin Genotiplerinin Değerlendirilmesi 40 4.5. Negatif Regülatör Genler ve IL-1β’ya ait +3954
Polimorfizmin Genotiplerinin Değerlendirilmesi 43 4.6. Negatif Regülatör Genler ve IL-10’a ait +1082
Polimorfizmin Genotiplerinin Değerlendirilmesi 44
5. TARTIŞMA 46
6. SONUÇ ve ÖNERİLER 51
7. KAYNAKLAR 53
8. ÖZGEÇMİŞ 61
vii
ŞEKİLLER DİZİNİ
Sayfa
Şekil 3.1. Mickle cihazı 18
Şekil 3.2. DNA ve RNA ölçümlerinin yapıldığı
NanoDrop ND-1000 cihazı 27
Şekil 3.3. Applied Biosystems™ 7500 Fast Real-Time PCR cihazı 30 Şekil 4.1. ST2 negatif regülatör geninin rs5743899 polimorfizmi
açısından hasta ve sağlıklı kontrol grubuna göre değerlendirilmesi 39 Şekil 4.2. IRAK-M negatif regülatör geninin rs5743899 polimorfizmi açısından
hasta ve sağlıklı kontrol grubuna göre değerlendirilmesi
Şekil 4.3. TOLLIP negatif regülatör geninin rs5743899 polimorfizmi açısından hasta ve sağlıklı kontrol grubuna göre değerlendirilmesi 40 Şekil 4.4. A20 negatif regülatör geninin rs3750920 polimorfizmi açısından
hasta ve sağlıklı kontrol grubuna göre değerlendirilmesi 41 Şekil 4.5. MKP1 negatif regülatör geninin rs3750920 polimorfizmi açısından
hasta ve sağlıklı kontrol grubuna göre değerlendirilmesi 42 Şekil 4.6. A20 negatif regülatör geninin rs3750920 polimorfizmi açısından
hasta ve sağlıklı kontrol grubuna göre değerlendirilmesi 42 Şekil 4.7. IRAK-M’in +1082 polimorfizmi açısından
hasta ve sağlıklı kontrol grubuna göre değerlendirilmesi 45 Şekil 4.8. SIGIRR’ın +1082 polimorfizmi açısından
hasta ve sağlıklı kontrol grubuna göre değerlendirilmesi 45
viii
ÇİZELGELER DİZİNİ
Sayfa Çizelge 3.1. NAP/p-NBA test sonucu ve immünokromatografik
TB Ag Mpt64 kart test sonuçlarının birlikte değerlendirilmesi 17 Çizelge 3.2. Moleküler doğrulama için kullanılan primerler 19 Çizelge 3.3. Kantitatif Real-Time PCR Cihazında kullanılan primerler 25 Çizelge 3.4. Primerler ve örneklerin plate dağılımı. 29 Çizelge 3.5. Real-Time PCR’da tek bir kuyucuk için gerekli PCR karışımı. 29 Çizelge 4.1. Polimorfizmlerin allel frekansları bakımından değerlendirilmesi 33 Çizelge 4.2. Kantitatif Real-Time PCR ile negatif regülatör genlerin
2−ΔΔCt değerlerinin hesaplanması. 34
Çizelge 4.3. Negatif regülatör genlerin mRNA’larının Real-Time PCR ΔCt
sonuçlarının gruplara dağılımı 35
Çizelge 4.4.ROC analizine göre negatif regülatör genlerin p değerleri 36 Çizelge 4.5. Tollip’e ait rs5743899 Polimorfizmin
genotiplerinin negatif regülatör genler ile değerlendirilmesi 38 Çizelge 4.6. Tollip’e ait rs3750920 Polimorfizmin
genotiplerinin negatif regülatör genler ile değerlendirilmesi 41 Çizelge 4.7. IL-1β’ya ait +3954 Polimorfizmin
genotiplerinin negatif regülatör genler ile değerlendirilmesi 43 Çizelge 4.8. IL-10’a ait +1082 Polimorfizmin
genotiplerinin negatif regülatör genler ile değerlendirilmesi 44
ix
SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ
ADT Antibiyotik Duyarlılık Testi
Anti-TB Anti-Tüberküloz
ARB/AARB Acid-Resistant Bacilli/ Acid-Alcohol Resistant Bacilli ARMS-PCR Amplification Refractory Mutation System-
Polymerase Chain Reaction System BCG Bacille Calmette-Guerin
CDC Centers for Disease Control and Prevention CFP-10 Culture Filtrat Protein
ÇİD Çoklu İlaç Dirençli
Ct Threshold Cycle
DSÖ Dünya Sağlık Örgütü – World Health Organisation
EMB Etambutol
ESAT-6 Early Secretory Antigenic Target 6
Expand-TB Expanding Access to New Diagnostics for TB
HIV Human Immunodeficiency Virus-İnsan Bağışıklık Yetmezlik Virüsü (AIDS (Acquired Immune Deficiency Syndrome- Kazanılmış Bağışık Yetmezlik Sendromu))
INH İsoniazid
IL-1R IL-1 Receptor
IRAK-M IL-1 Receptor –Associated Kinase M IRAK4 IL-1 Receptor –Associated Kinase 4
IFNγ Interferon Gama
İDT İlaç Duyarlılık Testi
KOAH Kronik Obstrüktif Akciğer Hastalığı
LJ Lowenstein Jensen
LPS Lipopolisakkarit
MDR-TB Multidrug-Resistant-TB
MGIT Mycobacterium Growth Indicator Tube MKP1 Map Kinase Phosphatase 1
MTb Mycobacterium tuberculosis
x
μl Mikro Litre
MOTT Mycobacterium Other Than Tuberculosis MTBK Mycobacterium tuberculosis Kompleks-
Mycobacterium tuberculosis Complex MyD88 Myeloid differentiation 88
NALC N-Asetil L-Sistein
NAP p-Nitro-α-Asetilamino-β-hidroksi-Propiofen
NTM Non-Tüberküloz
OT Old Tuberkülin
PAMPs Pathogen Associated Molecular Patterns PIM Fosfatidil İnozitol Mannozid
PPD Purified Protein Derivative-Saflaştırılmış protein derivesi PRRs Pattern-Recognition Receptors
Pzase Pirazinaminidaz
PZA Pirazinamid
RIF Rifampicin
PCR-RFLP Polymerase Chain Reaction-
Restriction Fragment Length Polymorphism
RPT Rifapentin
SIGIRR Single Immunoglobulin IL-1 Related Receptor
SNP Single Nucleotide Polymorphism-Tek Nükleotid Polimorfizm SOCS-1 Supressor of Cytokine Signaling 1
SOCS-3 Supressor of Cytokine Signaling 3
STR Streptomycin
TB Tüberküloz
Tm Temperature Melting-Erime Eğrisi
TLR Toll-like Receptor
TOLLIP Toll-İnteracting Protein
YİD-TB Yaygın İlaç Dirençli Tüberküloz XDR Extensively Drug Resistant
xi
ÖZET
Toll-Interacting Protein (TOLLIP), IL-1β ve IL-10 Gen Polimorfizmleri ile İnsan Doğal İmmün Cevabının Negatif Regülatörlerinin Ekspresyonunun
Tüberküloza Duyarlılıkla İlişkisi
Tüberküloz (TB), dünyada insanlarda infeksiyona bağlı ölümlerin başlıca sebeplerinden biridir, fakat immün patogenezi tam olarak anlaşılmadan kalmıştır.
Doğal immün cevap mikobakterilere karşı konağın ilk savunması için çok önemlidir. Bu bağlamda, bir proinflamatuvar sitokin olan IL-1β’i, antiinflamatuvar sitokin IL-10’u ve Toll-like reseptörleri (TLRs) ile iletişime girerek inflamatuvar cevabı negatif yönde düzenleyen mediatörler arasında yer alan Toll-interacting protein (TOLLIP)’i kodlayan genlerdeki birçok polimorfizm ile immün cevabın negatif regülatörlerinin gen ekspresyon düzeylerinin farklı insan populasyonlarında birçok kronik infeksiyonda olduğu gibi TB patofizyolojisinde ve TB’a yatkınlıkta da önemli bir rol oynadığı az sayıdaki moleküler çalışmalarda ileri sürülmüştür. Biz çalışmamızda konağa ait bu risk faktörlerinin TB’a duyarlılıkla ilişkisini araştırmayı amaçladık.
