3.1.Gereç
Bu çalışmaya Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Kalp ve Damar Cerrahisi Anabilim Dalında Şubat 2011 ve Ocak 2013 tarihleri arasında konjenital kalp hastalığı nedeniyle kardiyopulmoner bypass (KPB) yardımıyla ameliyat edilen 40 hasta alındı.
Hastaların yaşları 6 ay ile 16 yaş(ortalama 59 aylık) arasında değişmekteydi. Hastalar araştırma ve kontrol grubu olarak 2 gruba ayrıldı. Araştırma grubu sağ ventrikül çıkım yolu darlığı olan 20 hastadan oluştu. Kontrol grubu sağ ventrikül çıkım yolu problemi olmayan konjenital kalp hastaları arasından seçildi. Kontrol gubundaki 20 hastanın tanıları 13 VSD , 7 ASD ‘dir. Kontrol grubundaki hiç bir hastada PS yoktur. Kontrol grubundaki hastaların hepsine sağ atriyotomi ile yaklaşılmış, hiçbir hastaya ventrikülotomi yapılmamıştır. Araştırma grubunda ise 3 hasta ASD + PS , 8 hasta VSD + PS , 1 hasta DORV + PS ve 8 hasta Fallot tetralojisidir. Araştırma grubundaki hastaların hepsine ventrikülotomi ile yaklaşılmış ve hepsinde sağ ventrikül çıkım yolu darlığına müdahale edilmiştir. 15 hastada transanuler yama ile ventrikül kapatılmış 5 hastada ise transanuler yama ihtiyacı olmamıştır. Bu 5 hastada pulmoner kapağa müdahale komisürotomi ile sınırlı kalmıştır.
3.2. Yöntem
Araştırma ve kontrol grubundaki hastaların hepsi operasyon öncesi dönemde kliniğimize yatırılarak anestezi onamları ve beraberinde operasyon hazırlıkları yapıldı.
Operasyondan 24 saat önce ilk arteryal kan örnekleri antikoagülansız tüpe alınarak hastanemiz merkezi laboratuvarına yollandı. Laboratuvarda, oda sıcaklığında yarım saat bekletilen kanlar 4000 rpm de 10 dakika santrifüj edildikten sonra serumları ayrıldı.
Derin dondurucuda -40 °C de saklandı.
Cerrahi teknik: operasyona alınan tüm hastalara genel anestezi altında sternotomi yapıldı. Aort ve bikaval kanulasyon yapıldıktan sonra kross klemp konularak kardiyopleji verildi. Kardiyak arrest sağlandıktan sonra kontrol grubundaki hastalara interatriyal yolla yaklaşılarak mevcut kardiyak defektleri yama ile yada primer olarak onarıldı. Araştırma grubundaki hastalara ayrıca ventrikülotomi yapılarak önce
45
infindibular kas rezeksiyonları beraberinde gerekli hallerde pulmoner kapak kommisürotomi yapıldı. Yaşa uygun bujilerle çıkım yolu değerlendirilen hastalardan gerekli görülenlere transanuler yama ile çıkım yolu rekonstrüksiyonu tamamlandı.
Pompa sonrası sağ ventrikül ile pulmoner arter üzerinden basınçlar alınarak gradiyent varlığı değerlendirildi. 15 mmhg üzeri gradiyent farkı varlığında çıkım yolu rekonstrüksiyonu yeniden gözden geçirildi. Perop bakılan EKO kontrollerinde sağ ventrikül ve sol ventrikül arası basınç farkları değerlendirildi. 0.6 üzeri basınç ölçümlerinde 15 dk beklenerek yeniden ölçüm yapıldı. Cerrahisi tamamlanan hastaların sternumu kapatılarak postop. Bakım ünitesinde takibe alındı. Operasyondan sonraki 24-48. Saat yeniden arteryal kan örnekleri alınarak laboratuvara yollandı.
Operasyon sonrası 6.ay alınan arteryel kan örnekleri de laboratuvara yollanarak aynı işlemlere tabi tutuldu. Tüm hastalardan örnek alımları tamamlanınca serumlar eliza yöntemi ile değerlendirildi. Serum örneklerinden Prokollajen tip 1(PINP) (pg/ml) , MMP 2 (pg/ml) ve MMP 9 (ng/ml) düzeyleri ölçüldü.
