Matriks Metalloproteinazların Endojen İnhibitörleri

MMP aktivitesi iki ana endojen inhibitör tarafından regüle edilir. alfa2 -makroglobulin ve doku metalloproteinaz inhibitörleri (TIMP). alfa2-makroglobulin birçok proteazı içine hapsederek inhibe eder. Kompleks, hızlıca reseptör aracılı endositoz ile temizlenir. Sıvı fazdaki MMP aktivitesi primer olarak n2-makroglobulin tarafından regüle edilir (115).

Doku metalloproteinaz inhibitörleri (TIMP-1, -2, -3 ve -4), N-terminal ve C-terminal alt bölgelerinden oluşurlar. N- C-terminalin MMP inhibitör özelliği vardır.

TIMP'ler MMP'lerin aktif bölgelerine bağlanarak matriks subsratlarına bağlanmasını engellerler. TIMP-4 miyokardiyal dokuda yüksek oranda eksprese edilir ve kardiyak inhibitör adını almıştır (CIMP) (116). TIMP'lerin MMP inhibitör özelliklerinden bağımsız olarak antiapoptotik, steroidojenik ve antianjiyojenik aktivitelerinin de olduğu bildirilmiştir. TIMP-1 ve TIMP-2'nin in vitro çalışmalarda fibroblast gelişimini indüklediği, özellikle TIMP-2'nin fibroblastların kollajen üretimini uyardığı gösterilmiştir (117).

2.4.3.2.3.Matrisellüler Proteinler Ve MMP’lerle Etkileşimleri

Matrisellüler proteinler, hücre-matriks etkileşimlerine aracılık eden ve kardiyak stres sırasında ekspresyonları artan proteinlerdir. En iyi tanımlanmış olanları osteopontin (OPN) ve trombospondin 2 (TSP) dir. Osteopontin normal embriyojenik gelişimde yüksek miktarda eksprese edilen, ancak normal fizyolojik koşullarda yetişkindeki ekspresyonu oldukça düşük olan bir moleküldür. Osteopontinin enfarktüs sonrası görevi henüz netleşmemiştir, ancak miyokard enfarktüsü sonrası seviyelerinin hızlı bir yükseliş gösterdiği bilinmektedir (118). MMP aktivitesini miyokardda inhibe ettiği (119), nonkardiyak dokularda ise aktive ettiği (120) yönünde çalışmalar vardır.

Trombospondin (TSP) 2, hücre zarı üzerinde, sinyal moleküllerin, membran proteinleri ile temas ettiği noktalarda görev alır. Pro-MMP-2 ve MMP-2 yi bağlar ve oluşan kompleks reseptör aracılı endositozla ortadan kaldırılır (121). TSP 2 den yoksun farelerde MMP 2 seviyelerinin belirgin şekilde arttığı gösterilmiştir (122). TSP 2 nin normal koşullarda basınç yüküne karşı adaptif cevapta önemli olduğu ancak yüksek

35

seviyelerin persistansının progresif sol kalp yetersizliğine katkı sağladığı yorumu yapılmıştır.(123)

ŞEKİL 6 : MMP’ler İçin Hücre Yüzeyi İle İliskili Aktivasyon Kaskadı (Beaudeux JL 2004’ten modifiye edilmistir).

2.4.3.2.4 Miyokardiyal MMP Substratları

İnterstisyel kollajenaz (MMP-1), nötrofil kollajenaz (MMP-8) ve kollajenaz-3 (MMP-13) fibrile kollajenlere, agrekan, perlikan, versikan ve proteoglikanlara yüksek substrat spesifitesine sahiptirler. Jelatinazlar (MMP-2 ve MMP-9) yüksek substrat spesifitesine sahip oldukları denatüre fibriler kollajen ile tip IV kollajen, fibronektin ve laminin gibi bazal membran proteinlerinin yanı sıra elastin ve proteoglikanlara karşı da proteolitik aktivite gösterirler. Stromelizin (MMP-3) ise tüm bazal membran proteinlerine, elastin ve proteoglikanlara karşı etkilidir. Hemopeksin bölgesi

36

olmadığından MMP-7 nin substrat selektivitesi yoktur. Bir diğer geniş spektrumlu substrat grubuna etkili MMP ise membran bağımlı MMP lerdir.