Aralık 2015 ile Aralık 2017 tarihleri arasında ÇÜ THAUM Bölge Tüberküloz Laboratuvarı’na Adana İlinden gönderilen balgam örneklerinin incelenmesi sonucunda TB tanısı alan ardışık 50 hasta ile 50 TB negatif sağlıklı kontrol bireyden EDTA’lı tüplere 8 ml venöz kan örneği alındı. Örneklerin 2 ml’sinden DNA ekstraksiyonu sonrasında TOLLIP genindeki rs5743899A/G ve rs3750920C/T polimorfizmleri ile IL-1β genindeki +3954C/T polimorfizmi Polymerase Chain Reaction - Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR- RFLP) yöntemi ile, IL-10 genindeki -1082G/A polimorfizimi de Amplification Refractory Mutation System - Polymerase Chain Reaction (ARMS-PCR) yöntemi ile incelendi. Kalan 6 ml örnekten ise mononükleer hücre izolasyonu sonrası RNA ekstraksiyonu gerçekleştirilerek, immun cevabın negatif regülatörleri arasında bulunan A20, SOCS1, SOCS3, SIGIRR, ST2, TOLLIP, MKP1, IRAK-M gen ekspresyon düzeyleri kantitatif Real-Time PCR yöntemi ile incelendi.
Hastalarda negatif regülatörlerin ekspresyonlarının ST2, TOLLIP ve SIGIRR’de anlamlı derecede yükseldiği, IRAK-M ve MKP1’de ise azaldığı tespit edildi. Polimorfizmler tek başlarına TB ile ilişkilendirilemese de, negatif regülatörlerin ekspresyonları ile birlikte değerlendirildiklerinde daha da anlamlı ilişkiler belirlendi.
xii
Bildiğimiz kadarıyla, araştırmamız bu immün mediatörlerin birlikte değerlendirildiği ve TB’a duyarlılıkla ilişkilendirildiği ilk çalışmadır. Sonuç olarak, hızlı tanıya ek olarak konağa ait bu biyobelirteçlerin birlikte değerlendirilmesi ile TB immünpatogenezinin daha iyi anlaşılacağı, dolayısıyla çalışmamızın kontrol ve tedavi protokollerinin yeniden düzenlenmesine katkı sağlayacağı ve daha geniş populasyonlu sürveyans çalışmalarına ışık tutacağı kanaatindeyiz.
Anahtar Kelimeler: İmmün cevabın negatif regülatör genleri, IL-1β, IL-10, Moleküler yöntemler, Toll-Interacting Protein (TOLLIP), Tüberküloz.
xiii
ABSTRACT
Association of Toll-Interacting Protein (TOLLIP), IL-1β and IL-10 Gene Polymorphisms and Expression of Negative Regulators of
Human Innate Immune Response with Susceptibility to Tuberculosis
Tuberculosis (TB) is one of the leading causes of infectious death in humans worldwide, yet its immune pathogenesis remains incompletely understood. The innate immune response is critical for the initial host defense against mycobacteria. which regulate host immune response host immunogenetic risk factors. In this context, it has been proposed in few molecular studies that various polymorphisms of genes encoding the effectors such as IL-1β, a pro-inflammatory cytokine, and IL-10, an anti-inflammatory cytokine, and Toll-interacting protein (TOLLIP), one of mediators negatively regulating inflammatory response by interacting with Toll-Like Receptors (TLRs), and gene expression levels of negative regulators of immune response play an important role in the pathophysiology of TB and susceptibility to TB as well as in many chronic infections in different human populations. In our study, we aimed to research the association of these host risk factors with susceptibility to tuberculosis.
After the examination of sputum samples sent from Adana province to CU THAUM Regional Tuberculosis Laboratory between December, 2015 and December, 2017, 8 ml venous blood samples were collected in EDTA-containing tubes from the consecutive 50 TB patients and 50 TB-negative healthy controls.
After the DNA extraction from 2 ml of the samples, the rs5743899A/G and rs3750920C/T polymorphisms of the TOLLIP gene and the IL-1β +3954C/T polymorphism were investigated by using Polymerase Chain Reaction - Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP) assay, whereas the IL-10 -1082G/A polymorphism was examined by using Amplification Refractory Mutation System - Polymerase Chain Reaction (ARMS-PCR) assay.
After the isolation of mononuclear cells from the remaining 6 ml of the samples, RNA was extracted, and the gene expression levels of negative regulators of immune response such as A20, SOCS1, SOCS3, SIGIRR, ST2, TOLLIP, MKP1, IRAK-M were investigated by using quantitative Real-Time PCR assay.
The study will further reveal the importance of these markers for tuberculosis, and obtained data will shed light on the design of new vaccines and drugs. Besides, by genotyping the MTBC isolates, association of host factors with reactivation/reinfection will have been examined at the end of our study.
The expression of negative regulators significantly increased in ST2, TOLLIP ve SIGIR, while decreased in IRAK-M ve MKP1. Although the polymorphisms were not separately associated with TB, even more significant relationships were determined when evaluated together with the expressions of negative regulators.
xiv
As far as we know, our research is the first study in which these immune mediators are evaluated together and associated with sensitivity to TB. In conclusion, we assumed that, immunopathogenesis of TB will be better understood owing to the overall evaluation of these host biomarkers together in addition to the rapid diagnosis, therefore, our study will contribute to the reorganisation of control and treatment protocols and shed light on surveillance studies with wider populations.
Key Words: IL-1β, IL-10, Molecular methods, Negative regulator genes of immune response, Toll-Interacting Protein (TOLLIP), Tuberculosis.
1
1. GİRİŞ ve AMAÇ
Tüberküloz (TB), Mycobacterium tuberculosis kompleks (MTBK) adı verilen bir grup mikobakterinin sebep olduğu, dünya populasyonun yaklaşık üçte birinin infekte olduğu, halk sağlığını ciddi derecede tehdit etmeye devam eden, etkin tedavi seçenekleri bulunmasına rağmen dünya sıralamasında ölümlerin 9. etkeni olan, bireyleri, toplumları, sağlık sistemlerini ve ekonomiyi 130 yılı aşkın süredir etkilemeye devam eden, immunpatogenezi hala anlaşılamamış, bulaşıcı, nekrozitan bir hastalıktır. TB, Dünya Sağlık Örgütü (DSÖ) 2017 verilerine göre 2016 yılında 6.3 milyon yeni vaka 10.3 milyon insidans ile önemini günümüzde hala korumaya devam etmektedir1,2,3,4.
İnfeksiyon birkaç bakterinin bulunduğu küçük aerosol damlacıkların inhalasyonu ile bulaşmaktadır. Bulaş sonrası immün mediatörler devreye girerek dentritik hücreleri, polimorfonükleer lökositleri, miyeloid kökenli süpresör hücreleri, T ve B lenfositleri de içeren tip 1 interferon cevaba ek olarak, kemokinler ve sitokinlerin salgılanmasıyla konak immün yanıtı oluşur. Konağın tüm immün yanıtına rağmen infeksiyonun gerçekleşmesi TB basilinin patofizyolojisinin hala tam olarak anlaşılmadığını ortaya koymaktadır4.
Konağa ait immuno-genetik risk faktörlerinin birçok kronik infeksiyonda olduğu gibi tüberkülozun patofizyolojisinde ve tüberküloza yatkınlıkta da önemli bir rol oynadığı ileri sürülmüştür. Bu bağlamda moleküler düzeyde yapılan az sayıdaki çalışmada konağa ait immun cevabı regüle eden, Toll-interacting protein (TOLLIP), IL- 1β ve IL-10 gibi effektörleri kodlayan genlerdeki birçok polimorfizm ile immün cevabın negatif regülatörlerinin gen ekspresyon düzeylerinin farklı populasyonlarda tüberküloz hastalığının ortaya çıkışıyla ilişkili olduğu gösterilmiştir5.
Farklı negatif regülatör genlerin tüberküloza duyarlılıkla ilişkisini gösteren çalışmalar mevcuttur6. Pro-inflamatuvar ve anti-inflamatuvar faktörlerle birlikte mikroRNA (miRNA) gibi faktörlerin de TB’a duyarlılıkla ilişkisini gösteren birçok çalışma vardır. TOLLIP insanlarda 11. kromozomda kodlanan özellikle TLR2 ve TLR4 üzerinden etki göstererek pro-inflamatuvar cevabı anti-inflamatuvar cevaba dönüştürebilmektedir. Negatif regülatör TOLLIP’in rs5743899 ve rs3750920 iki polimorfizmi ile TOLLIP mRNA’sı veya TB ile ilişkisini gösteren birkaç çalışma
2
bulunmaktadır7. Bildiğimiz kadarıyla Dünyada bu faktörlerin tamamını TB’a duyarlılıkla ilişkisini ortaya koyan hiçbir çalışma bulunmamaktadır.
