Presentation Abstracts
MATERYAL VE YÖNTEM
Kantaronun ekstresinin elde edilmesi için; Kantaron bitkisinin sarı çiçekleri etüvde 24 saat kurutuldu. Kurutulan bitki %80’lik etil alkol solüsyonu içerisinde ekstre edildikten sonra filtre edildi. Filtreden geçirilen ekstrenin alkolü uçurularak kuru ekstrenin kalması sağlandı.
İnsan kutanöz SHK hücre hatları temin edildikten sonra, %10 Fetal Bovine Serum (FBS) (Hyclone), %1 L-Glutamine (Hyclone), %1 Penisillinstreptomisin (Hyclone), Dulbecco’s modification of Eagle’s medium (DMEM) (GIBCO) besiyerinde yetiştirildi. Hücreler 24’lük standart hücre kültürü platelerinde 1x105 sayısında tek tabaka halinde yetiştirildi. 37oC sıcaklıkta ve %5’lik CO
2’li etüvde
inkübe edildi. Bu hücreler 12, 24, 48 ve 96 saat kantaron (%99,2 kültür medyumu ve %0.8 kantaron ekstresi) ekstresiyle muamele edilip ELISA yöntemiyle protein analizleri için homojenize edildi. Ultrasonic parçalama cihazıyla buz üzerinde dokuların parçalanarak homojenatlar elde edildi. Homojenize edilmiş hücrelerin protein miktar tayini Bradford yöntemi ile yapıldı, spektrofotometrede 595 nanometre dalga boyunda absorbans miktarları manuel olarak ölçüldü. Prism programında çizilen standart eğriye göre protein miktar tayini μg/μl cinsinden yapıldı. Protein miktar tayini Kaspaz-3, bax, bcl-2, wee 1, gadd153, grp78, AIF, iNOS, COX-2, cPLA2, NFkB Protein miktar tayini ELISA testi ile incelendi.
149
www.daahk.org İstatistiksel Analizler
HP ekstresi eklenen SHK hücre hattından elde edilen protein düzeyleri sonuçları HP tedavi grubu olarak belirlendi. HP eklenmeyen SHK hücre hattından elde edilen protein düzeyleri sonuçları ise kontrol grup olarak değerlendirildi. Kontrol ve HP tedavi grubundaki parametrelerin karşılaştırılması için eşleştirilmemiş Student's t testi kullanıldı. Veriler ''ortalama ± standart hata'' olarak sunulmuştur. Farklılıkların istatistiksel olarak p <0,05 ile analizi, anlamlılığın göstergesi olarak alınmıştır.
BULGULAR
HP tedavisi uygulanan SHK hücre kültürü hattı, kontrol grubu ile karşılaştırıldığında. HP tedavisi alan grupta, kontrol grubuna göre apopitotik yolakta görevli olan bax, kaspaz-3, wee1, gadd153, grp78, AIF proteinlerinin arttığı, antiapopitotik protein olan bcl-2 ekspresyonunu azalttığı ve inflamatuvar mediatörlerden olan iNOS, COX-2, cPLA2, NFkB proteinlerin düzeylerini de azalttığı tespit edilmiştir. Tüm bulgular istatistiksel anlamlı bulunmuştur (p<0.05) (tablo 1) (figür 1). Ayrıca HP tedavisinin insan kutanöz SHK hücrelerinin canlılığını azalttığı gözlemlenmiştir.
TARTIŞMA
Nonmelanom deri kanseri olan bazal hücreli karsinom ve skuamöz hücreli karsinom beyaz ırkta en sık rastlanan kanser formları olup, dünya çapında insidansı giderek artış gösteren, topluma oldukça yüklü bir maliyete sebep olan ciddi bir sağlık problemidir. SHK'ların çoğu cerrahi eksizyon ile başarılı bir şekilde yok edilse de, yüksek nüks, metastaz ve ölüm olasılığı bulunan yüksek riske sahip SHK'larda ek olarak cerrahi dışı tedaviler de tercih edilmektedir. Hypericum perforatum (HP) bitkisi biyolojik olarak aktif içeriğe sahiptir ve halk tarafından çeşitli hastalıkların tedavisinde sıkça kullanılmaktadır. HP ekstresi apopitozu etkiler. Apopitotik yolaklar, kemoterapötik direnç ve kanser gelişimi için önemlidir. Ayrıca bazı çalışmalar, anti-enflamatuar ajanların kanser için potansiyel bir hedef olduğunu bildirmiştir. Apopitoz, normal gelişimin bir parçası olarak hücre sayısının ve çoğalmasının kontrol edilmesinde önemli olan çok adımlı bir süreçtir (5). Apopitoz malign tümörlerde spontan olarak oluşur ve tümör büyümesinde azalmaya neden olur (6). Hormon eksikliği, ısı, sitotoksik kemoterapi ve radyasyona bağlı olarak da artış gösterir (7). Bcl-2 ailesi ve
150
www.daahk.org kaspazlar apopitotik yolağın temel mediyatörleridir. Bcl-2 ailesi hem apopitotik hem de anti apopitotik üyelere sahiptir. Bcl-2 protein ailesinde; 1. grupta antiapopitotikler (bcl-2, bcl-xL, bcl-w, mcl1, bfl-1/A1, boo), 2. grupta proapopitotikler (bax, bak, bok, bcl-xs) ve 3. grup olarak bid, bik, bad ve diğerleri bulunmaktadır (8). İntrensek yolak kaspaz-8 ve 10'un aktivasyonu ve ölüm indükleyici sinyal kompleksi oluşumuyla, ekstrensek yolak kaspaz-9 aktivasyonu ve apopitozom kompleksi oluşumuyla, kaspaz-3'ü indüklemektedir. Bu son basamakta kaspaz-3 tipik DNA fragmantasyonuna neden olmaktadır (4). Hücre bax ve bad açısından hasarlı olduğunda apopitoza direnç kazanmaktadır (6).