3.2.1 Matriks Metalloproteinaz-2 Düzeylerinin Ölçümü
Serum matriks metalloproteinaz-2 düzeylerinin belirlenmesinde yarışmalı ELISA yöntemi (TheRayBio Human MMP-2 ELISA; Kat No: ELH-MMP2-001) uygulandı.
Prensip: Serum örnekleri MMP-2 antikorları ile kaplı kuyucuklara eklenir. Bu antikorlara bağlanan serumdaki MMP-2 enziminin üzerine biotinlenmiş anti-human MMP-2 antikorları ilave edilir. Oluşan bu komplekse HRP-konjuge streptavidin eklenir.
Kompleks tetrametilbenzidin (TMB) substratı ile oluşan rengin şiddeti MMP-2 düzeyini yansıtır.
Kiti Olusturan Unsurlar
1. MMP-2 Mikroplate; anti-human MMP-2 kaplı 8er kuyucuklu 12 strip 2. Konsantre yıkama solüsyonu (20x), 25 mL
3. Standart: 2 vial rekombinant human MMP-2
4. Ölçüm sulandırma tamponu: 5x Konsantre tampondan 15 mL 5. Ölçülecek MMP-2 antikor: 2 vial; biotinlenmiş anti human MMP-2 6. HRP-streptavidin: Konsantre: (22.000x; 8 µl)
7. Substrat solüsyonu - TMB (tetramethyl benzidine), 12 mL 8. Yıkama solüsyonu (2 M sülfirik asitten 8 mL)
46
İşlem:
1. Tüm çözeltiler, serum örnekleri ve okutulacak standartlar hazırlanır.
2. Her kuyucuğa 100 µl standart veya serumlar konur.
3. Plate 2,5 saat oda temparatüründe veya +4 ºCde bir gece inkübasyona bırakılır.
4. Her kuyucuğa hazırlanmış biotin antikorundan 100 µl eklenir.
5. Hazırlanmış streptavidin solüsyonundan 100 µl eklenir ve oda temparatüründe 45 dakika inkübe edilir.
6. Her kuyucuğa 100 µl substrat solüsyonu TMB eklenir ve 30 dakika oda temparatüründe inkübe edilir.
7. Çalışma yapılan her kuyucuğa 50 µl stop solüsyonu eklenip iyice karıştırılarak enzimatik reaksiyon durdurulur ve 10 dakika içerisinde absorbansları 450nmde hemen okunur.
Hesap: Serum örnekleri, seri dilüsyonla hazırlanan standartlar ve sıfır standardının optik dansitesi µ quant mikroplate ELISA cihazında 450 nmde okundu. MMP-2 konsantrasyonları ELISA cihazının KC4 software programı kullanılarak hesaplandı.
3.2.2 Matriks Metalloproteinaz-9 Düzeylerinin Ölçümü
Serum matriks metalloproteinaz-9 düzeylerinin belirlenmesinde yarışmalı ELISA yöntemi (TheRayBio Human MMP-9 ELISA; Kat No: ELH-MMP9-001) uygulandı.
Prensip: Serum örnekleri MMP-9 antikorları ile kaplı kuyucuklara eklenir. Bu antikorlara bağlanan serumdaki MMP-9 enziminin üzerine biotinlenmiş anti-human MMP-9 antikorları ilave edilir. Oluşan bu komplekse HRP-konjuge streptavidin eklenir.
Kompleks tetrametilbenzidin (TMB) substratı ile oluşan rengin şiddeti MMP-9 düzeyini yansıtır.