Bu çalışmada, klinik prognoz ve tüberküloza yatkınlıkta; Toll-Like Reseptörleri (TLRs) ile iletişime girerek inflamatuvar cevabı negatif yönde düzenleyen mekanizmalar arasında yer alan TOLLIP’in, monosit, makrofaj ve dentritik hücrelerde üretilen bir pro-inflamatuvar sitokin olan IL-1β’i ve T hücre fonksiyonu, MHC Class II ekspresyonu ve antijen spesifik proliferasyonu düzenleyen, güçlü bir IFNγ sentez inhibitörü olan anti-inflamatuvar sitokin IL-10’u kodlayan genlerdeki muhtemel mutasyonlar moleküler yöntemler ile sorgulandı. Ayrıca immun cevabın negatif regülatörlerinin gen ekspresyonu da kantitatif olarak tespit edildi.
3
2. GENEL BİLGİLER
2.1. Tüberküloz (TB) Hastalığı ve Kliniği
Doktor Robert Koch tarafından 1882 yılında keşfedilen, hareketsiz, sporsuz, zorunlu aerob, asite dirençli ve Mycobacterium tuberculosis kompleks (MTBK) adı verilen bir grup mikobakteri türünün sebep olduğu tüberküloz (TB) hastalığı, hava yolu ile bulaşan öncelikle düşük ve orta gelirli ülkelerde hala morbidite ve mortalitesi yüksek olarak devam eden ve hatta gelişmiş ülkelerde bile kendini hissettiren, her geçen gün önemini koruyan bir infeksiyon hastalığıdır4.
Mycobacterium tuberculosis kompleks; Mycobacterium tuberculosis (M.
tuberculosis), Mycobacterium bovis (M. bovis (M. bovis BCG)), Mycobacterium africanum (M. africanum), Mycobacterium pinnipedii (M. pinnipedii), Mycobacterium caprae (M. caprae), Mycobacterium canettii (M. canettii), Mycobacterium microti (M.
microti), Mycobacterium mungi (M. mungi), Mycobacterium orygis (M. orygis) türlerinin bulunduğu bir grup mikobakteri topluluğudur8,9,10,11,12
.
TB, tartışmasız en harabedici hastalıklardan birisidir. Tarih boyunca bu özelliğinden ötürü ince hastalık, verem, sıraca hastalığı, tüketim hastalığı, kralın kötülüğü, beyaz veba, beyaz ölüm, ölümlerin kaptanı gibi çeşitli isimlerle anılmıştır. Bu yüzden sürekli halk sağlığını tehdit etmeye devam etmiştir13,14.
En ölümcül bulaşıcı hastalıklardan biri olmaya devam eden TB dünya genelinde önemli bir sağlık problemidir15.
Mycobacterium tuberculosis evrimleşme yeteneğinde olan bir patojendir. En önemli özelliği konağın immonokompetansı olmasına rağmen konak dokularında latent olarak kalabilme yeteneğine sahip olmasıdır16,17,18. Bakteriyel savunma sistemi ile konak immün yanıt arasındaki denge devam ettiği zaman, M. tuberculosis ile infekte kişilerde %90-95 oranında hayatları boyunda latent kalabilir. Diğer taraftan infekte kişilerin %5-10'u yaşamlarının herhangi bir döneminde aktif TB hastalığına yakalanır19,20.
Tüberküloz infeksiyonu birçok farklı tipte görülebilir. Primer TB asemptomatik olabilir ve pozitif deri testi ile farkedilebilir. Bakteri inhalasyonunu takiben akciğerlerde primer kompleks gelişir ve genellikle kalsifikasyon formuyla karakterizedir21.
4
İnhalasyon sonrasında olguların %90-95’inde bakteriye karşı gelişen konak immün cevap bakterinin çoğalmasını sınırlandırabilme kapasitesindedir. Bu şekilde herhangi bir klinik belirti vermeden latent seyredebilmektedir. Olguların %5-10 aktif TB gelişebilmektedir21,22. Bu durum hastada öksürükle baş göstermekte ve bunu takiben kilo kaybı, gece terlemesi, ateş, dispine, lenfadenopati, eklem ağrısı gibi semptomlar gözlenmektedir23. Kavernöz dokuların oluşumu ile birlikte primer TB eksudatif bir seyir gösterebilir21.
Eksudatif seyir eklem ağrısı ve yüksek ateş ile birlikte plevral efüzyonu içerir.
Latent infeksiyon bireylerin %5-10’ununda aktif TB’ye dönüşebilir24. Ekstrapulmunar TB herhangi bir organı etkileyebilir ve servikal lenfadenit, plörezi, perikardit, synovit, menenjit ve deri veya kemikte de infeksiyona sebep olabilmektedir21,22.
Milier TB (dissemine TB), deri lezyonları, splenomegali, kişide huzursuzluk, kuru öksürük, gece terlemesi, yüksek ve sürekli bir ateş ile karakterizedir. Vakaların
%50’sinde menengit gelişebilir ve tedavi edilmezse yüksek mortaliteyle seyredebilir.
Üstelik bu şekilde seyireden hastalarda ateş, abdominal bölgede ağrı ile birlikte TB peritoniti de gelişebilir21. İnsanda M. tuberculosis’e çok benzer bir hastalığa sebep olan M. bovis infeksiyonu kontamine et yada süt ürünlerinin tüketimiyle bulaştığı için pulmonar lezyonlardan daha sık olarak non-pulmonar lezyonlar daha çok görülür24.
2.2. Epidemiyoloji
M. tuberculosis (MTB) en önemli insan patojenlerinden birisidir. Dünyanın farklı bölgelerinden izole edilen MTB’nin genomik sekanslarının son analizleri basilin 70.000 yıl önce Afrika’da ortaya çıktığını kanıtlar niteliktedir25.
Dünya nüfusunun yaklaşık 3’te 1’i yada 2 milyar insanın MTB ile infekte olduğu tahmin edilmektedir26.
Dünya sağlık örgütü (DSÖ) 2017 Raporu’una göre 2016 yılında TB, majör global halk sağlığı problemi olarak devam etmekte, her yıl yaklaşık 10 milyon kişi hastalığa yakalanmakta ve dünyadaki ölümlerin ilk 10 sebebinden biri olarak karşımıza çıkmaktadır24.
TB dünyada ölümlerin 9. Sebebidir. 2016 yılında Human Immunodeficiency Virüs/ Acquired Immunodeficiency Syndrome (HIV/AIDS) negatif kişiler arasından
5
TB’dan 1.3 milyon kişi hayatını kaybetmiştir. HIV pozitif kişiler arasından TB hastalığı nedeniyle hayatını kaybedenlerin sayısı ise 374.000’dir24.
TB mortalitesi yılda yaklaşık %3 oranında düşmektedir. TB insidansı ise her yıl
%2 oranında düşmektedir. Bu durumda 2020 yılına kadar ‘’End TB Strategy’nin ilk kilometretaşına erişmesi için her %4-5 oranında artması gerekmektedir24.
DSÖ’nün 2016 verilerine göre bütün dünyada çoklu ilaca dirençli-TB (ÇİD-TB) vaka sayısı 490.000’dir. Aynı kaynağa göre 110.000 vakanın da izoniazid (INH) duyarlı ancak rifampisin’e (RIF) dirençli olduğu bildirilmiştir. ÇİD-TB vakalarının en çok görüldüğü ülkeler ise, Çin, Hindistan ve Rusya’dır. Bu ülkelerde dünya nüfusunun
%47’si yaşamaktadır. Yine DSÖ verilerine göre; 2016 yılında 72 ülke tarafından 8014 Yaygın İlaç Dirençli Tüberküloz (YİD-TB) vakası rapor edilmiştir24.
2.2. Tüberküloz Hastalığının Bulaşı
M. tuberculosis, aktif pulmoner TB hastalığı olan bir kişiden aerosol damlacıkları yoluyla bulaşır. Maruziyet sonrasındaki ilk 2 yılda risk en fazladır27.
Damlacıklar içinde 1-5 μm çapında 1-10 arası TB basili bulunmaktadır. Bu damlacıklar birkaç saat havada kalabilir ve bu durumun sonucunda da solunumla alveollere erişebilir. Kızamık ve TB gibi infeksiyonlar tipik olarak damlacık yoluyla bulaşan infeksiyonlardır. TB hapşurma ya da öksürme yoluyla yüksek hızda çevreye bulaşır. Damlacıkları çevreleyen solunum sekresyonları TB basilinin dehidratasyon, oksijen yoksunluğu ve diğer çevresel streslerden zarar görmesini engeller.
Araştırmacılar TB basilinin aerosol yolla 6 saat boyunca hayatta kaldığını ortaya çıkarmışlardır28.