Hypericin'in tümör hücrelerini hem apopitoz hem de nekroz yoluyla yok ettiği düşünülmektedir. Hypericin'in antitümör etkisi in vivo ve in vitroda melanoma, meme, kolon, glioma, prostat, hipofiz, nazofarenks, özafagus kanserlerinde çalışılıp etki mekanizması araştırılmıştır (1-4). Wee 1 proteini hücre bölünmesinde rol almakta ve apopitotik uyarı ile artış göstererek hücre bölünmesini G2/M fazında durdurmaktadır. Diğer bir protein olan AIF (Apopitoz indükleyici faktör) apopitotik uyarı ile DNA hasarına neden olarak hücreyi apopitoza götürmektedir. Gadd153 proteini ise stress durumlarında endoplazmik retikulumdan salınarak DNA hasarına neden olmaktadır. Grp78 proteini endoplazmik retikulumun lümeninde yer alarak apopitotik uyarı ile miktarı artarak apopitoza katılmaktadır (9).
HP bileşenlerinden olan, apigenin'in birçok insan kanser hücre dizisinde hücre döngüsü durdurduğu ve apopitozun hem intrensek hem de ekstrensek "apopitotik yolaklarını aktive ederek apopitozu indüklediği gösterilmiştir (5,9). Kantaron otunun bileşiminde bulunan epigalaktekin bazı kanser hücrelerinde proapopitotik mediatör olan kaspas-3'ü aktive ettiği gösterilmiştir (10). Kantaronun bileşiminde bulunan diğer bir madde olan hiperforin insan miyeloid kanser hücrelerinde kaspaz-3 aktivasyonu ve bcl-2 protein ekspresyonunun inhibisyonuna neden olarak apopitozisi artırmıştır (11). Ayrıca fare meme kanseri hücrelerinin kantaron ekstresiyle muamalesinin, bu hücrelerin gelişimini durduğu gösterilmiştir (12).
Çalışmamızda HP ekstresinin apopitozu indüklediği, antiapopitotik yolaktaki mediatörlerin seviyesini azalttığı, ayrıca kanserin gelişiminde önemi olan inflamasyonu azalttığı tespit edildi. Bulgularımız
151
www.daahk.org HP ekstresinin insan deri SHK'nın tedavisinde, anti-kanser ve anti-inflamatuvar etkileri ile yer alabileceği ve kemoterapötiklere direnç oluşumunu azaltabileceği yönünde ışık tutmaktadır. TEŞEKKÜR
Hatay Mustafa Kemal Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri (BAP) birimine katkılarından dolayı teşekkür ederiz. (Proje no: 17.M.002)
KAYNAKLAR
1) Hışıl Y, Şahin F, Omay SB. Kantaronun (Hypericum perforatum L.) Bileşimi ve Tıbbi Önemi. UHOD. 2005;4(15). 2) Yılmaz HR, Yücel N, Uz E, Koşar PA. Kantaron Otundan (Hypericum perforatum) Elde Edilen Hyperisin
Maddesinin İnsan Lenfosit Kültürlerinde Kardeş Kromatid Değişimi Üzerine Etkisi. Eur J Basic Med Sci. 2014;4(2): 22-28.
3) Çakmak HE, Bayram E. Muğla Orijinli Sarı Kantaron (Hypericum perforatum L.) Populasyonlarının Bazı Agronomik ve Kalite Özelliklerinin Belirlenmesi. Ege Üniv. Ziraat Fak. Derg., 2003, 40(1):57-64.
4) Yazıcı P, Alizadehshargh S, Akdoğan GG. Apopitoz: Düzenleyici Moleküller, Hastalıklarla İlişkisi ve Apopitozu Saptama Yöntemleri. Turkiye Klinikleri J Med Sci. 2009;29(6):1677-86.
5) Choi EJ, Kim GH. Apigenin Induces Apoptosis through a Mitochondria/Caspase-Pathway in Human Breast Cancer MDA-MB-453 Cells. J Clin Biochem Nutr. 2009 May;44(3):260-5.