ŞEKİL 7 : MMP Enzim Aktivitesinin Düzenlenmesi (Dollery CM 1995’ten modifiye edilmistir).

MMP ler yapısal proteinler üzerine olduğu kadar pro-MMP ler üzerine de etkilidir.

Örneğin MMP-3 varlığında pro-MMP-1 in MMP-1 e çevriminin 12 kat arttığı, MT1-MMP nin pro-MT1-MMP-2 yi aktive ettiği gösterilmiştir (124, 125). MT1-MMPlerin, sitokinleri, biyoaktif peptitleri ve büyüme faktörlerini de yıkabileceği gösterilmiştir. Örneğin, MT1-MMP ve MMP-7 nin membran bağlı TNF-a'yı çözünür bir forma çevirebildiği (126), yine MMP'lerin işlemesiyle VEGF'nin etkilerini modüle eden anjiyostatin adlı bir molekülün oluşabileceği gösterilmiştir (127).

2.4.3.2.5.Matriks Metalloproteinazların Transkripsiyonel Regulasyonu

Biyolojik ve/veya mekanik uyaranları takiben hücre içinde gelişen bir seri olay transkripsiyon faktörlerinin oluşumu ile sonuçlanır. Bu faktörler MMP genlerinin

37

promoter bölgelerine bağlanır ve transkripsiyonu başlatırlar. Transkripsiyon, birtakım biyoaktif moleküller, sitokinler ve matriselüler proteinlerce modifiye edilebilir.

Anjiyotensin II nin remodeling üzerine belirgin etkileri vardır. Anjiyotensin II reseptör aktivasyonu, Janus kinaz-sinyal transduserlerinin indüksiyonuna ve transkripsiyon (JAK-STAT) yolaklarının aktivasyonuna neden olarak MMP seviyelerinde bir artışa neden olur (109). Makrofajlarca üretilen ANG II otokrin etki ile NADPH oksidaz aktivitesini ve reaktif oksijen ürünleri üretimini artırır (128). Yapılan çalışmalarda, izole kardiyak miyositler sabit bir anjiyotensin II (ANG II) konsantrasyonuna maruz bırakıldığında, MMP-2 seviyelerinde belirgin bir artış olduğu gösterilmiştir (129). Hayvan deneylerinde (ANG II) stimulasyonu ile stoplazmik NF-KB nin hücre çekirdeğine mobilizasyonunun arttığı ve MMP-9 transkripsiyonunu artırdığı gözlenmiştir (130). ANG II reseptör aktivasyonunun TGF yi uyardığı, TGF nin ise MMP transkripsiyonu ve kollajen döngüsü üzerinde birçok farklı etkisinin olduğu da bilinmektedir (131). Suzuki ve ark. köpeklerde yaptıkları çalışma ile aldosteron antagonistleri ile MMP-2 ve 9 seviyelerinin düşürülebildiğini göstermişlerdir (132). Bir başka çalışma da, fare miyosit kültürlerinde aldosteron stimulasyonu ile MMP-2 ve 9 seviyelerinin artırıldığını göstermiştir (133). Ancak, MMP prometer alanında bir hormon cevap elementi henüz bulunmamıştır (134). ANG II ve aldosteronun MMP transkripsiyonunu ne derece ve hangi mekanizmalarla etkilediği halen araştırma konusudur.

Endotelin (ET) de yeniden şekillenme üzerine etkisi bilinen bir moleküldür. ET reseptör aktivasyonu sonrası protein kinaz C aktive olur ve c-Jun, GATA-4 gibi transkripsiyon faktörlerinin aktivasyonuna neden olur. ET'nin, vasküler endotel hücre kültürlerinde MMP-1, kardiyak miyosit preparatlarında ise MT1-MMP seviyelerini artırdığı gösterilmiştir (129,135).