Kiti Olusturan Unsurlar
1. MMP-9 Mikroplate; anti-human MMP-9 kaplı 8er kuyucuklu 12 strip 2. Konsantre yıkama solüsyonu (20x), 25 mL
3. Standart: 2 vial rekombinant human MMP-9
4. Ölçüm sulandırma tamponu: 5x Konsantre tampondan 15 mL 5. Ölçülecek MMP-9 antikor: 2 vial; biotinlenmiş anti human MMP-9 6. HRP-streptavidin: Konsantre: (20.000x; 8 µl)
47
7. Substrat solüsyonu - TMB (tetramethyl benzidine), 12 mL 8. Yıkama solüsyonu (2 M sülfirik asitten 8 mL)
İşlem:
1. Tüm çözeltiler, serum örnekleri ve okutulacak standartlar hazırlanır.
2. Her kuyucuğa 100 µl standart veya serumlar konur.
3. Plate 2,5 saat oda temparatüründe veya +4 ºCde bir gece inkübasyona bırakılır.
4. Her kuyucuğa hazırlanmış biotin antikorundan 100 µl eklenir.
5. Hazırlanmış streptavidin solüsyonundan 100 µl eklenir ve oda temparatüründe 45 dakika inkübe edilir.
6. Her kuyucuğa 100 µl substrat solüsyonu TMB eklenir ve 30 dakika oda temparatüründe inkübe edilir.
7. Çalışma yapılan her kuyucuğa 50 µl stop solüsyonu eklenip iyice karıştırılarak enzimatik reaksiyon durdurulur ve 10 dakika içerisinde absorbansları 450nmde hemen okunur.
Hesap: Serum örnekleri, seri dilüsyonla hazırlanan standartlar ve sıfır standardının optik dansitesi µ quant mikroplate ELISA cihazında 450 nmde okundu. MMP-9 konsantrasyonları ELISA cihazının KC4 software programı kullanılarak hesaplandı.
3.2.3 Prokollogen Tip 1 (PINP) Düzeylerinin Ölçümü
Serum Prokollogen Tip 1 (PINP) düzeylerinin belirlenmesinde yarışmalı ELISA yöntemi ( CUSABIO Human Procollagen 1 N -terminal Peptide (PINP) ELISA Kit ) uygulandı.
Prensip: Serum örnekleri PINP antikorları ile kaplı kuyucuklara eklenir. Bu antikorlara bağlanan serumdaki enziminin üzerine biotinlenmiş konjuge PINP antikorları ilave edilir. Oluşan bu komplekse avidin conjugated Horseradish Peroxidase (HRP) eklenir.
Kompleks unbound avidin-enzyme reagent substratı ile oluşan rengin şiddeti PINP düzeyini yansıtır.
Kiti Olusturan Unsurlar
1. PINP Mikroplate; PINP kaplı 8er kuyucuklu 12 strip 2. Konsantre yıkama solüsyonu
3. Standart biotin antibody, HRP-avidin (2 - 8 derecede) 4. Ölçüm sulandırma tamponu
48
5. Biotinlenmiş antibody diluent PINP 6. HRP-avidin diluent
7. Substrat solüsyonu - TMB (tetramethyl benzidine) 8. Yıkama solüsyonu
İşlem:
1. Tüm çözeltiler, serum örnekleri ve okutulacak standartlar hazırlanır.
2. Her kuyucuğa 100 µl standart veya serumlar konur. 2 saat 37 derecede inkübasyona bırakılır.
3. Plazmalar yıkanmadan alınır.
4. Her kuyucuğa hazırlanmış biotin antikorundan 100 µl eklenir.37 derecede 1 saat inkübe edilir.aspire edilerek 3 kez yıkanır.
5. Hazırlanmış HRP – avidin solüsyonundan 100 µl eklenir ve 1 saat 37 derecede inkübe edilir.Aspire edilir ve 5 kez yıkanır
6. Her kuyucuğa 90 µl substrat solüsyonu TMB eklenir ve 15- 30 dk 37 derecede inkübe edilir.
7. Çalışma yapılan her kuyucuğa 50 µl stop solüsyonu eklenip iyice karıştırılarak enzimatik reaksiyon durdurulur ve absorbansları 450nmde 5 dakika içinde okunur.
Hesap: Serum örnekleri, seri dilüsyonla hazırlanan standartlar ve sıfır standardının optik dansitesi µ quant mikroplate ELISA cihazında 450 nmde okundu. PINP konsantrasyonları ELISA cihazının 4 P-L programı kullanılarak hesaplandı.
49