2.3. Patogenez ve İmmünite
TB infeksiyonu tipik olarak TB basilinin duyarlı konak tarafından inhalasyonuyla bulaşır. Basil damlacıklarla taşınır sıklıkla uç alveollerde boyutları küçük basiller özelleşmiş makrofajlar tarafından yutulur. Makrofajlar bu basilleri ortadan kaldırabilir. Bazı basiller hayatta kalırsa doğal immun yanıt başlatılır, hayatta kalan basiller makrofaj içerisinde sayılarını çoğaltmaya başlarlar ve daha sonra epitelyal hücrelere doğru göç etmeye başlarlar29.
6
TB basili lenfatik sistem ile lokal lenf nodlarına makrofajlar tarafından ve kan yoluyla da vücudun farklı bölgelerine yayılabilir bu şekilde diğer hücreleri infekte edebilir. Bu süreç sonucunda inflamatuvar cevap tetiklenir primer infeksiyon bölgesine nötrofil ve lenfosit gibi immun hücre elemanlarının kümeleşmesi ve göçü gerçekleşir.
Sonuç olarak; granülamatoz lezyonlar ya da ghon odakları oluşur30,31.
Şayet immün sistem infeksiyon karşısında savunmada başarısız olur ise, basil granülom içerisinde çoğalır ve sayısını arttırır ve bunun sonucu olarakta vakaların bazısında akciğerlerde kaviter formasyonlar ve nekroz sonucu hastalığın lokal yayılımı gerçekleşir. Eğer basil kan yolu ya da lenfatik sistem boyunca yayılırsa milier TB oluşabilir. Bu inflamatuar süreç aktif TB hastalarında görülen kilo kaybı, ateş, gece terlemesi, eklem ağrısı öksürük gibi tipik semptomların görülmesi ile sonuçlanır32.
Basilin ghon odağı içerisinde çoğalmaya başlaması konağın yaşı, immun sisteminin tepkisi, beslenme yetersizlikleri, alkol kullanımı, diyabet, Bacille Calmette- Guerin (BCG) ile immünizasyon, HIV/AIDS varlığının olup olmadığı gibi faktörlere bağlı olarak gerçekleşir33.
TB patojeni konağın savunma sistemini geçerek hayatta kalır ve konak organizmada replike olarak infeksiyonu başlatırlar34. Aynı şekilde kendilerini koruma stratejileri geliştirerek etkili anti-bakteriyal çevreden kaçma yetiside gösterebilirler.
Dentritik hücreler ve makrofajlar TB’a karşı ilk savunma sistemleri içinde yer almaktadır35,36,37. Dentritik hücreler infekte bakteriye karşı T hücre antijenlerini sunar ve kazanılmış immün cevabın başlamasını indüklerler38,39,40.
Makrofajlar mikroorganizmaya saldırır ve onu asidik ve hidrolitik bir çevre olan fagozomal bir çevreye maruz bırakır. Bunun sonucunda sinyal kaskad sistemleri tetiklenir ve sonuç olarak fagolizozomal füzyon gerçekleşmiş olur41. Epiteloid hücreler ve multinükleoid büyük hücrelerle birlikte makrofajlar ve T lenfositler immün cevabı bir süre regüle eder18,42,43. MTB infeksiyonu pro-inflamatuvar ve anti-inflamatuvar sitokinlerin üretimiyle karşı karşıya kalır. TNF-α, IFN-γ, IL-1β granulom fonksiyonunu korumasını sağlayan regülatörlerdendir. Fakat IL-10 inflamatuvar cevabın negatif regülatörlerinin başında gelmektedir44,45. TNF-α, granulom formasyonunun devamlılığında proinflamatuvar bir sitokin olarak görev alırken, IFN-γ antijen sunan bir promotor olup CD4+ T lenfositlerin ve/veya sitotoksit T lenfositlerin infeksiyon bölgesine göç etmesini dolayısıyla da mikobakterilerin yok edilmesini koordine eder.
7
IL-1β bir pro-inflamatuvar sitokin olup monosit makrofaj ve dentritik hücrelerden üretilir ve TB’a karşı konak immün yanıtta görev alır. MTB infeksiyonuna karşı cevapta IL-1 reseptör (IL-1R) aracılığıyla sinyal üretimini sağladığı bilinmektedir46. Pro-inflamatuvar cevabın aksine anti-inflamatuvar özelliğe sahip olan IL-10 sitokini MTB infeksiyonuna karşı makrofaj ve T hücreler tarafından üretilirler47.
IL-10, TNF-α expresyonunu downregüle ederek makrofajların fonksiyonunu azaltır ki bu T hücreler tarafından IFN-γ’nın üretiminin azalmasıyla sonuçlanır. Bunun sonucunda da MTB’in hayatta kalmasına yardım eder48.
Tüm bu sitokinler pattern-recognition receptors (PRRs) tarafından sentezlenen MTB moleküllerini tanır. Pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) ise mikroorganizma ile ilgili yapıları ifade etmektedir. Konak naif immün hücreler, PRRs olarak adlandırılan sitozolik reseptörler ve membran bağımlı reseptörler yardımıyla patojen istilasını algılayabilirler49. PRRs sadece bakteriyal orjinli molekülleri tespit etmekle kalmaz aynı zamanda immunomodülatör sitokin ve kemokinlerin üretimi ile sinyal yolaklarını tetikleyerek infekte basilin fagositoz sürecini de aktive eder50,51.
Toll-like reseptörler (TLRs) bakteri, virüs, mantar ve parazitten köken alan patojenle ilişkili moleküler şekilleri (PAMPs) tanıyan hücrelerdir. Lipoproteinler TLR1, TLR2 ve TLR6 tarafından tanınırken, çift iplikçikli RNA TLR3, lipopolisakkaritler (LPS) TLR4, flagellin TLR5, tek iplikçikli RNA TLR7 ve TLR8, DNA TLR9 tarafından tanınır52. TLR sinyal sistemi antimikrobiyal peptidlerin, kemokinlerin, inflamatuvar sitokinlerin sekresyonunu sağlar53. TLR ailesi içerisinde TLR2 ve TLR4 intaselüler bir patojen olan MTB’in tespitinden sorumlu olup bu sorumlulukta TLR2 kilit rol oynamaktadır54,55. TLR2 özellikle bakteriyal hücre duvar bileşenleri gibi yabancı partiküllere spesifik geniş bir substrat sunar ve bakteriyal orjinli lipopeptidlere ek olarak lipoteikoik asit gibi hücre elemanlarını da tanıma ve spesifik bir yanıt oluşturma özelliği göstermektedir50.TLR2 bu spesifik yanıt ile infeksiyona karşı immün reaksiyonun gerçekleşmesi ve MTB’un tespitinde primer bir role sahiptir. Ek olarak TLR2 bakterial otofajdan da sorumludur56. TLR4 lipopolisakkarit (LPS)’leri, hücre duvar lipitleri, glikoproteinleri ve protein sekresyonlarını tanımakla görevli hücrelerdir.
Buna ilaveten myeloid differentiation 88 (MyD88) orjinli sinyal yolakları da TLR4 stimülasyonu ile gerçekleşir57.
8 2.3.1. Bakteriye Ait Faktörler
Kompleks türleri içinde %98 oranında TB hastalığına sebep olan tür M.
tuberculosis’dir. M. tuberculosis’in H37Rv suşunun genom büyüklüğü 4.411.529 bp olup yaklaşık olarak 3.986 proteini kodlamaktadır (Şekil 2.1). Guanin ve sitozin (G+C) oranının %62-70 oluşu insanlık tarihi kadar eski bu bakteri grubunun ne derece kararlı bir yapıya sahip olduğunu göstermektedir58.
Şekil 2.1. M. tuberculosis H37Rv suşu genom.
İnhalasyon sonrası MTB siliyal epitelyal hücrelerinde bulunduğu üst solunum yollarındaki bariyerle karşılaşırlar. Bakteri bu bariyeri aştıktan sonra alveolar makrofajlarla karşılaşır. Daha sonra MTB’un erken tanınması için anahtar bir role sahip olan pro-inflamatuvar ve anti-inflamatuvar yanıtlar sergilenir58,59.Alveolar makrofajların efektör fonksiyonları nötrofiller tarafından modüle edilir. Nötrofillerin rolü hem bakterileri ortadan kaldırmak hemde immunopatolojik aktiviteleriyle bir kompleks oluşturmaktır.
MTB 6 kDa ağırlığında olan sekresyon sistem 1 (ESX1)-bağımlı erken sekrete edilen antijenik (early secretory antigenic target 6 (ESAT6)) proteinini kullanarak fagolizozomal füzyondan kaçışı kolaylaştırır50,60.