Kalp yetersizliğinde yükselen norepinefrin seviyelerinin de a ve P reseptör yolakları üzerinden doğrudan MMP transkripsiyonunu artırabileceği gösterilmiştir (129,136). Sitokin stimulasyonu ve MMP transkripsiyonu arasında da net bir ilişki olduğunu gösteren çalışmalar yapılmıştır. Kardiyak fibroblast kültürlerinde yapılan

38

çalışmalarda TNF-a ve IL-1P stimulasyonu ile MMP-2 ve MMP-9 seviyelerinin arttığı (137,138) yine IL-1P stimulasyonu ile MMP-1 seviyesinin arttığı gösterilmiştir (139).

Profibrotik bir molekül olarak bilinen TGF'nin MMP transkripsiyonunu inhibe etmesi beklenir ve bunu destekler çalışmalar bulunmaktadır (140). Ancak, daha sonra bu molekülün ikili bir etki mekanizması olduğu, örneğin MMP-1 seviyelerini düşürürken, MMP-13 seviyelerini artırabildiği gösterilmiştir (141).

Ekstraselüler matriks metalloproteinaz indükleyici protein (EMMPRIN) olarak bilinen molekülün özellikle tümör invazyonu ve metastazında rol oynadığı, miyokarddaki seviyelerinin ise dilate kardiyomiyopatililerde belirgin biçimde arttığı gösterilmiştir (142). EMMPRIN in vasküler düz kas hücre kültürlerinde MMP indüksiyonu yaptığı gösterilmiştir(143).

Oksidatif stres ve reaktif oksijen ürünleri (ROS), hem pro-MMP leri posttranslasyonel modifikasyonu ile aktif forma çevirerek, hem de yeni transkripsiyon komplekslerinin oluşumunu sağlayarak, MMP seviyelerini etkileyebilirler. ROS, NF-KB yi aktive eder, stoplazmadan nukleusa geçişini artırır (144). NF-NF-KB, MMP transkripsiyonunun yanı sıra, TNF-a ve IL gibi birçok enflamatuar mediatörün üretimini de artırır (145). İskemi reperfüzyon hasarı ve kardiyak cerrahi sonrası oluşan ROS seviyeleri ile MMP seviyeleri arasında doğrudan ilişki olduğunu gösteren çalışmalar vardır (146, 147). Yine, in vitro çalışmalarla, endotel hücrelerinin ve fibroblastların hidrojen perokside maruz kaldıklarında, MMP seviyelerinde artış olduğu gösterilmiştir (148-149).

Mekanik uyaranların da doğrudan MMP seviyelerini etkileyebileceğini gösteren çalışmalar vardır. Dinamik gerilim kuvveti uygulanan bir hücre kültürü sisteminde, birçok MMP tipi için zamana bağımlı olarak m RNA seviyelerinde artış saptanmıştır (150). Endotel ve vasküler düz kas hücre preparatlarında siklik gerilimin MMP-2 indüksiyonuna neden olduğu gösterilmiştir (151,152).

39

2.4.3.2.6 Matriks Metalloproteinazların Posttranslasyonel Modifikasyonu

Pro-MMP2lerin posttranslasyonel modifikasyonu sonucu aktif formlar oluşabilir. Miyeloperoksidazın MMP katalitik alanında transformasyonel bir değişim yaparak aktif formlar üretebildiği ispatlanmıştır (153). Kardiyak yeniden şekillenme esnasında yüksek oranda eksprese olan MT1-MMP'nin de iskemi reperfüzyon sonrasında aktivitesinin arttığını ve bir dizi posttranslasyonel işlemin MT1-MMP in stabilite ve çevrimini etkilediği gösterilmiştir (154, 155).

Klinik çalışmalarda kalp yetersizliği hastalarında plazma MMP seviyelerinin, özellikle MMP-9 seviyesinin arttığı gösterilmiştir (156, 157, 158). Plazma seviyelerindeki bu artış, ekspresyonu artmış miyokardiyal enzim seviyelerinin dolaşıma yansıması, ya da kalbin yeniden şekillenmesine verilen sistemik yanıtla ilişkilendirilmiştir. Kandaki MMP seviyelerinin kalp yetersizliği progresyonu ile ilişkili olduğu gösterilmiştir (159,160).