6) Heiser D, Labi V, Erlacher M, Villunger A. The Bcl-2 protein family and its role in the development of neoplastic disease. Exp Gerontol 2004;39(8):1125-35.
7) Çıtak EÇ. Apoptosis and cancer. Turkiye Klinikleri J Pediatr 2000;9(3):183-91. 36.
8) Call JA, Eckhardt SG, Camidge DR. Targeted manipulation of apoptosis in cancer treatment. Lancet Oncol 2008;9(10):1002-11.
9) Lu HF, Chie YJ, Yang MS, Lu KW, Fu JJ ve ark. Apigenin induces apoptosis in human lung cancer H460 cells through caspase- and mitochondria-dependent pathways. Hum Exp Toxicol. 2011 Aug;30(8):1053-61.
10) Yun JH, Kim CS, Cho KS, Chai JK, Kim CK, Choi SH. Epigallocatechin gallate induces apoptosis, via caspase activation, in osteoclasts differentiated from RAW 264.7 cells. J Periodontal Res. 2007 Jun;42(3):212-8. 11) Merhi F, Tang R, Piedfer M, Mathieu J, Bombarda I, Zaher M, Kolb JP, Billard C, Bauvois B. Hyperforin inhibits
Akt1 kinase activity and promotes caspase-mediated apoptosis involving Bad and Noxa activation in human myeloid tumor cells. PLoS One. 2011;6(10):e25963. doi: 10.1371/journal.pone.0025963. Epub 2011 Oct 6. 12) Ferguson A, Morris C, Curley J. Hypericum perforatum Extracts and Hypericin Treatment of a Mouse Mammary
Cancer Cell Line Induces Growth Inhibition in a Dose Dependent Manner. The Journal of Experimental Secondary Science. 2012;1(3):14-18.
Tablo 1: Kontrol grubuna kıyasla HP tedavisi eklenen grupta apopitotik proteinlerde istatistiksel olarak anlamlı artış görülmektedir.
Kontrol HP
wee 1 0.28±0.015 pg/ml 0.79±0.05 pg/ml*
152
www.daahk.org gadd153 0.25±0.02 pg/ml 2.5±0.93 pg/ml*
grp78 0.78±0.025 pg/ml 3.8±0.58 pg/ml*
(*: p<0.05).
Keywords: Cutaneous Squamous Cell Carcinoma, St. John\\\'S Worth, Hypericum Perforatum, Apoptosis
153
www.daahk.org Investigating Of Apoptotic Effect Of Propranolol On Human Basal Cell Carcinoma Cell Lines
Ebru Celik, H. Mahir Kaplan, Ergin Singirik
Hatay Mustafa Kemal University, Faculty of Medicine, Department of Dermatology, Antakya, Turkey Cukurova University, Faculty of Medicine, Department of Pharmacology, Adana, Turkey
Abstract
Basal cell carcinoma (BCC) is the most commonly diagnosed skin cancer worldwide. In most patients, BCC can be treated with standard surgical excision, but some patients may not be able to tolerate surgical procedures. Experimental and epidemiological findings have revealed potentially beneficial effects of co-administration of beta-adrenergic receptor antagonists (beta-blockers) during cancer therapy.
If beta-blockers are thought to be safe, cheap and effective drugs, the potentially beneficial effects of these drugs are of great importance. Therefore we planned to investigate kaspase-3, bax and bcl- 2 protein levels and activity in beta blocker treated basal cell cancer cells. For this propose we have done culture of human basal cell carcinoma cells then these cells treated with beta blocker and it was be analyzed kaspase-3, bax, bcl-2, wee 1, gadd153, grp78, and AIF protein levels and activity by ELISA on these cells. Treatment of propranolol increased of proapoptotic proteins (kaspase-3, bcl- 2, wee 1, gadd153, grp78 and AIF) and decreased antiapoptotic protein (bcl-2).
In conclusion our study showed that propranolol has apoptotic effect on human basal cell carcinoma cell lines. In the light of this findings study propranolol will help to inhibit skin basal cell cancer development.
Key Words: Beta blocker, propranolol, human basal cell carcinoma cell lines, skin cancer, apoptotic effect INTRODUCTION O ra l P re sent ati o n - 1 3 9
154
www.daahk.org Skin cancers are a widespread, serious of health problems that are causing a massive burden. Non- melanoma skin cancers, such as basal cell carcinoma and squamous cell carcinoma are the most common malignancies in the United States and approximately 3.5 million new cases are detected annually and the incidence is increasing steadily. Skin cancers both cause financial burden and lead to loss of power in the treatment phase [1,2]. Previous studies have demonstrated the potentially beneficial effects of co-administration of beta-adrenergic receptor antagonists (beta-blockers) during cancer therapy[3].
It has been reported that these neurotransmitters are an important effect on the growth of secondary tumors[4-6], For this reason, propranolol has a curiosity for the effect of skin cancer cells on apoptosis pathway. For this purpose, human basal cell carcinoma cell lines are taken in cell culture and effects of propranolol on apoptosis mediators in these cells were investigated.
MATERIALS AND METHODS