9 2.3.2. Konağa Ait Faktörler
İnflamasyon yolağının genetik regülasyonu birçok çalışmada değerlendirilmiş olup pro-inflamatuvar sitokin üretimi, otofaj proteinleri, C-tip lektin reseptörleri, TLR fonsiyonunun regülasyonu, TLR yolağındaki bileşenlerin polimorfizimleri ile mikobakteriyal infeksiyona yatkınlıkla ilişkileri gösterilmiştir7,61,62,63. MyD88 ya da IL- 1 receptor-associated kinase 4 (IRAK4), TLR sinyal yolağında merkezi bir göreve sahiptir. Dahası bazı genetik çalışmalar bu sinyal yolağının herhangi bir yerinde bulunan bir polimorfizmin sonucunda MTB ilaç dirençliliğinden de sorumlu olduğu gösterilmiştir. Monositlerde üretilen ve negatif bir regülatör olan toll interacting protein (TOLLIP)’de görülen rs5743854 noktasındaki mutasyonun Latent, pulmonar ve meningeal TB da yüksek risk faktörü olarak görmüştür64.
Mikobakteriyal antijenlere karşı cevapta interferon gama (IFNγ) bağımlı t hücrelerin rol aldığı gösterilmiştir. T hücre cevabı IFNγ’dan ziyade IL-10’un üretimi ile gerçekleşir. IL-10; TNF ve IFNγ’nın potansiyel etkisini minimize etmek için TH1 hücreler tarafından anti inflamatuvar cevapta rol almak üzere salındığı bilinmektedir.
CD4+ T hücreler içinde yer aldığı bilinen TH17 hücreleri de IFNγ mekanizmalarına katkı sağlamaktadır. Fakat IL-10 ve IL-17’nin IFNγ üretimi ile direk etkileşimi bilinmemektedir65.
2.4. Tanı
TB’un diğer respirator ya da non-respirator hastalıklara kıyasla klinik ve radyolojik bulguları farklıdır66. Pulmonar TB şüpheli hastadan en az 2 balgam örneği alınır ve yayma preparatlar şeklinde değerlendirilir67. Floresan mikroskobu ile konvensiyonel Erlich Ziehl-Neelsen (EZN) smear mikroskobuna kıyasla yüksek sensitivite düşük spesifite oranına sahiptir68. Yayma preparatlara ilaveten muayne materyalleri aynı zamanda kültüre de alınmalı ve daha sonra ilaç duyarlılık testlerine tabii tutulmak üzere saklanmalıdır. Ekstrapulmonar TB şüpheli hastalardan olabildiğince erken teşhiş alınmalı ve infeksiyon bölgesinden elde edilen materyal kültür ortamına inoküle edilmelidir.
MTBK üyeleri içerisinde yer alan türler diğer mikobakteri üyelerine nazaran daha yavaş bölünme sürelerine sahiptirler. 15-20 saat aralığında bölündükleri bilinin bu türler bu özelliklerinden ötürü yavaş üreyen mikobakteriler sınıfında yer
10
almaktadırlar69. Bu özelliklerinden dolayı standart kültür ortamında en erken 10-14 gün içerisinde pozitif sonuç verebilirler fakat kültür ortamında sıvı vasattaki (mycobacterium growth incubator tube-MGIT) negatiflik ancak 60 günün sonunda belli olurken, (lowenstain jensen-LJ) katı vasatta 42 güne kadar sonuçlanmaktadır70. MTBK üyelerinin hızlı identifikasyon testleri arasında ilk sırayı nükleik asit amplifikasyon testleri (NAAT) almaktadır. Birçok NAAT’leri TB’un laboratuvar temelli teşhisini sağlamaktadır. Buna ek olarak; başta rifampisin direnci olmak üzere birinci ve ikinci seçenek ilaç dirençliliklerinin hızlı tespitini de sağlamaktadır66. Referans standart olarak kullanılan kültür en azından smear pozitif örnekte yüksek spesifite ve sensitivite ile mikobakteri türlerini tespit etmektedir71,72. Fakat kültür izolasyonunun aksine NAAT’leri mikroorganizmanın tespitinde canlı olup olmadığını belirlemek için yeterli değildir. Xpert MTB/RIF, mikro kanallar aracılığıyla Real-Time PCR testinin gerçekleştirildiği bir testtir. 2 saat içerisinde RIF dirençliliğini tespit etmesine ilaveten MTBK üyelerinin DNA’sını tespit etme özelliğine sahiptir. Testin sensitivitesi %89 spesifitesi ise %99’dur71.
Smear pozitif kişilerde testin spesifitesi %98’iken smear negatif kişilerde ise spesifite %67’dir. Ekstrapulmanor TB’da farklı muayne materyallerinde farklı sensitivite oranları bulunmuştur73.
DSÖ yetişkinlerde, ÇİD-TB şüpheli çocuklarda ya da HIV-pozitif kişilerde konvensiyonel mikroskopi kültür ve ilaç duyarlılık testine nazaran ilk ve hızlı tanıda Xpert MTB/RIF testini tavsiye etmektedir74.
2.4.1. Moleküler Yöntemler
MTBK üyelerinin hızlı identifikasyon testleri arasında ilk sırayı nükleik asit amplifikasyon testleri (NAAT) almaktadır70. Birçok NAAT’leri TB’un laboratuvar temelli teşhisini sağlamaktadır. Buna ek olarak; başta rifampisin direnci olmak üzere birinci ve ikinci seçenek ilaç dirençliliklerinin hızlı tespitini de sağlamaktadır.(217) Referans standart olarak kullanılan kültür en azından smear pozitif örnekte yüksek spesifite ve sensitivite ile mikobakteri türlerini tespit etmektedir72,73. Fakat kültür izolasyonunun aksine NAAT’leri mikroorganizmanın tespitinde canlı olup olmadığını belirlemek için yeterli değildir. Xpert MTB/RIF, mikro kanallar aracılığıyla Real-Time PCR testinin gerçekleştirildiği bir testtir. 2 saat içerisinde RIF dirençliliğini tespit
11
etmesine ilaveten MTBK üyelerinin DNA’sını tespit etme özelliğine sahiptir. Testin sensitivitesi %89 spesifitesi ise %99’dur71. Smear pozitif kişilerde testin spesifitesi
%98’iken smear negatif kişilerde ise spesifite %67’dir. Ekstrapulmanor TB’da farklı muayne materyallerinde farklı sensitivite oranları bulunmuştur.
DSÖ yetişkinlerde, ÇİD-TB şüpheli çocuklarda ya da HIV-pozitif kişilerde konvensiyonel mikroskopi kültür ve ilaç duyarlılık testine nazaran ilk ve hızlı tanıda Xpert MTB/RIF testini tavsiye etmektedir. Moleküler yöntemler içerisinde in-house PCR’a ek olarak özellikle polimorfizimleri tespit etmede kullanılan PCR-RFLP, Amplification refractory mutation system - Polymerase Chain Reaction (ARMS-PCR) ve başta mRNA expresyonu olmak üzere ilaç duyarlılığının da tespitinde kullanılan kantitatif Real-Time PCR yöntemleri kullanılmaktadır73.
2.4.1.1 Polymerase Chain Reaction - Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP)
Genomda hastalığa yol açan mutasyonlara ve iyi huylu genetik varyasyonlara ek olarak fenotipi etkilemeyen yüzlerce polimorfizme de rastlanılmaktadır. Moleküler düzeyde polimorfizm kişiden kişiye nükleotid dizelerinin farklı Şekillerde bulunması demektir. Polimorfik bir gende varyant alleller bulunur. Bunlar genetik gösterge olarak kullanılabilirler. Polimorfizme genellikle genler arası bölgede veya protein kodlamayan gen içi dizelerde rastlanmaktadır. RFLP bir genetik varyanttır ve DNA’yı bir restriksiyon enzimi ile parçalara ayırarak incelenebilir. Eğer genetik varyant restriksiyon endonükleaz’ın kırma bölgesinde değişiklik yapmışsa (normal kırma bölgesi kaybolabilir veya yeni bir kırma bölgesi ortaya çıkmıs olabilir), restriksiyon parçalarının uzunluğu normalden farklı olacaktır75.
Restriksiyon endonükleazlar, çift iplikli DNA molekülünü spesifik dizelerden tanıyıp kesen enzimlerdir. DNA üzerindeki bu dizeler genellikle 4-6 baz çifti uzunluğundadır. Birbirinden çok az farklılık gösteren üç farklı sınıfı tanımlanmıştır.
Bunlar TipI, TipII ve TipIII’dür. TipII restriksiyon endonükleaz, kesme isleminde en sık kullanılan ve en önemli olanıdır76.