Kalp yetersizliği hastalarında plazma MMP seviyelerini yetmezlik gelişmemiş hastalardaki seviyelerle karşılaştıran çalışmalarda ağırlıklı olarak MMP-2 ve 9 çalışılmıştır. Ohtsuka ve ark. idiyopatik KMP hastalarında plazma MMP-1, MMP-9 ve TNF seviyelerini yüksek bulmuş, MMP-9 seviyelerinin TNF-a seviyeleri ile korele olduğu göstermişlerdir (161). Bir diğer çalışmada da, kalp yetersizlikli hastaların plazma MMP-2 ve 9 seviyelerinin normalden yüksek olduğu gösterilmiştir (162).

Plazma MMP-9 seviyelerinin sol ventrikül volüm ve ejeksiyon fraksiyonu ile olan ilişkisini inceleyen bir çalışmada, plazma MMP-9 seviyelerinin düşük EF ve yüksek sistol sonu volümlerle (ESV) ilişkili olduğu gösterilmiştir. (163)

2.4.3.3..Kollojenler ve Prokollajen Tip1 [Prokollajen I-C Terminal (PICP) Ve Prokollajen I-N Terminal (PINP)]

Kollagen vücutta en çok bulunan proteinlerden (glikoprotein) biridir.

Dokularda en az 12 farklı formda kollagen bulunduğu bildirilmekte ise de , bugün için özellikleri açıkca tanımlanmış 5 tip kollagen maddesi bilinmektedir. Bunların hepsininde ana ögesi tropokollagen adlı maddedir.

40

Kollagenez = kollagen sentezi:

Kollagen sentezleyen hücreler: En önemlileri ; fibroblastlar, kondroblastlar, osteoblastlar. Kollagen sentezıyle ilgili en çok kullanılan amino asitler: glisin, prolin, aspartic acid, hidroksiprolin, hidroksilizin, arginin, leucine. Sentezde kullanılan amino asit çeşitine bağlı olarak farklı tiplerde kollagenler ortaya çıkar. İlgili hücre poliribozom’larında bir araya getirilen adı geçen amino asitler preprokollagen molekülleri halinde birleştirilir ve gER içine enjekte edilirler. Preprokollagen üçlü sarmal halindedir ve uçlarından işaretleyici peptidlerle sabitlenmişlerdir.

GER içinde preprokollegen’in işaretleyici uçları koparılıp ayrılır ve prokollagen’e dönüştürülür. Ayrıca bunlara burada karbonhidratlarda eklenir.

Prokollagen gER + Golgi içinde , prolin hidroksilaz ve lizin hidroksilaz enzimlerinin etkisiyle hidroksilasyon ve glikolizasyon işlemlerinden geçirilir (bu işlemler için kofaktör olarak askorbik asit (Vit. C) gerekir, yetersiz yara iyileşmeleri C vitamini eksikliği ile oluşan iskorbitin özelliğidir). Bu işlemler prokollagen’in hücre içinde polymerize olmasını önler.

Prokollagen Golgi’den hücre dışı ortama verilir. Matriks içindeki prokollagen peptidaz adlı özel enzimler ; prokollagen’in polymerize olmasını önleyen peptidleri ( registrasyon peptidleri) ortadan kaldırır. Bu değiştirilmiş protein tropokollagen adını alır ve polymerize olarak iplikcik’lere dönüşür. İplikcikler de birbirleriyle birleşerek iplik’leri oluşturur

Bu 5 tip kollagen ipliğin özellikleri şöyle sıralanabilir:

Tip I kollagen: Dermis, kemik, diş, tendo, ligament,kalbin fibröz yapısı , fibröz kıkırdak ve organ kapsüllerinde bulunur. Yerine göre iplikler halinde veya demetler teşkil etmiş olabilir. Her iplik farklı sayıda iplikcikten oluşur, iplikler de birleşerek demetler ( bantlar) yaparlar. Tip I kollagen iplik demetleri 1-20 mikron çapında olabilir, uzunlukları ise farklıdır. Demetler birbirleriyle anastomozlaşabilir, enine bantlaşma gösterirler.

Tip II kollagen: Hyalin ve elastik kıkırdakta, nucleus pulposus'ta, vitreus humor'da bulunur. Küçük çaplı iplikcik bantları oluştururlar, demetleşme göstermezler. İplikcikler enine bantlaşma gösterirler.

41

Tip III kollagen: Fötal deri, bazal membranlar, düz kas dokusu, vasküler yapılar , yara iyileşme yerleri ve kemik iliği, dalak , lenf düğümleri gibi organların stromasında bulunur. Küçük çaplı bantlar yaparlar, büyük demetler yapmazlar. Bu tür kollagene aynı zamanda retikülin iplikleri de denir.

Tip IV kollagen: Bazal membranın bazal lamina katında bulunur. Unpolimerize veya hafifce polimerize tropokollagen moleküllerinden oluşur. Sadece birkaç veya hiç iplikcik oluşur, iplik oluşmaz, enine bantlaşma göstermez.

Tip V kollagen: Plasenta'daki bazal membranlarda ve az da olsa vasküler oluşumlarda bulunur. Bazal membranı alttaki stromaya bağlayan çapa iplikciklerini yaparlar. Enine bantlaşma göstermez.

Diğer kollagenler;

Tip VI kollagen: Böbrek, karaciğer, uterus bağ dokusu, göz korneasında bulunmuştur.

Tip VII kollagen: Deride, dermis-epidermis birleşme yerinde bulunduğu, tip I ve tip III kollagenler etrafında ilmek oluşturduğu bildirilmektedir.

Tip VIII kollagen: Aortun endotel hücreleri tarafından salgılandığı (endotelyal kollagen) , kornea epitelinin bazal laminasını oluşturduğu bildirilmektedir.

Tip IX , Tip X ve Tip XI kollagen : Kıkırdakta bulunduğu bildirilmektedir.

Tip XII kollagen: Dokulardaki dağılım ve fonksiyonları henüz aydınlatılmamıştır

Kollagen iplikler esnek değildir. Mekanik basınç ve çekilmeler etkisiyle uzamaz ve bu tür etkilere karşı büyük direnç gösterir. Buna karşılık eğilip bükülebilme özelliği gösterirler. Kaynatılınca eriyip jelatin denen maddeye dönüşürler.

Retikülin iplikleri: Bu tür bağ dokusu iplikleri Tip III kollagenden yapılmışlardır. İncedirler, 0.5-2 mikron çapındadırlar, yerine göre anastomozlaşarak ağ oluştururlar. Organ duvarlarındaki düz kaslar etrafında, kan yapan organların stromasında, bazal membranlarda bol bulunurlar. Embryogenez sırasında ve yara iyişeşmesi sırasında çoğu bağ dokuları bol miktarda retikulum ipliği içerir, daha sonra

42

bunların yerini Tip I kollagen alır. Retikulum iplikleri gümüş boyaları ile iyi boyandıkları için arjirofil iplikleri (gümüş seven iplikler) adını da alırlar.

Elastik iplikler: Organizmada en az bulunan bağ doku ipliği türüdür. Elastik iplikler ; elastic lif sisteminin ( oksitalan + elaunin + elastic) en yaygın bileşenidir.

Elastik kıkırdak, bazı ligamentler, elastik arterler ve akciğerlerde bol bulunurlar.

Genelde 1-4 mikron çapındadırlar. Birbirleriyle anastomozlaşarak ağlar veya membranlar yapabilirler. Ayrıca dallanmadan birbirine paralel demetler oluşturabilirler (ligamentlerde). İleri derecede uzayabilirler. Elastik iplikler elastin adı verilen proteinden yapılmışlardır. Elastin'in öncüsü olan proelastin büyük ölçüde fibroblastlar, ikinci derecede ise düz kas hücreleri tarafından sentezlenir ve salgılanırlar. Bu madde hüceden dışarı verilince polimerize olur ve iplik şeklini alır.