12
2.4.1.2 Amplification Refractory Mutation System Polymerase Chain Reaction - (ARMS-PCR)
ARMS – PCR tekniği ilk kez Newton ve arkadaşları tarafından keşfedilen single nükleotid polimorfizmleri (SNP) ve küçük delesyonları tespit etmeye yönelik geliştirilmiş bir yöntemdir. Bu teknik allele spesifik PCR sürecini içermektedir.
ARMS, DNA amplifikasyonunun içerisinde olduğu spesifik PCR primerler kullanma temeline dayanmaktadır. Bir ARMS reaksiyonunu takiben PCR ürününün oluşup oluşmadığı hedeflenen allelin var olup olmadığına bağlıdır. PCR protokolünü belirlerken insan genomik DNA’sında bir ya da daha fazla polimorfizmi tespit etmeye yönelik analizler gerçekleştirilir. Bir ARMS PCR bir tek polimorfizme yönelik olabilirken, mültipleks ARMS ise iki yada daha fazla polimorfizmi tespit etmektedir77.
2.4.1.3. Kantitatif Real-Time PCR
Son zamanlarda mRNA ekspresyonunun ölçüldüğü birçok yöntem kullanılmaya başlanmıştır. Bunlardan bazısı in situ hibridizasyon, cDNA array, revers trankriptaz polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR)’dır. Kantitatif Real-Time PCR sıklıkla sitokinlerin yüksek ya da düşük mRNA ekspresyon seviyelerinin tespiti için kullanılan bir yöntemdir. Bu yöntem kantitatif yöntemlerin en hassas ve en doğru sonucu verdiği bir yöntemdir78. PCR’un keşfinden sonra birçok yöntem tanımlanmıştır bunların içerisinde semikantitatif ve kantitatif RT-PCR yer alırken son olarak Real-Time PCR yöntemi geliştirilmiştir79.
Real-Time PCR yönteminin prensibi iki şekilde karşımıza çıkmaktadır.
Bunlardan birincisi; taq polimerazın 5’ 3’- ekzonükleaz etkisi, ikincisi ise;
oligonükleotid probe işaretlemedir.
Threshold cycle (Ct) Real-Time PCR’da amplifikasyonun hesaplanabilir ilk siklusuna karşılık gelmektedir. Bu yöntemle hedef alınan materyal, internal kontrol ve primerlerin optimizasyonu tamamen ayarlandığı için spesifiseti çok yüksektir80.
13 2.5. Tedavi, Korunma ve Kontrol
TB kültür pozitifliği tespit edilen tüm yetişkin ve çocuklarda minimum tedavi süresi 6 aydır. 6 aylık tedavi rejimi içerisinde başlangıçta ilk 2 ay isoniazid (INH), rifampisin (RIF), pirazinamid (PZA) ve etambutol (EMB) şeklinde belirlenmiştir4.Son zamanlarda yayınlanan klinik çalışmalarda yer alan sonuçlara göre pulmonar TB ile infekte HIV negatif hastalarda tedavinin ilk 2 ayını tamamladıktan sonra başlangıçta bulunan kaviter lezyonların radyolojik bulgularda görülmediği, klinik örneğin negatiflendiği gözlemlenmiştir.
Fakat HIV’le infekte hastada bu tedavi rejiminin HIV negatif hastaya nazaran beklenildiği gibi sonuçlanmadığı RIF dirençliliği ile ilişkili olarak yüksek nüks riskinin bulunduğu gözlemlenmiştir81.
14
3. GEREÇ ve YÖNTEM
3.1. Örneklerin Toplanması
Klinik prognoz ve tüberküloza yatkınlıkta; Toll-Like Reseptörleri (TLRs) ile iletişime girerek inflamatuvar cevabı negatif yönde düzenleyen mekanizmalar arasında yer alan Toll-interacting protein (TOLLIP)’i, bir pro-inflamatuvar sitokin olan IL-1β’i ve güçlü bir IFNγ sentez inhibitörü olan anti-inflamatuvar sitokin IL-10’u kodlayan genlerdeki muhtemel mutasyonların moleküler yöntemler ile sorgulanması ve immun cevabın negatif regülatörlerinin gen ekspresyonunun da Real-Time PCR ile kantitatif olarak tespit edilmesini hedef alan çalışmamıza; 01 Aralık 2015 – 01 Aralık 2017 tarihleri arasında ÇÜ THAUM ve Bölge Tüberküloz Laboratuvarı’na gönderilen örneklerden seçilen, fenotipik ve genotipik yöntemlerle tespit edilen ardışık 50 tüberküloz hastası, yine bu yöntemlerle tüberküloz olmadığı belirlenen 50 sağlıklı gönüllü dahil edildi.
3.1.1. Örnek Grupları
Adana Seyhan Devlet Hastanesi Gögüs Hastalıkları hastanesi (Çukurova Aşkım Tüfekçi Devlet Hastanesi) ve Balcalı Göğüs Hastalıkları Polikliği’ne 01 Aralık 2015 – 01 Aralık 2017 tarihleri arasında akciğer tüberkülozu şüphesi ile gönderilen hasta örnekleri, fenotipik ve genotipik olarak irdelenerek biri tüberküloz (TB) pozitif hasta diğeri TB negatif sağlıklı kontrol grubu olmak üzere iki grupta incelendi. Çalışmamızda iki grup şeklinde incelenen bireylerin; sistemik lupus eritematozus, romatoid artrit, kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH) ve akut astım hastalığı gibi otoümmin hastalığının bulunmadığı kişilerin klinik geçmişleriyle doğrulandı. Bu hastalıkları bulunan kişiler çalışma dışında tutuldu. Yine çalışmamıza dahil edilen kişilerin laboratuvar tanısını doğrulama adına kişilerden tekrar balgam örnekleri istendi.
Tüberküloz olup olmadığı belirlendikten sonra çalışmamızı gerçekleştirmek üzere hasta ve sağlıklı kişilerden 8 ml EDTA’lı tüplere venöz kan örnekleri alındı. Kan örnekleri alınan tüm bireylerin yaş ve cinsiyet bilgileri alındı ve bireylere aydınlatılmış onam formları imzalatıldı.
15 3.1.1.1. Hasta Grubu
Çalışmamızın hasta grubunu oluşturmak üzere; 01 Aralık 2015 – 01 Aralık 2017 tarihleri arasında Adana Seyhan Devlet Hastanesi Gögüs Hastalıkları (Çukurova Aşkım Tüfekçi Devlet Hastanesi) hastanesi tarafından laboratuvarımıza ARB (acid-resistant- bacilli)-pozitif tespit edilmiş olarak gönderilen ardışık örnekler dahil edildi. Daha sonra ARB pozitif bu örneklerin doğrulamasını yapma adına hastalardan tekrar balgam örnekleri alındı. ARB pozitiflikleri doğrulanan örneklerden kültür pozitif örnekler seçilerek tüberküloz etkeni Mycobacterium tuberculosis Kompleks (MTBK) suşlarını diğer ARB pozitif boyanan bakteriler ve tüberküloz dışı mikobakteri (TDM)’lerden ayırt etmek için fenotipik ayırıcı tanı testlerine tabi tutuldu. Bu testler sonucunda fenotipik olarak MTBK tespit edilen suşların DNA ekstraksiyonları gerçekleştirilerek genotipik olarak da tüberküloz olduğu doğrulandı. Hem fenotipik hemde genotipik yöntemlerle TB olduğu kesinleşen hastalardan çalışmamızı gerçekleştirmek üzere 8 ml EDTA’lı tüplere venöz kan örnekleri alındı. Bu şekilde laboratuvarımızda TB şüphesi götürmeyen pozitif ardışık 50 hasta örneği belirlendi ve çalışmamızın ilk grubunu oluşturdu.
3.1.1.2. Sağlıklı Kontrol Grubu
Çalışmamızın kontrol grubunu 01 Aralık 2015 – 01 Aralık 2017 tarihleri arasında Çukurova Üniversitesi Gögüs Hastalıkları Polikliniği’nden gönderilen, birinci grubun tasarlanmasında kullanılan fenotipik ve genotipik yöntemlere göre tüberküloz negatif olduğu belirlenen ve altta yatan başka bir hastalığı bulunmayan ardışık 50 sağlıklı kontrol birey oluşturdu.