Elastik liflerin sentezi: Elastik lifler fibroblastlar (deri ve tendonlarda), kondroblastlar ( kulak kepçesi, epiglottis, larinks, solunum yollarında) ve düz kas hücreleri ( aorta ve büyük damarlarda) tarafından sentezlenir.

Elastik lif sistemi’nin yapıları peşpeşe üç evrede gerçekleşir:

Birinci evrede; fibrilin adı verilen büyük moleküllü madde başta olmak üzere çeşitli glikoproteinlerin oluşturduğu 10 nm lik mikrolifcik demetlerinden oksitalan lifleri ortaya çıkar. Oksitalan lifler gözün zonula liflerinde ve dermiste elastic sistemi bazal laminaya bağladığı bölgede bulunur. Oksitalan lifler elastic değildir, çekmelere karşı dirençlidir.

İkinci evrede; Oksitalan mikro lifcikleri arasına elastin adlı protein düzensiz olarak birikerek elaunin lifleri’ni oluşturur. Bunlar dermisteki ter bezlerinin çevresinde bulunur.

Üçüncü aşamada ; elaunin lifleri etrafına elastin proteininin lifin ortasını iyice dolduruncaya kadar birikmesiyle elastik lifler ortaya çıkar.

Elastin ön maddesi olan proelastin küre biçimli (70 kDa) bir moleküldür. Elastik liflerin yapısına glisin ve prolin amino asitleri bolca girer, ayrıca iki önemli amino asit dezmozin ve izodezmozin de içerir. Bu amino asitler (dezmozin ve izodezmozin) olgun elastic liflerin çapraz bağlanmalarını, lastik bandlar gibi gerilmelerini ve geri

43

çekilmelerini mümkün kılar. Yapıya daha az oranda iştirak eden diğer amino asitlerde vardır. Bu maddeler poliribozom, gER ve Golgi üçgeninde ; proelastin → tropoelastin

→ elastin olarak sentezlenir. Golgi’den ayrılarak matrikse geçen elastin polymerize olarak elastic iplikciklere dönüşür.

Tip I kollajenin prekürsör proteini olarak sentezlenir ve ve organik matriksin % 90'dan fazlasını oluşturur. N ve C terminalde heliks olmayıp kısmen globüler bölgeler içermektedir. Prokollajenin uç bölümleri (PINP ve PICP), prokollajenler hücreden serbestleştikten sonra spesifik peptidazlar tarafından kırılır. PICP ve PINP matriksin yapısına katılmayıp, extrasellüler matrikse verilmektedir (164,165,166,167). Her bir polipeptit zincirinin sentezi, her iki ucunda N(amino) ve C (karboksil) terminal ekstansiyon propeptitleri bulunan tip I prokollajen propeptiti olarak başlar. Sonra bir dizi hücre içi ve hücre dışı post-translasyonel işlem gerçekleşir ve kemik dokunun yapısına giren matür kollajen sentezlenir. Plazma total ALP aktivitesi ile serum PICP konsantrasyonu arasında iyi bir korelasyon olduğu gözlenmiştir. Ayrıca doku düzeyinde histomorfometri ile yapılan çalışmalarda serum PICP ve kemik yapımı arasında da iyi bir korelasyon saptanmıştır (168).

Propeptid prokollajen tip-1, kollajen biyosentezinin serum biyomarkeridir.

Propeptid kollajen tip-1’in serum düzeyi ile kalp hastalarında kardiyak biyopside belirlenen fibroz doku volumu arasında pozitif korelasyon vardır.

ŞEKİL 8 : Tip I Prokollajenden Kollajen Oluşumu Ve Amino (N) Ve Karboksi (C) Terminal Propeptitlerin Şematik Görünümü

44

3. GEREÇ VE YÖNTEM

3.1.Gereç

Bu çalışmaya Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Kalp ve Damar Cerrahisi Anabilim Dalında Şubat 2011 ve Ocak 2013 tarihleri arasında konjenital kalp hastalığı nedeniyle kardiyopulmoner bypass (KPB) yardımıyla ameliyat edilen 40 hasta alındı.