3.2. Balgam Örneklerinde Mycobacterium tuberculosis Kompleks (MTBK) Tanısının Doğrulanması
Çalışmamızın örnekleri (balgam) direk ve teksif sonrası preparat yaymalarla mikroskobik olarak, BACTEC MGIT 960 otomatize sistemiyle sıvı, Löwenstein-Jensen (LJ) ile de katı besiyerlerine örneklerin ekimi yapılarak değerlendirildi. Kültür pozitif çıkan örnekler de tür düzeyinde MTBK ve tüberküloz dışı mikobakteri (TDM)’leri ayırt etmek üzere uygulanan p-nitro-α-asetilamino-β-hidroksi-propiofen (NAP) ve BD MGIT TBc Identification ((TBc ID) MPT64 kart) Test’leriyle fenotipik identifikasyonları
16
sonucu tüberküloz şüphesi götürmeyen hastalar şeklinde doğrulandı. Kültür pozitif örneklerin Mickle cihazı (The Mickle lab. Engeneering CO. LTD. Gomshall Surrey, UK) yardımıyla mekanik DNA ekstraksiyonu gerçekleştirildi. Hsp65 genine ait spesifik bölgeyi hedef alan TB11 ve TB12 primerleri kullanılarak mikobakteri pozitif tespit edilen örnekler arasından MTBK suşlarının identifikasyonu için de INS1 INS2 primerleri kullanılarak MTBK tanısı moleküler olarak da doğrulandı.
3.2.1. Fenotipik İncelemeler
Gruplarımızda bulunan hastaların balgam örnekleri laboratuvarımızın rutin işleyişine tabi tutularak doğrudan ve teksif sonrası mikroskopik olarak inceledikten sonra mikobakterilerin identifikasyonunda altın standart olarak kabul edilen kültür ortamında izolasyon için LJ besiyeri ve MGIT 960 otomatize sistemi kullanıldı. ARB’si negatif, sıvı ve katı besiyerlerinde herhangi bir üreme olmayan, klinik geçmişleriyle de korelasyon sağlanarak herhangi bir kronik hastalığı bulunmayan bireyler (sistemik lupus eritematozus, romatoid artrit, kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH) ve akut astım hastalığı gibi) negatif olarak kabul edilip çalışmanın ikinci grubuna dahil edildi. ARB ve kültür pozitif tespit edilen örneklerde MTBK türleri ve TDM türlerinin ayrımı için NAP testi ve İmmünokromatografik TB Ag MPT64 kart testleri kullanılarak fenotipik identifikasyonları yapıldı.
3.2.1.1. Direk ve Teksif Sonrası Mikroskopik İnceleme
Çalışmamızda yer alan örneklerin boyama işlemi; öncelikle hiçbir işlem yapılmaksızın doğrudan (direkt ARB boyama) ve dekontaminasyon–homojenizasyon ve konsantrasyon işleminden sonra (teksif sonrası ARB boyama) yayma preparatları hazırlanarak Ehrlich-Ziehl-Neelsen (EZN) yöntemiyle boyandı. Mikroskopta mavi zemin üzerinde pembe-kırmızı basiller görülmesiyle ARB-pozitif olarak kabul edildi.
Örneklerimiz bu şekilde tekrar mikroskopik olarak değerlendirilmiş oldu.
3.2.1.2. Kültür
Örnekler BACTEC MGIT 960 otomatize sistemine ve Löwenstein-Jensen (LJ) besiyerine ekim yapılarak MGIT için 42 gün, LJ için ise 60 boyunca 37 °C de inkübe edildi. Bu süre zarfının sonunda pozitif sonuç vermeyen örnekler negatif kabul
17
edilirken, pozitif sonuç veren örneklere ise; MTBK ve TDM ayrımı için NAP testi ve MPT64 kart testleri uygulandı (Çizelge 3.1).
Çizelge 3.1. NAP/p-NBA test sonucu ve immünokromatografik TB Ag Mpt64 kart test sonuçlarının birlikte değerlendirilmesi.
NAP/p-NBA Test Sonucu İmmünokromatografik TB Ag Mpt64Kart Test Sonucu Tek Çizgi (I) İki Çizgi (II)
Tek Tüp (I) Geçersiz MTBK
İki Tüp (II) TDM Koinfeksiyon
3.2.2. Moleküler İnceleme ile MTBK’nin Doğrulanması
ARB, kültür ve sonrasında NAP ve MPT64 kart testleri sonucuna göre fenotipik olarak mikobakteri tespit edilen kültür örnekleri, mikobakteri’lerin hsp65 genine ait spesifik bölgeyi hedef alan TB11 ve TB12 primerleri ve bu primerlerle mikobakteri pozitif tespit edilen örnekler arasından, MTBK suşların identifikasyonu için de INS1 INS2 primerleri kullanılarak moleküler olarak da MTBK tanısı doğrulandı.
3.2.2.1. DNA Ekstraksiyonu
DNA ekstraksiyonu için MICKLE cihazında mekanik ekstraksiyon protokolü uygulandı (Şekil 3.1).
Fenotipik olarak izole edilen MTBK kültüründen 0,5 ml alınarak 1,5 ml’lik mikrosantrifüj tüplerine koyuldu.
İşlemler aşağıdaki sıraya göre gerçekleştirildi:
1- Bakteri süspansiyonları 3000 g’de 5 dakika santrifüj edildi.
2- 1,5 ml’lik mikrosantrifüj tüplerine hasta barkot kayıtları yapıldı.
3- Santrifüj edilen örneğin süpernatant kısmının bir bölümü döküldü.
4- Daha sonra pastör pipetiyle pellet kısmından 0,5 ml alınıp ilgili hasta barkotun olduğu mikrosantrifüj tüpüne eklendi.
5- Önceden 80 °C’ye getirilmiş ısı bloğunda 30 dakika bekletildi.
6- Sonra örnekler 12700 rpm’de (15000 g (Eppendorf Soğutmalı Micro santrüfüj cihazı, GERMANY)) 15 dakika santrifüj edilip üsteki sıvı dikkatle döküldü.
7- Kalan pellet üzerine 500µl Tris-EDTA (TE) Buffer eklendi ve pipetaj işlemi yapıldı.
8- 12700 rpm (15000 g) 15 dakika santrifüj edilip üsteki sıvı dikkatle döküldü.
9- Pellet üzerine 250µl TE Buffer eklendi ve pipetaj yapıldı.
18
10- Pipetaj akabinde 100-150 hacimde cam boncuk eklenip 2 dakika Mickle cihazında mekanik işleme tabi tutuldu.
11- 12700 rpm’de (15000 g) 15 dakika santrifüj edildi.
12- Santrifüj işlemi akabinde üstte ki sıvı DNA olarak alındı.
13- -20 °C’de muhafaza edildi.
Şekil 3.1. Mickle cihazı.
3.2.2.2. Mikobakteri’lerin hsp65 Gen Bölgesinin Amplifikasyonu
Mikobakteri’lerin hsp65 genine ait 441 bp uzunluğundaki spesifik bölgeyi hedef
alan TB11 (5’-ACCAACGATGGTGTGTCCAT) ve TB12 (5’-
CTTGTCGAACCGCATACCCT) primerleri kullanılmıştır (Çizelge 3.2).
Amplifikasyon 10 mM Tris-HCl [pH 8.3], 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, herbir dNTP’den 200 μM, herbir primerden 25 pmol, 2.5 U Taq polymerase ve 5 mikrolitre kalıp DNA içeren toplam 50 mikrolitre PCR karışımında gerçekleştirilmiştir82 (Çizelge 3.2).
Amplifikasyon aşamaları aşağıdaki şekilde tamamlanmıştır:
94 oC’de 1 dak. - denaturasyon
60 oC’de 1 dak. - bağlanma (annealing) 45 döngü 72 oC’de 1 dak. - uzama (extension)
72 oC’de 10 dak. - son uzama (extension)
3.2.2.3. Mikobakteri’lerin IS6110 Gen Bölgesinin Amplifikasyonu
MTBK türlerinin IS6110 genine ait 245 bp uzunluğundaki spesifik bölgeyi hedef
alan INS1 (5’-CGTGAGGGCATCGAGGTGGC) ve INS2 (5’-
GCGTAGGCGTCGGTGACAAA) primerleri kullanılmıştır (Çizelge 3.2).
Amplifikasyon 10 mM Tris-HCl [pH 8.3], 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, herbir
19
dNTP’den 200 μM, herbir primerden 25 pmol, 2.5 U Taq polymerase ve 5 mikrolitre kalıp DNA içeren toplam 50 mikrolitre (µl) PCR karışımında gerçekleştirilmiştir83 (Çizelge 3.2).
Amplifikasyon aşamaları aşağıdaki şekilde tamamlanmıştır:
94 oC’de 5 dak. – ilk denaturasyon 94 oC’de 1 dak. - denaturasyon
63 oC’de 1 dak. - bağlanma (annealing) 30 döngü 72 oC’de 1 dak. - uzama (extension)
72 oC’de 7 dak. - son uzama (extension)
Çizelge 3.2. Moleküler doğrulama için kullanılan primerler.