Hastaların yaşları 6 ay ile 16 yaş(ortalama 59 aylık) arasında değişmekteydi. Hastalar araştırma ve kontrol grubu olarak 2 gruba ayrıldı. Araştırma grubu sağ ventrikül çıkım yolu darlığı olan 20 hastadan oluştu. Kontrol grubu sağ ventrikül çıkım yolu problemi olmayan konjenital kalp hastaları arasından seçildi. Kontrol gubundaki 20 hastanın tanıları 13 VSD , 7 ASD ‘dir. Kontrol grubundaki hiç bir hastada PS yoktur. Kontrol grubundaki hastaların hepsine sağ atriyotomi ile yaklaşılmış, hiçbir hastaya ventrikülotomi yapılmamıştır. Araştırma grubunda ise 3 hasta ASD + PS , 8 hasta VSD + PS , 1 hasta DORV + PS ve 8 hasta Fallot tetralojisidir. Araştırma grubundaki hastaların hepsine ventrikülotomi ile yaklaşılmış ve hepsinde sağ ventrikül çıkım yolu darlığına müdahale edilmiştir. 15 hastada transanuler yama ile ventrikül kapatılmış 5 hastada ise transanuler yama ihtiyacı olmamıştır. Bu 5 hastada pulmoner kapağa müdahale komisürotomi ile sınırlı kalmıştır.

3.2. Yöntem

Araştırma ve kontrol grubundaki hastaların hepsi operasyon öncesi dönemde kliniğimize yatırılarak anestezi onamları ve beraberinde operasyon hazırlıkları yapıldı.

Operasyondan 24 saat önce ilk arteryal kan örnekleri antikoagülansız tüpe alınarak hastanemiz merkezi laboratuvarına yollandı. Laboratuvarda, oda sıcaklığında yarım saat bekletilen kanlar 4000 rpm de 10 dakika santrifüj edildikten sonra serumları ayrıldı.

Derin dondurucuda -40 °C’ de saklandı.

Cerrahi teknik: operasyona alınan tüm hastalara genel anestezi altında sternotomi yapıldı. Aort ve bikaval kanulasyon yapıldıktan sonra kross klemp konularak kardiyopleji verildi. Kardiyak arrest sağlandıktan sonra kontrol grubundaki hastalara interatriyal yolla yaklaşılarak mevcut kardiyak defektleri yama ile yada primer olarak onarıldı. Araştırma grubundaki hastalara ayrıca ventrikülotomi yapılarak önce

45

infindibular kas rezeksiyonları beraberinde gerekli hallerde pulmoner kapak kommisürotomi yapıldı. Yaşa uygun bujilerle çıkım yolu değerlendirilen hastalardan gerekli görülenlere transanuler yama ile çıkım yolu rekonstrüksiyonu tamamlandı.

Pompa sonrası sağ ventrikül ile pulmoner arter üzerinden basınçlar alınarak gradiyent varlığı değerlendirildi. 15 mmhg üzeri gradiyent farkı varlığında çıkım yolu rekonstrüksiyonu yeniden gözden geçirildi. Perop bakılan EKO kontrollerinde sağ ventrikül ve sol ventrikül arası basınç farkları değerlendirildi. 0.6 üzeri basınç ölçümlerinde 15 dk beklenerek yeniden ölçüm yapıldı. Cerrahisi tamamlanan hastaların sternumu kapatılarak postop. Bakım ünitesinde takibe alındı. Operasyondan sonraki 24-48. Saat yeniden arteryal kan örnekleri alınarak laboratuvara yollandı.

Operasyon sonrası 6.ay alınan arteryel kan örnekleri de laboratuvara yollanarak aynı işlemlere tabi tutuldu. Tüm hastalardan örnek alımları tamamlanınca serumlar eliza yöntemi ile değerlendirildi. Serum örneklerinden Prokollajen tip 1(PINP) (pg/ml) , MMP 2 (pg/ml) ve MMP 9 (ng/ml) düzeyleri ölçüldü.