Hedef Gen Bölgesi
Primer
Adı Primer Baz Dizilimi Amplikon
Uzunluğu
Pozitif Sonuçların Yorumlanması
HSP65 TB11
TB12
ACCAACGATGGTGTGTCCAT
CTTGTCGAACCGCATACCCT 441 bp
Mycobacterium cinsi bakterilerin varlığını tespit eder
IS6110 INS1 INS2
CGTGAGGGCATCGAGGTGGC
GCGTAGGCGTCGGTGACAAA 245 bp MTBK* varlığını tespit eder
* MTBK: Mycobacterium tuberculosis kompleks.
3.3. Kan Örneklerinde Konağa Ait Faktörlerin İncelenmesi
Çalışmamızda sağlıklı ve TB hastası bireylerin fenotipik ve genotipik yöntemlerle doğrulanmasının ardından konağa ait faktörleri incelemek üzere çalışmamızın gruplarında bulunan bireylerden EDTA’lı tüplere 8 ml kan örneği alındı.
Alınan 8 ml’lik kan örneğinin 2 ml’sinden DNA izolasyonu gerçekleştirilerek Toll-interacting Protein (TOLLIP) ve IL-1β kodlayan genlerdeki polimorfizmler Polymerase Chain Reaction - Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP) yöntemi ile, IL-10 kodlayan gendeki polimorfizm ise Amplification Refractory Mutation System Polymerase Chain Reaction (ARMS-PCR) yöntemi kullanılarak araştırıldı.
Kan örneğinin 6 ml’sinden ise mononükleer hücre izolasyonu sonrası RNA ekstraksiyonu gerçekleştirilerek immun cevabın negatif regülatörleri arasında bulunan
20
A20, SOCS1, SOCS3, SIGIRR, ST2, TOLLIP, MKP1, IRAK-M mRNA gen ekspresyonları kantitatif Real-Time PCR yöntemi ile incelendi.
3.3.1. Polimorfizmlerin İncelenmesi
Sağlıklı ve TB hastası bireylerin EDTA’lı tüplere alınan 8 ml’lik kan örneklerinin 2 ml’sinden TOLLIP, IL-1β ve IL-10’daki polimorfizmleri incelemek üzere DNA izolasyonu yapıldı. İzolasyon QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) ile üretici firmanın önerileri doğrultusunda aşağıdaki gibi uygulandı84.
İzolasyon sonrası DNA ölçümleri NanoDrop ND-1000 cihazı ile yapıldı.
(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) ölçümler sonucunda DNA miktarı ve saflığının OD 260/280, değer aralığına göre 1.7-1.9 arasında çıkan örnekler çalışmaya dahil edildi (Şekil 3.2).
Kan örneklerinden DNA izolasyonu;
1- 1,5 ml’lik mikro santrifüj tüpüne 200 µl tam kan koyuldu.
2- Daha sonra bu tam kanın üzerine 20 µl proteinaz K eklendi.
3- Sonra 200 µl Buffer AL eklenip 15 saniye vortekslendi.
4- Bu karışım önceden ayarlanmış 56 °C’de 10 dakika inkübe edildi.
5- Bu süre sonunda kapağa buharlaşan sıvı için mini spin attırıldı.
6- Daha sonra 200 µl %100’lük etanol eklendi ve 15 saniye vortekslendi.
7- Sonra karışım QIAamp mini spin kolona aktarıldı.
8- Karışım 8000 rpm’de 1 dakika santrifüj edildi.
9- Alttaki sıvı döküldü ve toplama tüpü tekrar takıldı.
10- Sonra 500 µl Wash Buffer 1 (AW1) eklendi ve 8000 rpm’de 1 dakika santrifüj edildi.
11- Alttaki sıvı döküldü ve toplama tüpü tekrar takıldı.
12- Daha sonra 500 µl Wash Buffer 2 (AW2) eklendi ve 14000 rpm’de 3 dakika santrifüj edildi.
13- Alttaki sıvı döküldü ve toplama tüpü tekrar takıldı.
14- Yine 14000 rpm’de 1 dakika boş santifüj edildi.
15- Alttaki tüp atılıp temiz 1,5 ml’lik mikro santrifüj tüp takıldı.
21
16- Son olarak; 200 µl Eloution Buffer eklendi ve oda ısısında 1 dakika inkübe edildi. Sonra 8000 rpm’de 1 dakika santrifüj edildi.
17- Alttaki sıvı DNA olarak -80 °C’de saklandı.
3.3.1.1. Polymerase Chain Reaction - Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP) Yöntemiyle Toll-interacting Protein (TOLLIP)’in Yaygın Single Nükleotid Polimorfizm (SNP)’lerinin Tespiti Sağlıklı ve hasta bireylerin örneklerini incelenmek üzere; yaygın olarak çalışılmış ve konakta TB hastalığına karşı yatkınlıkla ilişkilendirilmiş Toll Like Reseptör (TLR) ailesinin negatif düzenleyicisi olarak bilinen, anti-inflamatuvar cevapta rol oynayan TOLLIP’in; rs5743899A/G mutasyonunun tespiti için Hha I enzimi ve rs3750920C/T mutasyonu için ise; Msp I enzimleri kullanılarak PCR-RFLP moleküler yöntemiyle muhtemel mutasyonlar tespit edildi.
TOLLIP’in; rs5743899 bölgesi için,
Forward: 5’-GGC AAT GGC AGT GGC CAC CAG TGA-3’
Reverse: 5’-CCG ATG CCC GCA CAC CTG TGT GAT-3’ şeklinde iken TOLLIP’in; rs3750920 bölgesi için ise;
Forward: 5’-AGG CGT GCA GCT CAC CGC GTA GGA-3’
Reverse: 5’-GAG AGC CTT CTC CAT GGA CGA CCG C-3’ primerleri kullanılarak PCR amplifikasyonları gerçekleştirildi.
Öncelikle her iki polimorfizmi incelemek üzere 2 ayrı PCR karışımı hazırlandı.
PCR karışımı 2 mmol/L MgCl2, 0.2 pmol/L forward ve reverse primerlerden, herbir dNTP’den 40 μmol/L, 50 ng DNA ve 2 U taq polimeraz 500 mmol/L KCL ve 100 mol/L Tris-HCL(pH: 8.3) şeklinde hazırlandı. Her iki polimorfizm için PCR amplifikasyon döngüsü aşağıdaki şekilde belirtildiği gibi uygulandı;
95 oC’de 5 dak. – ilk denaturasyon 95 oC’de 15 sn. - denaturasyon
62 oC’de 15 sn. - bağlanma (annealing) 40 döngü 72 oC’de 30 sn. - uzama (extension)
72 oC’de 7 dak. - son uzama (extension)
22
3.3.1.1.1. TOLLİP’in rs5743899a/G Mutasyonunu Tespit Etmek İçin Hha I Enzimi ile Kesme İşlemi
TOLLİP’in rs5743899 bölgesi 279 bp’de GelCompar II yazılım sistemiyle görüntülendi. Akabinde enzimle kesme işlemi gerçekleştirildi. Enzimle kesme işleminin sonrasında ‘’G’’ allelinin varlığında 279 bp’lik bölgenin 125, 93 ve 61 bp’lik bölgeler halinde ayrıldığı görülürken, ‘’A’’ allelinin varlığında ise 279 bp’lik bölgenin 218 ve 61 bp olarak ayrıldığı görüntülendi.
Hha I enzimi ile kesme işlemi aşağıda belirtildiği gibi gerçekleştirildi85. 1- Aşağıdaki karışım hazırlandı.
Su 18 μl
10X Buffer 2 μl
Hhal 1 μl
Amplikon 10 μl
2- Karışım daha sonra 37 oC’de bir gece inkübe edildi.
3- %3’lük Agaroz jel elektroforez ile örnekler görüntülendi.
3.3.1.1.2. TOLLİP’in rs3750920C/T Polimofizm İçin Msp I Enzimi ile Kesme İşlemi
TOLLİP’in rs3750920 bölgesi 169 bp’de GelCompar II yazılım sistemiyle görüntülendi. Akabinde enzimle kesme işlemi gerçekleştirildi. Enzimle kesme işleminin sonrasında ‘’T’’ allelinin varlığında 169 bp’lik bölgenin 117 ve 52 bp’lik bölgeler halinde ayrıldığı görülürken, ‘’C’’ allelinin varlığında ise 169 bp’lik bölgenin ayrılmadığı görüntülendi.
Msp I enzimiyle kesme işlemi aşağıda belirtildiği gibi gerçekleştirildi86. Aşağıdaki karışım hazırlandı.
Su 18 μl
10X Buffer 2 μl
Msp I 1 μl
Amplikon 10 μl
1- Karışım daha sonra 37 oC’de bir gece inkübe edildi.
2- %3’lük Agaroz jel elektroforez ile örnekler görüntülendi.