3.2.1 Matriks Metalloproteinaz-2 Düzeylerinin Ölçümü

Serum matriks metalloproteinaz-2 düzeylerinin belirlenmesinde yarışmalı ELISA yöntemi (TheRayBio Human MMP-2 ELISA; Kat No: ELH-MMP2-001) uygulandı.

Prensip: Serum örnekleri MMP-2 antikorları ile kaplı kuyucuklara eklenir. Bu antikorlara bağlanan serumdaki MMP-2 enziminin üzerine biotinlenmiş anti-human MMP-2 antikorları ilave edilir. Oluşan bu komplekse HRP-konjuge streptavidin eklenir.

Kompleks tetrametilbenzidin (TMB) substratı ile oluşan rengin şiddeti MMP-2 düzeyini yansıtır.

Kiti Olusturan Unsurlar

1. MMP-2 Mikroplate; anti-human MMP-2 kaplı 8’er kuyucuklu 12 strip 2. Konsantre yıkama solüsyonu (20x), 25 mL

3. Standart: 2 vial rekombinant human MMP-2

4. Ölçüm sulandırma tamponu: 5x Konsantre tampondan 15 mL 5. Ölçülecek MMP-2 antikor: 2 vial; biotinlenmiş anti human MMP-2 6. HRP-streptavidin: Konsantre: (22.000x; 8 µl)

7. Substrat solüsyonu - TMB (tetramethyl benzidine), 12 mL 8. Yıkama solüsyonu (2 M sülfirik asitten 8 mL)

46

İşlem:

1. Tüm çözeltiler, serum örnekleri ve okutulacak standartlar hazırlanır.

2. Her kuyucuğa 100 µl standart veya serumlar konur.

3. Plate 2,5 saat oda temparatüründe veya +4 ºC’de bir gece inkübasyona bırakılır.

4. Her kuyucuğa hazırlanmış biotin antikorundan 100 µl eklenir.

5. Hazırlanmış streptavidin solüsyonundan 100 µl eklenir ve oda temparatüründe 45 dakika inkübe edilir.

6. Her kuyucuğa 100 µl substrat solüsyonu TMB eklenir ve 30 dakika oda temparatüründe inkübe edilir.

7. Çalışma yapılan her kuyucuğa 50 µl stop solüsyonu eklenip iyice karıştırılarak enzimatik reaksiyon durdurulur ve 10 dakika içerisinde absorbansları 450nm’de hemen okunur.

Hesap: Serum örnekleri, seri dilüsyonla hazırlanan standartlar ve sıfır standardının optik dansitesi µ quant mikroplate ELISA cihazında 450 nm’de okundu. MMP-2 konsantrasyonları ELISA cihazının KC4 software programı kullanılarak hesaplandı.

3.2.2 Matriks Metalloproteinaz-9 Düzeylerinin Ölçümü

Serum matriks metalloproteinaz-9 düzeylerinin belirlenmesinde yarışmalı ELISA yöntemi (TheRayBio Human MMP-9 ELISA; Kat No: ELH-MMP9-001) uygulandı.

Prensip: Serum örnekleri MMP-9 antikorları ile kaplı kuyucuklara eklenir. Bu antikorlara bağlanan serumdaki MMP-9 enziminin üzerine biotinlenmiş anti-human MMP-9 antikorları ilave edilir. Oluşan bu komplekse HRP-konjuge streptavidin eklenir.

Kompleks tetrametilbenzidin (TMB) substratı ile oluşan rengin şiddeti MMP-9 düzeyini yansıtır.

Kiti Olusturan Unsurlar

1. MMP-9 Mikroplate; anti-human MMP-9 kaplı 8’er kuyucuklu 12 strip 2. Konsantre yıkama solüsyonu (20x), 25 mL

3. Standart: 2 vial rekombinant human MMP-9

3. Standart: 2 vial rekombinant human MMP-9